邵敬芝 杜珊珊 張莉蓉 張鳳妍

視網(wǎng)膜變性疾病是一類致盲性眼病，具有家族遺傳特性，進(jìn)展緩慢且不可逆[1]。近年來越來越多的實(shí)驗(yàn)研究顯示,免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)在視網(wǎng)膜變性疾病中發(fā)揮重要作用[2-3]。小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細(xì)胞，對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)具有重要作用[4-6]。在視網(wǎng)膜變性過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮了雙刃劍的作用。一方面，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞能夠吞噬細(xì)胞碎片等代謝性毒素物質(zhì)發(fā)揮細(xì)胞免疫作用；另一方面，持續(xù)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量的促炎因子，引發(fā)炎癥損傷反應(yīng)，進(jìn)而損害周圍的神經(jīng)細(xì)胞，加速視網(wǎng)膜變性進(jìn)程。因此，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫活性是視網(wǎng)膜變性疾病的重要治療策略之一。

乳脂肪球表皮生長因子8(MFG-E8)是乳汁脂肪小球表面具有免疫源性的親脂性糖蛋白[7]。研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病、老年性疾病和腫瘤中，MFG-E8發(fā)揮多種功能[8-10]。MFG-E8抑制Aβ42誘導(dǎo)的原代小鼠大腦小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[9,11]，外源性MFG-E8減少促炎細(xì)胞因子的釋放進(jìn)而保護(hù)外傷性腦損傷引起的神經(jīng)元功能損害[12]。炎癥因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素(IL)在小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)隨著MFG-E8的增加或減少而增加或減少[13]。本研究通過體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞來探討MFG-E8對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑DMEM培養(yǎng)基、PDTC、LY294002(美國Sigma公司)；胎牛血清(FBS)(美國Genial公司)；LPS、2.5 g·L-1胰蛋白酶、RIPA裂解液、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8、兔抗小鼠GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(碧云天生物技術(shù)有限公司)；MFG-E8、ELISA試劑盒(美國R&D公司)；兔抗小鼠NF-κB p65抗體、NF-κB p-p65抗體、Akt抗體、p-Akt抗體、PI3K抗體、p-PI3K 抗體、TNF-α抗體、IL-6抗體(英國Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 小膠質(zhì)細(xì)胞的來源及培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞(BV-2細(xì)胞)購于上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10% FBS、10 g·L-1青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，接種于T25培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中。隔天換液，待細(xì)胞生長融合至80%以上進(jìn)行消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞活力測定采用CCK-8法測定細(xì)胞活力。將BV-2細(xì)胞以每孔10×103個接種于96孔板，每組設(shè)置3個復(fù)孔；待細(xì)胞貼壁后，分別用含有0 mg·L-1、10 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1和200 mg·L-1的MFG-E8培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h；加入10 μL WST-8溶液，37 ℃恒溫箱中孵育4 h，測定450 nm波長處細(xì)胞的光密度。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組將培養(yǎng)處于對數(shù)期的BV-2細(xì)胞隨機(jī)分5組，分別為：對照組:完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞；LPS組：含1 mg·L-1LPS的培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞；LPS+MFG-E8組：先用50 mg·L-1MFG-E8作用于BV-2細(xì)胞2 h后，再更換為含有1 mg·L-1LPS的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；LPS + LY294002組：先用含10 μmol·L-1的LY294002(PI3K-AKT信號通路抑制劑)培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2 h后，再更換為含有1 mg·L-1LPS的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；LPS + PDTC組：先用含10 μmol·L-1的PDTC(NF-κB信號通路抑制劑)培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2 h后，再更換為含有1 mg·L-1LPS的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。各組分組處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 ELISA檢測TNF-α表達(dá)收集對照組、LPS組及LPS + MFG-E8組細(xì)胞上清液，根據(jù)TNF-α ELISA試劑盒的操作說明進(jìn)行操作，450 nm波長處測量各組細(xì)胞的光密度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度曲線計(jì)算出各組樣品中TNF-α的實(shí)際質(zhì)量濃度。

