王桂芳 龍紅梅 龔喜樂緣 胡淑芳 龔燦

干眼是由于淚液的量或質(zhì)以及流體動(dòng)力學(xué)異常引起的淚膜不穩(wěn)定和(或)眼表?yè)p害，從而導(dǎo)致眼部產(chǎn)生不適癥狀及視功能障礙的一類疾病[1]。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞通過旁分泌方式釋放多種生物活性因子，發(fā)揮抗炎及損傷修復(fù)的作用[2-3]。外泌體是脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌發(fā)揮作用的一種重要介質(zhì)。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(ADSC-Exos)具有與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞類似的抗炎和損傷修復(fù)作用。目前，ADSC-Exos已被應(yīng)用于視網(wǎng)膜激光損傷[4]、青光眼[5]、角膜炎[6]等眼部疾病的治療。然而，當(dāng)前有關(guān)ADSC-Exos在干眼中的作用及機(jī)制研究較少。本研究以苯扎氯胺誘導(dǎo)的干眼小鼠為研究對(duì)象，觀察ADSC-Exos對(duì)小鼠干眼的療效，并進(jìn)一步探討ADSC-Exos治療干眼的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和干細(xì)胞完全培養(yǎng)基(廣州賽業(yè)生物科技有限公司)，雄性C57BL/6J小鼠(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，1 g·L-1普拉洛芬滴眼液(日本參天制藥株式會(huì)社)，BioLegend LEGENDplexTM多因子檢測(cè)試劑盒(BioLegend公司)，苯扎氯銨(美國(guó)Sigma公司)，熒光素鈉注射液(廣州白云山明興制藥有限公司)，酚紅棉線(日本Yokota公司)，CD9、CD63、CD81、Myd88、Toll樣受體4(TLR4)和 GAPDH抗體(美國(guó)Abcam公司)；超速離心機(jī)(德國(guó)Beckman公司)，馬爾文納米粒跟蹤分析儀(英國(guó)Nanosight NS300公司)，單顆粒冷凍透射電鏡(美國(guó)Talos Arctic G2公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD Accuri C6公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)用干細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，將小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 ADSC-Exos鑒定將培養(yǎng)基上清液依次按照300 r·min-1離心10 min，2000 r·min-1離心20 min和10 000 r·min-1離心30 min，最后利用超速離心機(jī)在100 000 r·min-1條件下離心60 min，所得沉淀加入200 μL磷酸鹽緩沖液。利用Western blot檢測(cè)外泌體的特異性標(biāo)志蛋白CD9、CD63和CD81。參考Bachurski等[7]的方法，利用馬爾文納米粒跟蹤分析儀和相應(yīng)軟件檢測(cè)并分析外泌體的粒徑大小。利用單顆粒冷凍透射電鏡在80 kV條件下拍攝ADSC-Exos電鏡照片。

1.2.3 小鼠干眼模型的建立及分組將雄性C57BL/6J小鼠(6～8周齡，體重22～24 g)放于22 ℃±2 ℃、空氣相對(duì)濕度40%～ 60%的條件下飼養(yǎng)，房間保持12 h晝夜節(jié)律，小鼠可自由獲取水和食物。實(shí)驗(yàn)中的所有操作均遵循廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)指導(dǎo)原則。取36只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型組，低、中、高劑量外泌體組和普拉洛芬組，每組6只。除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠雙眼結(jié)膜囊內(nèi)滴入5 μL 2 g·L-1苯扎氯銨溶液，每天2次，連續(xù)滴眼14 d，制作中重度干眼模型。造模結(jié)束后，模型組小鼠結(jié)膜囊滴5 μL磷酸鹽緩沖液，低、中、高劑量外泌體組分別滴12.5 g·L-1、25.0 g·L-1和50.0 g·L-1ADSC-Exos，普拉洛芬組滴相同體積的1 g·L-1普拉洛芬滴眼液，均為每天3次，連續(xù)滴眼7 d。

