朱紅軍 趙萌

糖尿病視網(wǎng)膜病變、老年性黃斑變性等常見致盲眼底病變均與視網(wǎng)膜新生血管(RNV)形成有關(guān)。 RNV的形成對人體危害較大，隨著新生血管數(shù)量的增多，可能會出現(xiàn)玻璃體積血、視網(wǎng)膜脫離等不可逆轉(zhuǎn)的改變，最終導(dǎo)致視力喪失。Chemerin屬于一種脂肪細(xì)胞因子，通過與其受體ChemR23相結(jié)合作用于相應(yīng)部位[1-2]。有研究表明[3-4]，Chemerin可能參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生和發(fā)展，血清Chemerin水平升高，糖尿病視網(wǎng)膜病變的嚴(yán)重程度也隨之升高，但具體機(jī)制尚不清楚。也有研究表明[5-8]，Chemerin能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活性氧(ROS)的表達(dá)，而ROS介導(dǎo) MAPK信號通路參與細(xì)胞的多種反應(yīng)，傳遞細(xì)胞外刺激的信號到細(xì)胞核，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理和病理進(jìn)程，在RNV的形成過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究通過熒光探針-二氫乙啶(DHE)法、MTT法、Western blot、基質(zhì)膠(Matrigel)法、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)等檢測Chemerin對恒河猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞RF/6A血管形成的作用，并分析該作用的機(jī)制是否與ROS介導(dǎo)的MAPK信號通路有關(guān)，以期為Chemerin在脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜新生血管形成過程中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源與主要試劑RF/6A細(xì)胞購買于美國模式菌種收集中心(ATCC)細(xì)胞庫。Chemerin購自上海通蔚實(shí)業(yè)有限公司；ROS抑制劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)檢測試劑盒、DHE試劑盒購于江蘇凱基生物公司；DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；基質(zhì)膠(Matrigel)購于美國BD公司；一抗(GAPDH)、二抗購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組RF/6A細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100×103U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，胰蛋白酶消化傳代，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為3組，分別為CO組：正常培養(yǎng)RF/6A細(xì)胞24 h；CH組：RF/6A細(xì)胞與10 μg·L-1Chemerin混合培養(yǎng)24 h；CN組：RF/6A細(xì)胞與10 μg·L-1Chemerin、200 μmol·L-1NAC混合培養(yǎng)24 h。

