王楠楠，蔡婷婷，劉霞，朱婉萍

（浙江省中醫(yī)藥研究院，浙江 杭州 310007）

銀屑病是一種免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚病。目前銀屑病的發(fā)病機制尚未明確，有研究表明輔助性T細胞（Th）17相關(guān)的細胞因子能誘導(dǎo)皮膚內(nèi)黏附分子的表達和淋巴細胞的浸潤，促進角質(zhì)形成細胞的增殖、分化，釋放炎性介質(zhì)，在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[1]。

銀屑病動物模型有助于探究其潛在發(fā)病機制，是藥物療效評價的重要工具。目前尚未有與人類銀屑病發(fā)病機制完全相同的動物模型，各種銀屑病模型均基于不同的致病機制，有其各自的特點和局限性，使用較多的有咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠模型[2-4]，普萘洛爾誘導(dǎo)豚鼠模型等[5-6]，但缺乏標準的操作規(guī)范，受干擾因素較多，模型維持時間較短，不適宜長期研究。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)單用咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病大鼠模型不夠穩(wěn)定。有研究發(fā)現(xiàn)咪喹莫特加用干擾素（IFN）刺激，可誘導(dǎo)更為穩(wěn)定、典型的銀屑病小鼠模型[7]。與小鼠相比，大鼠是更接近人類的實驗動物，其背部皮膚面積較大，皮損特征易于觀察，病理生理特征易于研究，可較好的進行銀屑病發(fā)病機制的研究及銀屑病動物模型的補充。故本實驗采用咪喹莫特單用、咪喹莫特聯(lián)合IFN-α誘導(dǎo)大鼠銀屑病模型，從皮膚形態(tài)、病理及細胞因子的表達等方面闡釋模型的臨床和病理特點，建立穩(wěn)定、可復(fù)制的銀屑病動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級Wistar大鼠35只，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006，由浙江省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心飼養(yǎng)。

1.1.2 藥品與試劑 5%咪喹莫特乳膏（0.25g/袋×4袋，四川明欣藥業(yè)有限責任公司，19030239）；300萬U重組人干擾素-α-2a注射液（1.0 mL/瓶，沈陽三生制藥有限責任公司，201807031）；PA-J化合物，Kv1.3鉀離子通道抑制劑，由實驗室合成；白細胞介素（IL）-17 抗體，BOSTER，0001712Da472158。

1.1.3 主要設(shè)備 Nikon eclipse 80i顯微鏡（Nikon公司）；CCD：DS－Fi1 500萬象素（Nikon公司）；圖象分析軟件Carl Zeiss Imaging Systems（Carl Zeiss公司）；電子分析天平[勒-托利多儀器（上海）有限公司]；超低溫冰箱（Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 SPF級雄性Wistar大鼠35只，按體質(zhì)量隨機分為4組，分別為空白對照組、咪喹莫特單用組、咪喹莫特聯(lián)用組、PA-J組，其中單用組5只，其余每組10只。

1.2.2 造模及給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)數(shù)日后，將各大鼠背部中央?yún)^(qū)域（2 cm×2 cm）的毛剃去后，用溫和型脫毛膏脫去表面短毛，洗凈擦干，備用。若實驗過程中背毛再次長出，則用剃毛刀剔除毛發(fā)。

每日上午，咪喹莫特單用組大鼠背部按照20 mg/cm2均勻涂抹5%咪喹莫特乳膏（每袋0.25 g，涂抹3只）；咪喹莫特聯(lián)用組及PA-J組大鼠背部涂抹5%咪喹莫特乳膏，10 min后將重組人干擾素-α-2a注射液按照1萬U/500 g腹腔注射；空白對照組大鼠背部涂以等量凡士林，1次/d。下午，PA-J組大鼠背部按0.5 mg/只滴涂藥物，連續(xù)10 d。

1.2.3 銀屑病皮損面積和嚴重程度指數(shù)（PASI）評分 第11 d，依據(jù)PASI評分標準，給予大鼠皮損處紅斑、鱗屑及表皮浸潤增厚程度0～4的積分。評分標準如下：0，無；1，輕度；2，中度；3，重度；4，極重度，見表1。對各組大鼠積分取平均值，觀察各組大鼠皮損的變化情況。

