張歡 姜志昕 周永瑩 曹秀朋 王玉川 李軒

眼部化學(xué)燒傷占眼部損傷的11.5%～22.1%[1]，其中，堿燒傷比酸燒傷發(fā)生得更為頻繁[2]，并導(dǎo)致更為嚴(yán)重的組織損傷。堿可導(dǎo)致組織皂化，并快速滲透到深部組織，受損組織發(fā)生液化性壞死，引起炎癥反應(yīng)，釋放出大量蛋白水解酶，進(jìn)一步損害組織[3-5]。角膜混濁是角膜堿燒傷的主要并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致角膜失明的主要原因。目前，類固醇皮質(zhì)激素和膠原酶抑制劑主要用于保持角膜透明度并促進(jìn)堿燒傷后的傷口愈合[6]。盡管取得了顯著進(jìn)展， 但在預(yù)防角膜堿燒傷引起的角膜損傷方面并沒有達(dá)到預(yù)期效果[7]。角膜堿燒傷的治療仍然是眼科醫(yī)生面臨的主要挑戰(zhàn)[3]。白藜蘆醇(RSV)是一種多酚類抗毒素，存在于葡萄、虎杖等天然植物中，具有抗炎、抗氧化、抑制纖維化、延緩衰老等重要的藥理活性[8]。研究證實，RSV能顯著抑制化學(xué)藥物損傷引起的肺、肝臟等重要器官的纖維化反應(yīng)[9-10]。然而，RSV對角膜堿燒傷引起的組織纖維化反應(yīng)是否有保護(hù)作用，目前尚未見報道。本研究探討RSV對堿燒傷小鼠角膜纖維化的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF級、健康6～8周齡雄性C57BL/6J小鼠48只，體重(20.0±1.20)g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。飼養(yǎng)于中國科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所動物中心，室內(nèi)溫度(22±2)℃、相對濕度40%～60%，12 h/12 h照明晝夜循環(huán)。

1.1.2 主要試劑及儀器RSV(Sigma公司，美國)，濾紙片(杭州富陽北木漿紙有限公司)，妥布霉素滴眼液、眼膏，鹽酸丙美卡因滴眼液(Alcon公司，比利時)，羥丙基-β-環(huán)糊精(Solarbio公司)，抗α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體(Proteintech，美國)，抗Ⅲ型膠原纖維蛋白α1鏈(COL3A1)抗體、抗轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)抗體(Santa Cruz公司，美國)，數(shù)碼裂隙燈顯微鏡(蘇州微清醫(yī)療有限公司)，體式顯微鏡(Zeiss公司，德國)，激光共聚焦熒光顯微鏡(Leica，德國)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及處理裂隙燈顯微鏡下檢查小鼠角膜，均為正常。采用隨機(jī)數(shù)字表法將48只雄性C57BL/6J小鼠分為正常對照組、模型組和RSV組，每組16只。模型組和RSV組小鼠右眼建立角膜堿燒傷模型，左眼不做任何處理，造模后每間隔8 h分別用5 μL羥丙基-β-環(huán)糊精溶液或2 g·L-1RSV溶液滴眼，連續(xù)滴眼21 d。用藥濃度和頻次參照文獻(xiàn)[11-12]。正常對照組不做造模和滴眼處理。本實驗遵循《實驗動物管理條例》。

1.2.2 RSV溶液的制備RSV難溶于水；羥丙基-β-環(huán)糊精作為一種具有良好生物耐受性的包合物，可顯著增加RSV的水溶性和穩(wěn)定性[13]，并已在滴眼液配方中進(jìn)行臨床評估[14-15]。參照文獻(xiàn)[16]，在0.03 mol·L-1羥丙基-β-環(huán)糊精溶液中制備2 g·L-1RSV溶液。整個過程在暗室中完成，并用鋁箔紙包裹試管，防止光誘導(dǎo)RSV變性。

1.2.3 小鼠角膜堿燒傷模型的制作將小鼠按照10 mL·kg-1腹腔注射50 g·L-1水合氯醛進(jìn)行全身麻醉，鹽酸丙美卡因滴眼液滴于右眼，進(jìn)行眼表麻醉。參照文獻(xiàn)[17]構(gòu)建角膜堿燒傷模型，具體步驟如下：將浸泡于1 mol·L-1NaOH、直徑2 mm的圓形濾紙片置于小鼠右眼角膜中央10 s，同時注意不損傷角膜緣、眼瞼及結(jié)膜。術(shù)后用20 mL生理鹽水沖洗眼表及結(jié)膜囊，妥布霉素滴眼液滴眼或眼膏涂眼預(yù)防感染。排除后期角膜感染，32只小鼠均造模成功。