1.3 DHE法檢測RF/6A細(xì)胞中ROS的含量將RF/6A細(xì)胞按照每孔5×105個接種于6孔板中，分組處理后，避光條件下加入含10 μmol·L-1DHE熒光探針的無血清DMEM培養(yǎng)液1 mL，37 ℃避光孵育1 h，清洗各組細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察熒光信號強(qiáng)弱并拍照，記錄熒光強(qiáng)度。每組均設(shè)6個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 MTT法檢測RF/6A細(xì)胞增殖情況調(diào)整RF/6A細(xì)胞密度為10×103個·mL-1，以每孔200 μL細(xì)胞懸液接種到96孔板中，分組處理后，每孔加入5 g·L-1的MTT溶液20 μL，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，清除培養(yǎng)液，每孔加入200 μL DMSO，振蕩10 min，充分溶解，計(jì)算細(xì)胞增殖率。每組均設(shè)6個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測定RF/6A細(xì)胞的遷移能力將RF/6A細(xì)胞按照每孔5×105個接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞均勻鋪滿底部后，用100 μL的移液槍頭垂直于定位線劃痕。PBS漂洗3次，倒置顯微鏡下拍照并記錄劃痕寬度(記為0 h)，分組處理細(xì)胞，24 h后再進(jìn)行拍照，記錄劃痕寬度(記為24 h)，每組選取6個視野進(jìn)行觀測，統(tǒng)計(jì)3組RF/6A細(xì)胞遷移面積(像素)。每組均設(shè)2個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Matrigel法檢測RF/6A細(xì)胞管腔形成在超凈工作臺中，取96孔板，每孔加入100 μL液態(tài)Matrigel。調(diào)整RF/6A細(xì)胞至2×105個·mL-1，分組后每孔均加入細(xì)胞懸液50 μL，孵育24 h后在顯微鏡下觀察，每組隨機(jī)取5個視野照相，對形成的完整管腔計(jì)數(shù)，取平均值。每組均設(shè)置6個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western blot檢測RF/6A細(xì)胞中p38MAPK蛋白含量分組處理RF/6A細(xì)胞后， PBS清洗后行細(xì)胞裂解，提取各組細(xì)胞蛋白。BCA蛋白定量，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，冰浴，加一抗(p38MAPK和GAPDH稀釋度均為11000) ，第2天將膜取出后TBST洗3次，加二抗(稀釋度11000)常溫孵育1.5 h，滴加ECL超敏發(fā)光液，檢測各組RF/6A細(xì)胞p38MAPK蛋白相對表達(dá)情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料經(jīng)檢測均呈正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，同一組不同時(shí)間點(diǎn)比較采用重復(fù)測量方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞ROS表達(dá)水平比較DHE法檢測結(jié)果顯示，CO組、CH組、CN組RF/6A細(xì)胞ROS表達(dá)水平分別為：19.34±1.53、209.76±19.37、103.52±9.53，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，CH組RF/6A細(xì)胞中ROS表達(dá)水平明顯高于CO組和CN組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000、0.027)；CN組RF/6A細(xì)胞中ROS表達(dá)水平較CO組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039)(圖1)。

圖1 各組RF/6A細(xì)胞ROS表達(dá)(×20，曝光時(shí)間2.5 s)

2.2 各組細(xì)胞增殖情況MTT法檢測結(jié)果顯示，CO組、CH組、CN組RF/6A細(xì)胞增殖率分別為0.276±0.097、0.982±0.209、0.509±0.115，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，CH組RF/6A細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)，與CO組、CN組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002、0.021)；CN組RF/6A細(xì)胞增殖能力較CO組強(qiáng)，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.024)。

2.3 各組細(xì)胞遷移能力細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CO組、CH組、CN組RF/6A細(xì)胞遷移面積(像素)分別為31 268±1397、56 489±2653、39 684±1864，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，CH組RF/6A細(xì)胞遷移能力顯著高于CO組、CN組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005、0.017)；CN組RF/6A細(xì)胞遷移能力高于CO組，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.029)(圖2)。

圖2 各組RF/6A細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果

2.4 各組細(xì)胞管腔形成Matrigel法檢測結(jié)果顯示，CO組、CH組、CN組RF/6A細(xì)胞管腔形成數(shù)量分別為(1.06±1.12)個、(6.04±2.24)個、(3.08±3.67)個，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，CH組RF/6A細(xì)胞管腔形成數(shù)量顯著高于CO組、CN組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012、0.032)；CN組RF/6A細(xì)胞管腔形成數(shù)量高于CO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034)(圖3)。

圖3 Matrigel法檢測各組RF/6A細(xì)胞管腔形成情況(×200)

2.5 Western blot檢測RF/6A細(xì)胞中p38MAPK的蛋白表達(dá)Western blot檢測結(jié)果(圖4)顯示，CO組、CH組、CN組RF/6A細(xì)胞中p38MAPK蛋白相對表達(dá)量分別為0.42±0.06、1.09±0.09、0.73±0.07，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示，CH組RF/6A細(xì)胞中p38MAPK蛋白相對表達(dá)量顯著高于CO組、CN組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002、0.007)；CN組RF/6A細(xì)胞中p38MAPK蛋白相對表達(dá)量高于CO組，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009)。

圖4 各組RF/6A細(xì)胞中p38MAPK蛋白表達(dá)