1.2.4 HE染色 將大鼠背部皮損組織取材，4%中性甲醛固定、石蠟包埋、切片，經(jīng)HE染色，顯微鏡下觀察皮膚組織形態(tài)學(xué)變化，進行Baker評分。

Baker評分具體標準如下：表皮層中發(fā)現(xiàn)Munro小膿腫2.0分；角化過度0.5分；角化不全1.0分；顆粒層變薄或消失1.0分；棘層增厚1.0分；皮突延長、起伏根據(jù)輕中重度分別計0.5分、1.0分、1.5分。真皮層中單一核或多核細胞浸潤根據(jù)輕中重度分別計0.5分、1.0分、1.5分；乳突上頂0.5分；毛細血管擴張0.5分。

1.2.5 免疫組化 按照產(chǎn)品說明書上的免疫組化兩步法操作規(guī)程染色。即將石蠟包埋后的皮損組織，切片置60℃烤箱烘烤2 h；切片脫蠟至水；蒸餾水洗2 min；高壓熱修復(fù)；3%H2O2溶液阻斷過氧化物酶，10 min；磷酸鹽緩沖液（PBS）洗 5 min×3 次；滴加一抗，37℃孵育1 h；PBS洗5 min×3次；滴加二抗，37℃孵育 60 min；PBS洗 5 min×3次；DAB 顯色2 min；復(fù)染、透明后封片。將每張切片所要分析的部位顯微鏡下拍攝照片，進行圖象分析。

總光密度（IOD）：陽性表達部位（∑Area）×該部位的平均光密度（Density）；陽性指數(shù)：即IOD/照片總像素（IOD面積以象素單位計算），用DAB顯色的免疫組化切片陽性區(qū)域為棕黃色，陽性指數(shù)表示總光密度均分到該照片的值。

2 結(jié)果

2.1 對銀屑病大鼠皮損PASI評分的影響 空白對照組皮膚光滑完整，未見紅斑、鱗屑；咪喹莫特單用組皮膚僅見少量鱗屑；咪喹莫特聯(lián)用組皮膚可見大塊鱗屑、紅斑；PA-J組皮膚可見部分鱗屑，未見紅斑，見圖1。與空白對照組比較，單用組與聯(lián)用組PASI評分明顯增高（P<0.01），且聯(lián)用組優(yōu)于單用組（P<0.05）；與聯(lián)用組比較，PA-J組PASI評分明顯降低（P<0.05），見表2。

圖1 銀屑病大鼠背部皮損嚴重程度

表2 對銀屑病大鼠皮損PASI評分的影響 （±s）

表2 對銀屑病大鼠皮損PASI評分的影響 （±s）

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與咪喹莫特聯(lián)用組比較，#P<0.05。

組別 n 劑量（m g/只） P A S I評分空白對照 1 0 - 0.0 0±0.0 0咪喹莫特單用 5 - 2.6 0±1.1 4*#咪喹莫特聯(lián)用 1 0 - 4.1 0±1.1 0*P A-J 1 0 0.5 2.8 0±1.3 2#

2.2 對銀屑病大鼠皮損病理改變的影響 空白對照組皮膚結(jié)構(gòu)完整清晰，未見過度角化、棘層肥厚、毛細管擴張，真皮層有少量炎性細胞浸潤；咪喹莫特單用組皮膚可見角化不全，棘層輕度肥厚，皮突延長起伏明顯，真皮層炎性細胞浸潤；咪喹莫特聯(lián)用組皮膚可見明顯角化過度、角化不全、棘層肥厚、乳突上頂，真皮層大量炎性細胞浸潤；PA-J組皮膚結(jié)構(gòu)完整，顆粒層可見、部分皮膚延長起伏、未見棘層肥厚，真皮層可見炎性細胞浸潤，見圖2。

圖2 大鼠背部皮損病理改變（HE染色×100）

與空白對照組比較，單用組與聯(lián)用組Baker評分明顯增高（P<0.01），且聯(lián)用組優(yōu)于單用組（P<0.01）；與聯(lián)用組比較，PA-J組Baker評分明顯降低（P<0.01），見表3。

表3 對銀屑病大鼠皮損Baker評分的影響 （±s）

表3 對銀屑病大鼠皮損Baker評分的影響 （±s）

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與咪喹莫特聯(lián)用組比較，#P<0.01。

組別 n 劑量（mg/只） Baker評分空白對照 10 - 2.15±0.53咪喹莫特單用 5 - 4.60±0.55*#咪喹莫特聯(lián)用 10 - 6.30±1.21*PA-J 10 0.5 3.60±0.94#

2.3 對銀屑病大鼠皮損組織IL-17表達的影響 通過前面臨床皮膚形態(tài)及皮損病理改變，可以判定咪喹莫特聯(lián)用組明顯優(yōu)于單用組。因此，沒有檢測單用組大鼠皮損組織IL-17表達。