1.2.4 角膜混濁評分參照文獻(xiàn)[18]，由兩名研究人員單獨對角膜混濁程度進(jìn)行評分。采用0～4分制進(jìn)行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)：0分為角膜完全透明，虹膜及瞳孔清晰可見；1分為角膜輕微不透明，可見虹膜和瞳孔細(xì)節(jié)；2分為角膜輕度模糊，隱約可見虹膜和瞳孔；3分為角膜不透明，幾乎不可見虹膜和瞳孔；4分為角膜完全不透明，不可見虹膜和瞳孔。

1.2.5 組織病理學(xué)觀察各組小鼠角膜組織中α-SMA及COL3A1蛋白的表達(dá)角膜堿燒傷后21 d，全身麻醉后頸椎脫臼法處死各組小鼠，完整取下眼球，放入40 g·L-1多聚甲醛溶液中固定過夜，按標(biāo)準(zhǔn)流程脫水處理，進(jìn)行石蠟切片。HE染色觀察各組小鼠角膜組織結(jié)構(gòu)，免疫熒光染色觀察各組小鼠角膜組織中α-SMA及COL3A1抗原蛋白的表達(dá)情況。

1.2.6 Western blot檢測各組小鼠角膜組織中TGF-β1、α-SMA及COL3A1蛋白的表達(dá)角膜堿燒傷后21 d，全身麻醉后頸椎脫臼法處死各組小鼠，完整取下角膜，提取角膜組織蛋白樣品。蛋白樣品電泳在100 g·L-1十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠上運(yùn)行，然后在220 mA時轉(zhuǎn)移至PVDF膜。膜用50 g·L-1脫脂牛奶室溫下孵育2 h后，用一抗抗TGF-β1(1500稀釋)、抗α-SMA(1600稀釋)、抗COL3A1(11000稀釋)、GAPDH(11000稀釋)4 ℃孵育過夜。第2天室溫下孵育熒光二抗(115 000稀釋) 2 h。用奧德賽薩雙色紅外激光成像系統(tǒng)曝光(Licor，美國)，用ImageJ軟件分析條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，計算不同目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，服從正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，通過單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD-t檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。檢驗水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠角膜混濁及混濁程度評分角膜堿燒傷后21 d，裂隙燈顯微鏡觀察各組小鼠角膜混濁程度發(fā)現(xiàn)：正常對照組小鼠角膜完全透明，虹膜及瞳孔清晰可見，模型組小鼠角膜中重度混濁，幾乎不可見瞳孔和虹膜，RSV組小鼠角膜輕度混濁，可透見瞳孔及虹膜(圖1)。RSV組小鼠角膜混濁評分[(2.25±0.89)分]明顯低于模型組[(3.25±0.71)分]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.026)。

圖1 各組小鼠角膜混濁情況

2.2 各組小鼠角膜組織的HE染色結(jié)果HE染色結(jié)果顯示，正常對照組小鼠角膜結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞3～4層，基質(zhì)膠原排列規(guī)則；角膜堿燒傷后21 d，模型組和RSV組小鼠角膜上皮細(xì)胞均為2～3層，上皮細(xì)胞排列欠規(guī)則，角膜基質(zhì)水腫，但模型組小鼠角膜基質(zhì)中細(xì)胞數(shù)較RSV組增多(圖2)。

圖2 各組小鼠角膜組織HE染色結(jié)果

2.3 各組小鼠角膜組織中α-SMA與 COL3A1的表達(dá)免疫熒光染色結(jié)果顯示，正常對照組小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)α-SMA蛋白，角膜基質(zhì)不表達(dá)COL3A1。角膜堿燒傷后 21 d，模型組小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞α-SMA染色呈強(qiáng)陽性，角膜基質(zhì)中表達(dá)COL3A1；RSV組小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞α-SMA和角膜基質(zhì)中COL3A1表達(dá)均弱于模型組(圖3)。

圖3 各組小鼠角膜組織中α-SMA和COL3A1的免疫熒光染色結(jié)果 注：α-SMA(綠色熒光)，COL3A1(紅色熒光)；箭頭示陽性染色。

2.4 Western blot檢測各組小鼠角膜中TGF-β1、α-SMA及 COL3A1蛋白的表達(dá)Western blot檢測結(jié)果顯示，正常對照組小鼠角膜幾乎不表達(dá)TGF-β1、α-SMA、COL3A1；角膜堿燒傷21 d后，模型組小鼠角膜組織中TGF-β1、α-SMA、COL3A1的蛋白相對表達(dá)水平分別為1.48±0.50、0.55±0.18、1.32±0.87，顯著高于RSV組[TGF-β1(0.60±0.17)、α-SMA(0.27±0.05)、COL3A1(0.49±0.21)]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)(圖4)。

圖4 Western blot檢測各組小鼠角膜組織中TGF-β1、α-SMA及COL3A1蛋白的表達(dá)