1.2.4 干眼各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)角膜熒光素染色評(píng)分：將10 g·L-1熒光素鈉溶液滴入小鼠結(jié)膜囊中，使其瞬目，在裂隙燈顯微鏡下利用鈷藍(lán)光拍照，根據(jù)2017年國(guó)際干眼工作組第二次會(huì)議的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(分為4個(gè)區(qū)域，評(píng)分范圍為0分到4分)[8]對(duì)角膜上皮損害分級(jí)進(jìn)行評(píng)分。淚液分泌試驗(yàn)：將酚紅棉線置于小鼠下方結(jié)膜囊15 s，然后取出棉線并測(cè)量酚紅棉線濕潤(rùn)長(zhǎng)度，每眼重復(fù)測(cè)量3次，取平均值作為最后結(jié)果。淚膜破裂時(shí)間：將10 g·L-1熒光素鈉溶液滴入結(jié)膜囊中，待小鼠瞬目后保持睜眼狀態(tài)，測(cè)量小鼠淚膜表面出現(xiàn)第一個(gè)干燥斑的時(shí)間間隔，每眼重復(fù)測(cè)量3次，取平均值作為最后結(jié)果。

1.2.5 流式細(xì)胞儀測(cè)量白細(xì)胞介素-1α、γ-干擾素和腫瘤壞死因子-α含量在小鼠結(jié)膜組織中加入5倍組織體積的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，在4 ℃條件下12 000 r·min-1離心5 min，收集上清。按照Biolegend LEGENDplexTM試劑盒說明書，利用流式細(xì)胞儀測(cè)量各組小鼠結(jié)膜組織中白細(xì)胞介素(IL)-1α、γ-干擾素(IFN)和腫瘤壞死因子(TNF)-α含量。

1.2.6 Western blot檢測(cè)Myd88和TLR4 蛋白的表達(dá)將RIPA裂解液加入到提取的外泌體或結(jié)膜組織中，冰上裂解30 min，然后在4 ℃條件下12 000 r·min-1離心30 min，取上清液用Pierce BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量。制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，加入目的蛋白進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜，用50 g·L-1奶粉封閉2 h后，分別加入一抗CD9、CD63、CD81、Myd88、TLR4和GAPDH，4 ℃條件下孵育過夜，TBST清洗后加入二抗，室溫孵育和洗滌后，加入ECL顯影液，采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光顯影并利用該凝膠圖像處理系統(tǒng)分析其灰度值。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Myd88 mRNA和TLR4 mRNA的表達(dá)利用Trizol提取各組小鼠角膜和結(jié)膜組織總的RNA，加入逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反向轉(zhuǎn)錄，使用Mx 3005P和SYBR Green Supermix檢測(cè)各組樣品Myd88 mRNA和TLR4 mRNA表達(dá)情況。所用引物由廣州艾基生物有限公司合成，Myd88正向引物序列為5’- TGTTCTTGAACCCTCGGACG -3’，反向引物序列為5’- TTCTGGCAGTCCTCCTCGAT-3’；TLR4正向引物序列為5’- TCCCTGCATAGAGGTAGTTCC -3’，反向引物序列為5’- TCAAGGGGTTGAAGCTCAGA -3’；18 sRNA正向引物序列為5’- GTAACCCGTTGAACCCCATT -3’，反向引物序列為5’- CCATCCAATCGGTAGTAGCG -3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同組間比較采用單因素方差分析和Dunnett多重比較，雙因素方差分析采用Sidak或Tukey多重比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ADSC-Exos的鑒定Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，ADSC-Exos表達(dá)特異性標(biāo)志蛋白CD9、CD63和CD81；納米粒跟蹤分析結(jié)果顯示，ADSC-Exos的粒徑分布峰在134 nm；透射電鏡結(jié)果顯示，ADSC-Exos呈茶托樣雙層膜結(jié)構(gòu)。