1.2.5 Western blot檢測炎癥因子表達(dá)及信號通路蛋白表達(dá)收集對照組、LPS組、LPS+MFG-E8組、LPS+LY294002組和LPS + PDTC組細(xì)胞，冰上裂解提取蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，加上樣緩沖液于水浴鍋中加熱進(jìn)行蛋白變性。配置120 g·L-1的分離膠和50 mg·L-1的濃縮膠，將等量等質(zhì)的蛋白樣品加入上樣孔行凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，孵育一抗(NF-κB p65、NF-κB p-p65、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K、TNF-α、IL-6及GAPDH，稀釋濃度均為11000)，4 ℃搖床孵育過夜，二抗(稀釋濃度為11000)室溫孵育1 h，凝膠成像儀曝光，用ImageJ軟件分析熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度MFG-E8處理后細(xì)胞的活力CCK-8法檢測結(jié)果顯示，經(jīng)0 mg·L-1、10 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1MFG-E8培養(yǎng)24 h后，各組BV-2細(xì)胞活力分別為(95.39±2.83)%、(93.88±2.84)%、(93.95±4.61)%、(94.22±3.72)%和(93.88±3.35)%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.099，P=0.980)。

2.2 MFG-E8對LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞形態(tài)的影響光學(xué)顯微鏡下觀察可見，對照組BV-2細(xì)胞呈靜息狀態(tài)，細(xì)胞大小均勻，呈長梭形，胞體細(xì)長，胞體兩側(cè)有細(xì)長的突起分支；LPS組BV-2細(xì)胞的胞體呈圓形，細(xì)胞表面的分支變短變粗，沒有長的突起，呈阿米巴樣；LPS+MFG-E8組BV-2細(xì)胞形態(tài)較LPS組有一定改善，部分細(xì)胞的胞體兩側(cè)伸出細(xì)長的分支(圖1)。

圖1 各組BV-2細(xì)胞形態(tài)(×200) A：對照組；B：LPS組；C：LPS+MFG-8組。

2.3 MFG-E8對LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響ELISA檢測結(jié)果顯示，對照組、LPS組及LPS+MFG-E8組細(xì)胞上清液中TNF-α的表達(dá)量分別為(111.16±4.25)ng·L-1、(772.43±21.32)ng·L-1和(235.10±45.67)ng·L-1，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=434.8，P<0.001)。兩兩比較結(jié)果顯示，與對照組比較，LPS組BV-2細(xì)胞上清液TNF-α的表達(dá)量明顯增高(t=52.68，P<0.001)；與LPS組比較，LPS+MFG-E8組BV-2細(xì)胞上清液TNF-α的表達(dá)量大幅度下降(t=18.47，P<0.001)。

Western blot檢測結(jié)果顯示，對照組、LPS組及LPS + MFG-E8組中TNF-α、IL-6蛋白相對表達(dá)量總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.999、53.190，P=0.016、0.000)。兩兩比較結(jié)果顯示，與對照組比較，LPS組BV-2細(xì)胞中TNF-α、IL-6蛋白相對表達(dá)量均明顯增高(均為P<0.05)；與LPS組比較，LPS+MFG-E8組BV-2細(xì)胞中TNF-α、IL-6蛋白相對表達(dá)量均明顯下降(均為P<0.05)(圖2)。

圖2 Western blot檢測各組BV-2細(xì)胞炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá) 注：與對照組比較，*P<0.05，***P<0.001；與LPS組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.4 MFG-E8抑制LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制對照組、LPS組、LPS+MFG-E8組、LPS+LY294002組、LPS+PDTC組5組BV-2細(xì)胞中炎癥因子相關(guān)NF-κB信號通路p-p65蛋白及PI3K/Akt信號通路p-Akt、p-PI3K蛋白相對表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05),而NF-κB p65、Akt、PI3K蛋白相對表達(dá)量5組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，與對照組比較，LPS組BV-2細(xì)胞NF-κB p-p65蛋白相對表達(dá)量升高，p-Akt及p-PI3K蛋白相對表達(dá)量下降(均為P<0.001)。與LPS組比較，LPS+MFG-E8組BV-2細(xì)胞NF-κB p-p65蛋白相對表達(dá)量下降，p-Akt及p-PI3K蛋白相對表達(dá)量均升高(均為P<0.001)；與LPS組比較，LPS+LY294002組BV-2細(xì)胞NF-κB p-p65、p-Akt及p-PI3K蛋白相對表達(dá)量均無顯著變化(均為P>0.05)；與LPS組比較，LPS+PDTC組BV-2細(xì)胞NF-κB p-p65蛋白相對表達(dá)量下降，p-Akt及p-PI3K蛋白相對表達(dá)量均升高(均為P<0.001)(圖3、圖4)。

圖3 Western blot檢測各組BV-2細(xì)胞中信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

圖4 各組BV-2細(xì)胞中信號通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)量對比 注：與對照組比較，***P<0.001；與LPS組比較，###P<0.001。