空白對照組大鼠皮膚組織中真皮層可見少量棕黃色區(qū)域，IL-17表達較少；咪喹莫特聯(lián)用組皮膚組織中表皮層及真皮層可見大量棕黃色區(qū)域，IL-17高表達；PA-J組皮膚組織中IL-17表達較低，見圖3。

圖3 大鼠背部皮損組織免疫組化（DAB染色×100）

與空白對照組比較，咪喹莫特聯(lián)用組IL-17總光密度值及陽性指數(shù)均明顯增高（P<0.01）；與聯(lián)用組比較，PA-J組IL-17總光密度值及陽性指數(shù)均明顯降低（P<0.01），見表4。

表4 對銀屑病大鼠皮損IL-17的影響 （±s）

表4 對銀屑病大鼠皮損IL-17的影響 （±s）

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與咪喹莫特聯(lián)用組比較，#P<0.01。

組別 劑量（m g/只） 總光密度（I O D） 陽性指數(shù)空白對照 - 1 9 1 3.7 5±1 2 4 7.8 4 0.0 0 2 1±0.0 0 1 4咪喹莫特聯(lián)用 - 7 0 0 8.4 1±3 5 7 6.5 5* 0.0 0 7 7±0.0 0 3 9*P A-J 0.5 2 7 7 2.1 3±1 8 1 9.0 0# 0.0 0 3 0±0.0 0 2 0#

3 討論

動物模型在藥物的研發(fā)中起著重要作用，目前銀屑病模型主要有基因工程、自發(fā)性、異種移植及藥物誘發(fā)等動物模型[8-9]，其中基因工程價格昂貴、建模較長；自發(fā)性突變鼠模型在治療上使用抗銀屑病藥物無法減輕其炎性細胞浸潤和缺乏T淋巴細胞表達等癥狀，極少使用[10]；異種移植比較接近人類銀屑病遺傳、表型和免疫變化，但對實驗技術(shù)要求高，限制其應(yīng)用[11]。藥物誘發(fā)模型，其操作簡單，經(jīng)濟易得，有重現(xiàn)性，在普通實驗室廣泛應(yīng)用。但其也存在著局限性，該模型為急性非特異性炎性反應(yīng)，除引起皮膚改變外，還引起全身性炎性反應(yīng)，與人類銀屑病的慢性炎癥性皮膚病存在一定的差異[12-13]。各種銀屑病模型均基于不同的致病機制，有其各自的特點和局限性，因此了解并建立不同類型的動物模型，有助于更合理的選擇，促進銀屑病發(fā)病機制的研究及治療藥物的研發(fā)。

IL-17是Th17細胞分泌的細胞因子，通過促炎性細胞因子及趨化因子的釋放，誘導(dǎo)炎性基因的表達，抑制角質(zhì)形成細胞表達黏附因子，破壞皮膚屏障，在銀屑病發(fā)病機制中起著重要作用[14]。大量研究表明銀屑病患者中IL-17水平明顯升高[15-16]。目前針對IL-17相關(guān)的生物制劑已經(jīng)開始應(yīng)用于臨床銀屑病的治療，并有良好的療效[17]。

實驗中發(fā)現(xiàn)單用咪喹莫特誘導(dǎo)大鼠銀屑病模型時，大鼠頸部及四肢處毛發(fā)出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，而聯(lián)合IFN-α使用時，癥狀消失。可能原因為咪喹莫特誘導(dǎo)激活毛囊周圍的Toll樣受體（TLR）7，致使生長期毛囊丟失免疫赦免而產(chǎn)生退化及萎縮[18]。而重組人干擾素-α-2a能夠調(diào)節(jié)機體免疫功能，改善脫毛癥狀，同時通過Th1和Th17介導(dǎo)的免疫應(yīng)答促進或加重銀屑病的發(fā)生[19]。本實驗采用咪喹莫特聯(lián)合IFN-α成功誘導(dǎo)銀屑病大鼠模型。在臨床方面，大鼠背部皮膚出現(xiàn)鱗屑、紅斑等臨床癥狀；在組織學(xué)方面，皮損病理觀察可見顆粒層變薄甚至消失、棘層肥厚、乳突上頂，真皮層大量炎性細胞浸潤等銀屑病樣特點；在發(fā)病機制方面，皮損組織中IL-17表達明顯升高。因此，該模型符合銀屑病的臨床及病理特點，是可靠、穩(wěn)定的銀屑病動物模型，可用于藥物的研發(fā)及病因機制的探索。