2.2 各組小鼠角膜熒光素染色及干眼各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果治療后第7天，模型組小鼠角膜仍可見大片熒光素著染，高劑量外泌體組和普拉洛芬組小鼠角膜僅見少量點(diǎn)狀熒光素著染(圖1)。與正常對(duì)照組相比，治療后第4天和第7天，模型組小鼠角膜熒光素染色評(píng)分均明顯增加，酚紅棉線濕潤(rùn)長(zhǎng)度和淚膜破裂時(shí)間均明顯縮短(均為P<0.01)。與模型組相比，治療后第4天，高劑量外泌體組和普拉洛芬組小鼠角膜熒光素染色評(píng)分均明顯降低(均為P<0.05)，酚紅棉線濕潤(rùn)長(zhǎng)度均明顯增加(均為P<0.01)，淚膜破裂時(shí)間延長(zhǎng)，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。與模型組相比，治療后第7天，中、高劑量外泌體組和普拉洛芬組小鼠角膜熒光素染色評(píng)分均顯著降低(均為P<0.05)，酚紅棉線濕潤(rùn)長(zhǎng)度均明顯增加(均為P<0.01)；高劑量外泌體組和普拉洛芬組小鼠淚膜破裂時(shí)間均明顯延長(zhǎng)(均為P<0.01)(圖2)。

圖1 各組小鼠角膜熒光素染色情況

圖2 治療后不同時(shí)間各組小鼠角膜熒光素染色評(píng)分、酚紅棉線濕潤(rùn)長(zhǎng)度和淚膜破裂時(shí)間 與正常對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05、##P<0.01。

2.3 各組小鼠結(jié)膜組織中IL-1α、γ-IFN和TNF-α含量與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠結(jié)膜組織中IL-1α、γ-IFN和TNF-α含量均明顯增加(均為P<0.05)。治療后第7天，與模型組相比，高劑量外泌體組和普拉洛芬組小鼠結(jié)膜組織中IL-1α、γ-IFN和TNF-α含量均明顯下降(均為P<0.05)(表1)。

表1 治療后第7天各組小鼠結(jié)膜組織中IL-1α、γ-IFN 和TNF-α含量

2.4 各組小鼠結(jié)膜組織中Myd88和TLR4 蛋白和mRNA的表達(dá)情況與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠結(jié)膜組織中Myd88和TLR4的蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著增加(均為P<0.05)。與模型組相比，治療后第7天，高劑量外泌體組和普拉洛芬組小鼠結(jié)膜組織中Myd88和TLR4的蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(均為P<0.05)；Myd88蛋白相對(duì)表達(dá)量下降至77.21±4.52和92.15±2.75，TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)量下降至67.88±8.50和107.61±3.75(圖3)。與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠結(jié)膜組織中Myd88 mRNA和TLR4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均明顯增加(均為P<0.05)；與模型組相比，治療后第7天，高劑量外泌體組和普拉洛芬組小鼠結(jié)膜組織中Myd88 mRNA 和TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(均為P<0.05)(表2)。

圖3 治療后第7天各組小鼠結(jié)膜組織中Myd88和TLR4蛋白表達(dá)情況

表2 治療后第7天各組小鼠結(jié)膜組織中Myd88 mRNA和TLR4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

干眼是一種與眼表炎癥相關(guān)的多因素疾病。目前對(duì)干眼治療以補(bǔ)充人工淚液和局部抗炎為主，這些藥物可以緩解部分患者的癥狀，但效果難以維持。對(duì)于一些重度干眼患者，常規(guī)治療效果差。因此，尋找治療干眼的新方法具有重要的臨床意義。

外泌體是一種新的正在被探索的干眼治療方法[9-10]。外泌體含有大量mRNAs、microRNAs以及多種功能性蛋白等生物活性物質(zhì)，參與體內(nèi)細(xì)胞間通訊、細(xì)胞遷移、分化和免疫調(diào)節(jié)等多種病理生理過程[11]。本研究我們采用超速離心法獲取到較高純度的ADSC-Exos，進(jìn)一步探討了ADSC-Exos作用于干眼的療效及分子機(jī)制。