3 討論

傷口愈合是一個嚴(yán)格控制的過程，它的失調(diào)可能導(dǎo)致纖維化、瘢痕和組織功能喪失。角膜堿燒傷是臨床上常見的難治性眼病之一，嚴(yán)重?fù)p傷眼部組織。對角膜損傷的纖維化反應(yīng)通常造成嚴(yán)重的角膜混濁，進(jìn)而導(dǎo)致視力下降甚至失明。肌成纖維細(xì)胞形成和組織纖維化都參與堿燒傷后角膜的傷口愈合過程或角膜混濁的形成[19-20]。因此，抑制該過程全部或部分環(huán)節(jié)可以減輕角膜的混濁。

RSV是一種天然多酚類物質(zhì)，在不同的組織器官和細(xì)胞中具有調(diào)節(jié)纖維化反應(yīng)的功能[8]。Wang等[10]研究證實，RSV能顯著逆轉(zhuǎn)博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化。Bai等[21]報道，RSV可抑制腎小管上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腎纖維化。Zhu等[9]報道，RSV通過增加自噬抑制四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化。然而，RSV在角膜組織纖維化中的保護(hù)作用尚不清楚。本研究建立小鼠角膜堿燒傷模型，用以評價RSV對堿燒傷小鼠誘導(dǎo)角膜纖維化的保護(hù)作用。

角膜的透明性對其正常功能十分重要。研究表明，纖維細(xì)胞參與角膜傷口愈合，以應(yīng)對可能導(dǎo)致基質(zhì)纖維化的損傷[22]。然而在異常的愈合反應(yīng)中，角膜基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞并發(fā)生纖維化反應(yīng)，導(dǎo)致角膜透明度的喪失[23]。 α-SMA是纖維細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志。在本研究中，免疫熒光染色和Western blot檢測結(jié)果均顯示，堿燒傷使小鼠角膜組織中α-SMA表達(dá)增加，給予RSV干預(yù)后，α-SMA表達(dá)顯著下降，表明堿燒傷誘導(dǎo)角膜基質(zhì)細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞，RSV可抑制肌成纖維細(xì)胞的活化，這與Yi等[24]研究多西環(huán)素促進(jìn)堿燒傷角膜傷口愈合的結(jié)果部分一致。與角膜組織中其他類型的膠原類型相比，Ⅲ型膠原纖維在新生兒角膜和成人角膜的瘢痕組織中都有發(fā)現(xiàn)[25]。在受傷的角膜中，肌成纖維細(xì)胞過量表達(dá)COL3A1，導(dǎo)致Ⅲ型膠原纖維蛋白顯著沉積在愈合的基質(zhì)和瘢痕組織中[26-27]。在本研究中，堿燒傷后21 d，模型組小鼠角膜組織中COL3A1蛋白表達(dá)顯著增高，RSV組小鼠角膜組織中COL3A1蛋白表達(dá)顯著下降，表明RSV可減少損傷角膜組織中異常膠原纖維的沉積，這與Joung等[28]研究SP-8356抑制分化簇147減輕角膜混濁的結(jié)果一致。肌成纖維細(xì)胞活化和異常膠原纖維沉積是造成角膜混濁的主要原因[24]，RSV這種抑制纖維化的作用與顯微鏡下觀察角膜混濁程度的結(jié)果一致。

研究表明，角膜損傷后TGF-β1的合成增加與角膜纖維化的發(fā)展有關(guān)；在角膜損傷后，傷口附近的上皮細(xì)胞、角膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生大量TGF-β1，持續(xù)暴露于TGF-β1環(huán)境下會促進(jìn)角膜成纖維細(xì)胞增殖，肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化加速和紊亂的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生[29-31]。本研究中，堿燒傷后模型組小鼠角膜組織中TGF-β1表達(dá)顯著增加，而RSV組小鼠角膜組織中TGF-β1表達(dá)較模型組明顯下降，這與α-SMA、COL3A1的免疫熒光染色和 Western blot檢測結(jié)果趨勢一致。說明RSV能抑制損傷角膜組織中TGF-β1的表達(dá)和角膜纖維化。

綜上所述，本研究通過RSV局部滴眼的方式觀察堿燒傷后小鼠角膜混濁程度變化及角膜組織內(nèi)TGF-β1、α-SMA和COL3A1的表達(dá)情況，結(jié)果證實，RSV可以抑制堿燒傷誘導(dǎo)的角膜纖維化反應(yīng)，從而改善角膜混濁程度。這表明RSV可能是治療病理性角膜纖維化潛在的藥物，但其具體作用機(jī)制尚不明確。我們將在下一步實驗中探索RSV在受損角膜中抗纖維化作用的詳細(xì)潛在機(jī)制。