3 討論

小膠質(zhì)細(xì)胞作為體內(nèi)的固有免疫細(xì)胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的一道免疫防線。正常視網(wǎng)膜組織中小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，有長的突起，維持視網(wǎng)膜內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)。當(dāng)變性疾病發(fā)生時，小膠質(zhì)細(xì)胞被迅速激活，突起消失，呈阿米巴樣，發(fā)揮吞噬作用的同時釋放大量的炎癥因子TNF-α、IL-6等加重炎癥反應(yīng)[14]。根據(jù)發(fā)揮作用的不同，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可分為M1型和M2型。M1型細(xì)胞可產(chǎn)生大量炎癥因子，從而破壞細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而破壞病原體及細(xì)胞的完整性，使其易于被吞噬[15-16]；M2型細(xì)胞不僅能吞噬細(xì)胞碎片及代謝產(chǎn)物，而且能分泌抑制炎癥的細(xì)胞因子，發(fā)揮保護(hù)機(jī)體的作用[17]。適度的神經(jīng)炎癥反應(yīng)對機(jī)體有一定的保護(hù)作用，但持續(xù)慢性的促炎因子的分泌會產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)，加快疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。在本研究中，LPS激活小膠質(zhì)細(xì)胞，使小膠質(zhì)細(xì)胞由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒚装蜆訝顟B(tài)，ELISA檢測結(jié)果顯示，BV-2細(xì)胞上清液TNF-α的含量增多，Western blot檢測結(jié)果也顯示，細(xì)胞中炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)增加。表明LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，刺激炎癥因子的分泌。干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞激活，減少促炎因子的釋放，對防治神經(jīng)炎癥為主要病理的視網(wǎng)膜變性疾病具有重要意義。

MFG-E8是乳汁脂肪小球表面具有免疫源性的親脂性糖蛋白，主要分布于乳腺小管頂端的分泌細(xì)胞，也存在于巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及胰腺細(xì)胞等[7]。在炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病、老年性疾病和腫瘤中，MFG-E8在緩解炎癥、改善預(yù)后、促進(jìn)傷口愈合、動脈重塑、增強(qiáng)致瘤性和腫瘤代謝中發(fā)揮多種功能[8,10,18]。在小鼠模型中，重組MFG-E8能抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子的分泌，并通過降低炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用[19-20]。本研究采用CCK-8法檢測不同濃度MFG-E8作用下小膠質(zhì)細(xì)胞的生存活力，結(jié)果顯示，不同濃度MFG-E8作用下小膠質(zhì)細(xì)胞的生存活力沒有明顯差異。當(dāng)MFG-E8作用于LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞后，小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子TNF-α及IL-6的分泌減少，細(xì)胞的炎癥反應(yīng)降低。以上研究結(jié)果說明，MFG-E8可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

在動物模型及體外模型研究中發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞在誘導(dǎo)因素刺激作用下，NF-κB等炎癥相關(guān)信號通路被激活，釋放炎癥因子，重組MFG-E8能通過降低NF-κB的核轉(zhuǎn)錄下調(diào)下游炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生而發(fā)揮抗炎作用[19-20]。Shi等[9]認(rèn)為，MFG-E8通過降低NF-κB及上調(diào)PI3K-Akt的表達(dá)抑制Aβ42誘導(dǎo)的原代小鼠大腦小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而降低細(xì)胞毒性，為阿爾茨海默病的治療提供理論基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS可以誘導(dǎo)NF-κB信號通路的激活，同時抑制PI3K/Akt信號通路的活性；而MFG-E8作用下，與LPS組相比，NF-κB信號通路蛋白因子p-p65的表達(dá)下降，而PI3K/Akt信號通路蛋白因子p-Akt和p-PI3K的表達(dá)均升高。當(dāng)NF-κB信號通路抑制劑PDTC聯(lián)合LPS作用于BV-2細(xì)胞時，NF-κB p-p65蛋白的相對表達(dá)量降低，同時p-Akt和p-PI3K蛋白的相對表達(dá)量升高；當(dāng)PI3K信號通路抑制劑LY294002聯(lián)合LPS作用于BV-2細(xì)胞時，p-Akt和p-PI3K蛋白的相對表達(dá)量均降低，但NF-κB p-p65蛋白的相對表達(dá)量沒有明顯變化。根據(jù)以上結(jié)果，我們推斷MFG-E8主要通過抑制NF-κB信號通路發(fā)揮作用。

綜上，本研究結(jié)果顯示，MFG-E8對LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)有抑制作用，其機(jī)制可能與抑制NF-κB信號通路有關(guān)。本研究為開發(fā)延緩和阻止視網(wǎng)膜變性疾病發(fā)生發(fā)展的藥物提供了參考依據(jù)。