苯扎氯銨誘導(dǎo)的小鼠干眼模型可以出現(xiàn)類似人類干眼的眼表變化特征[12-13]。本次我們采用2 g·L-1苯扎氯銨成功誘導(dǎo)到小鼠干眼模型，接著局部滴用不同濃度的ADSC-Exos觀察其對(duì)小鼠干眼的療效，結(jié)果表明，ADSC-Exos可明顯促進(jìn)干眼小鼠角膜上皮的修復(fù)、增加淚液分泌量并可保持淚膜穩(wěn)定性，其最佳作用濃度為50.0 g·L-1。李娟等[14]研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體能使干眼小鼠角膜熒光素染色評(píng)分降低，淚液分泌量增加，淚膜破裂時(shí)間延長(zhǎng)。Rui等[15]研究發(fā)現(xiàn)，嗅外胚間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體通過增強(qiáng)髓源性抑制細(xì)胞的免疫抑制功能來緩解小鼠Sj?gren綜合征的發(fā)展。這些研究結(jié)論與本研究相一致。

炎癥是干眼發(fā)生發(fā)展的核心機(jī)制之一。眼表炎癥與淚液滲透壓升高具有顯著相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，干眼患者淚液、結(jié)膜組織和血液中炎癥相關(guān)因子IL-1α、γ-IFN和TNF-α表達(dá)增加[16-18]。本次我們也同樣發(fā)現(xiàn)，苯扎氯銨誘導(dǎo)的小鼠干眼結(jié)膜組織中IL-1α、γ-IFN和TNF-α的含量明顯增加，而50.0 g·L-1ADSC-Exos局部滴用后可明顯降低IL-1α、γ-IFN和TNF-α的含量，與普拉洛芬滴眼液的效果相似。IL-1α、γ-IFN和TNF-α是眼表上皮細(xì)胞在高滲應(yīng)激下分泌的促炎因子，其表達(dá)下調(diào)可減輕眼表上皮的損傷[19-20]。

TLR4是一種模式識(shí)別受體，在角膜和結(jié)膜組織中廣泛表達(dá)。淚液高滲狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致眼表出現(xiàn)慢性炎癥，眼表上皮的固有免疫反應(yīng)激活TLR4，導(dǎo)致炎癥因子和趨化因子釋放[21]。Redfern等[22]發(fā)現(xiàn)，高滲應(yīng)激培養(yǎng)下的原代人角膜上皮細(xì)胞和結(jié)膜上皮細(xì)胞中TLR4蛋白和mRNA的表達(dá)都明顯上調(diào)。實(shí)驗(yàn)性干眼小鼠的角膜、結(jié)膜和淚腺組織中TLR4蛋白和mRNA的表達(dá)也都顯著增加[23]。這些數(shù)據(jù)表明TLR4在干眼發(fā)展中具有重要作用。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在苯扎氯銨誘導(dǎo)的干眼小鼠結(jié)膜組織中，TLR4信號(hào)通路相關(guān)分子Myd88和TLR4蛋白及mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)。然而，使用ADSC-Exos治療后高劑量外泌體組小鼠結(jié)膜組織中Myd88和TLR4蛋白以及mRNA表達(dá)均下降。Kiripolsky 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，Sj?gren綜合征小鼠模型中Myd88依賴性TLR4信號(hào)通路的激活在全身及局部炎癥發(fā)展過程中具有重要的作用。而缺乏TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的MyD88-/-小鼠可免受干眼誘導(dǎo)的眼表?yè)p傷和炎癥因子的影響[25]。這些研究結(jié)果進(jìn)一步證明高滲應(yīng)激誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)軸的激活是干眼炎癥進(jìn)展的關(guān)鍵因素。

總之，ADSC-Exos可以通過促進(jìn)角膜上皮修復(fù)、增加淚液分泌、保持淚膜穩(wěn)定性、減輕眼表炎癥反應(yīng)和抑制TLR4信號(hào)通路的激活來改善干眼的癥狀。