3 討論

RNV多與眼部組織缺血缺氧及炎癥反應(yīng)形成有關(guān)[9]，與正常的眼部血管構(gòu)造不同，RNV結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易破裂出血，從而導(dǎo)致玻璃體積血、視網(wǎng)膜脫離等，若治療不及時(shí)很容易造成失明[10]。在糖尿病視網(wǎng)膜病變中RNV的出現(xiàn)預(yù)示著糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)入增生期，患者的病情加重。RNV形成原因復(fù)雜，具體機(jī)制尚不明確，可能與多種因素相關(guān)，其基本過程是血管內(nèi)皮細(xì)胞被激活，使血管舒張、通透性增加，進(jìn)而血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，新生血管管腔形成，最后形成血管外膜[11]。

本研究結(jié)果顯示，CH組RF/6A細(xì)胞增殖率顯著高于CO組，CH組RF/6A細(xì)胞遷移能力顯著高于CO組，CH組RF/6A細(xì)胞管腔形成數(shù)量顯著高于CO組(均為P<0.05)，說明Chemerin可以促進(jìn)RF/6A細(xì)胞的增殖、遷移和新生血管管腔形成；而CN組RF/6A細(xì)胞的增殖率、遷移能力、管腔形成數(shù)量均較CH組降低，說明抑制Chemerin表達(dá)可抑制RNV形成。

Chemerin在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者體內(nèi)發(fā)揮顯著作用，其原理可能是高糖促進(jìn)患者體內(nèi)ROS/p38MAPK的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)ChemR23受體的表達(dá)，使視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮新生細(xì)胞加速生長[12-13]。連海燕等[14]研究顯示，氧化應(yīng)激中產(chǎn)生的ROS在多種條件下都是自噬的重要調(diào)節(jié)因子，它能誘導(dǎo)自噬發(fā)生，而自噬能通過不同的信號通路來緩解氧化應(yīng)激造成的損傷，從而保護(hù)細(xì)胞存活。Zhao等[15]研究表明，Chemerin通過提高內(nèi)皮細(xì)胞中線粒體ROS的產(chǎn)生速率提高ROS的含量，增加氧化應(yīng)激水平，上調(diào)MAPK等信號通路蛋白表達(dá)，促進(jìn)新生血管形成。ROS是介導(dǎo)新生血管形成的關(guān)鍵信號分子，ROS水平的增加可能也是Chemerin促進(jìn)新生血管形成的機(jī)制之一。近年來多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，Chemerin與自噬之間存在激活關(guān)系，自噬在新生血管形成中起到關(guān)鍵作用，通過抑制自噬能夠抑制動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞新生血管的形成[16-17]。ROS是激活細(xì)胞自噬的重要條件，自噬能夠通過清除被ROS損傷的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)，從而減輕ROS對細(xì)胞造成的損害，對細(xì)胞起保護(hù)作用。在體內(nèi)，如果ROS 清除系統(tǒng)出現(xiàn)問題導(dǎo)致ROS增加，機(jī)體就會相應(yīng)地升高自噬水平從而降解ROS。如果自噬過程被阻斷，就會引起細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的升高，因而自噬是促進(jìn)RNV形成的重要因素[18]。本研究中，CH組RF/6A細(xì)胞中ROS表達(dá)水平明顯比CO組和CN組高，p38MAPK的蛋白含量也顯著高于CO組和CN組?？梢?，細(xì)胞內(nèi)自噬的平衡以及ROS介導(dǎo)的自噬與內(nèi)皮細(xì)胞增殖之間的關(guān)系對視網(wǎng)膜血管性疾病的發(fā)展至關(guān)重要。

綜上所述，Chemerin導(dǎo)致RF/6A細(xì)胞ROS水平升高，激活p38MAPK蛋白表達(dá)，促進(jìn)RNV形成；抑制ROS后，p38MAPK活性降低，提示Chemerin促進(jìn)RNV的機(jī)制與ROS介導(dǎo)的MAPK通路激活有關(guān)。