李影，于寧，易雪梅，丁楊峰，高蕓璐，陸家睛

（上海市皮膚病醫(yī)院，上海 200443）

吡格列酮屬于噻唑烷二酮類藥物，是過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome proliferatorsactivatedreceptors γ，PPARγ）的激動劑，不僅可以改善糖脂代謝，增加胰島素敏感性；而且可以抑制細(xì)胞增殖，下調(diào)炎性反應(yīng)[1]。近年來，臨床研究發(fā)現(xiàn)吡格列酮可以改善銀屑病患者的皮損癥狀[2-5]，但是，具體的機制尚不清楚。本文擬在體外采用不同濃度胰島素誘導(dǎo)人永生化角質(zhì)形成（HaCaT）細(xì)胞胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）模型，初步探討吡格列酮對HaCaT細(xì)胞IR的影響。

1.材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細(xì)胞 HaCaT細(xì)胞，購于中科院細(xì)胞庫。

1.1.2 實驗藥物 吡格列酮購于江蘇德源有限公司。

1.1.3 試劑和儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；青霉素-鏈霉素混合液（Biotopped）；DMSO（Thermo Fisher Scientific）；胎牛血清（美國 ORIGIN公司）；胰島素（北京索萊寶科技有限公司）；葡萄糖檢測試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；CCK-8試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）；96孔板（美國Corning公司）；AIRTECH超凈臺；IX71倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；SC3610型低速離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），酶標(biāo)儀（Thermo Scientific）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HaCaT細(xì)胞凍存于液氮冷藏系統(tǒng)中，使用時取出進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將取出的HaCaT細(xì)胞置于37℃的水浴中復(fù)蘇，在超凈臺中將離心沉淀后的細(xì)胞裝入含有DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素-鏈霉素混合液的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。在37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至70%～80%融合時進(jìn)行消化和傳代。

1.2.2 HaCaT細(xì)胞IR模型的建立 將胰島素母液稀釋為 10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L 5個濃度。取96孔板，將HaCaT細(xì)胞均勻接種于96孔板中，每列5個復(fù)孔作為一組，每組加入不同含濃度的胰島素和正常組。培養(yǎng)時間分別為12、24、36和48 h。培養(yǎng)結(jié)束后按照葡萄糖測試盒說明書操作，于酶標(biāo)儀中550 nm波長下檢測各組OD值，根據(jù)公式計算出細(xì)胞的耗糖量。

1.2.3 吡格列酮對HaCaT細(xì)胞活性的影響 取處于對數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞，在顯微鏡下計數(shù)1×105個/mL細(xì)胞接種至96孔板，每孔加100 μL細(xì)胞混懸液。培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁生長達(dá)到95%時，開始實驗。實驗分為正常組、實驗組，實驗組含不同濃度的吡格列酮（10、20、40、80、160 μmol/L）。36 h 后每孔加入含10%細(xì)胞計數(shù)方法（CCK-8）的培養(yǎng)基100 μL，避光培養(yǎng)1 h后用酶標(biāo)儀在波長為450 nm下檢測吸光度數(shù)據(jù)。

1.2.4 吡格列酮對IR HaCaT細(xì)胞葡萄糖消耗的影響 實驗分為正常組（正常細(xì)胞＋培養(yǎng)基）、IR組（IR細(xì)胞+培養(yǎng)基）和實驗組，實驗組含不同濃度的吡格列酮（10、20、40、80、160 μmol/L）。待 80%HaCaT 細(xì)胞貼壁后，實驗組、模型組加入含1×10-6mol/L胰島素溶液的培養(yǎng)基，正常組加入不含胰島素溶液的培養(yǎng)基，造模36 h后，對細(xì)胞進(jìn)行12 h的饑餓處理，按照不同處理方法作用細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，饑餓細(xì)胞8 h，每孔吸出2 μL培養(yǎng)基上清液加到新的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，另加入2 μL標(biāo)準(zhǔn)對照品，再加入葡萄糖測試工作液（R1、R2等量）于 37°C、5.0%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min，置于酶標(biāo)儀550 nm下檢測96孔板中上清液中的葡萄糖含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IR細(xì)胞模型 當(dāng)胰島素濃度為10-6mol/L，培養(yǎng)時間為36 h時，細(xì)胞的耗糖量最少，表明此時細(xì)胞對胰島素的敏感性降低，產(chǎn)生了IR，見圖1。

圖1 10-6mol/L胰島素不同作用時間下細(xì)胞葡萄糖消耗量

2.2 不同濃度吡格列酮對HaCaT細(xì)胞活性的影響 40 mol/L吡格列酮作用于細(xì)胞36 h，細(xì)胞存活率92.06%，見表1。

表1 不同濃度吡格列酮作用下細(xì)胞的存活率

2.3 不同濃度吡格列酮對IR HaCaT細(xì)胞葡萄糖消耗的影響 吡格列酮可以增加IR HaCaT細(xì)胞葡萄糖消耗，當(dāng)吡格列酮濃度160 μmol/L，作用36 h時，作用最明顯，見表2。

表2 不同濃度吡格列酮作用下IR HaCaT細(xì)胞葡萄糖消耗量 （±s）

表2 不同濃度吡格列酮作用下IR HaCaT細(xì)胞葡萄糖消耗量 （±s）

注：與正常組比較，*P＜0.001，與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.001。

組別 劑量（μmol/L） 葡萄糖耗糖量正常組 0 3.17±0.08模型組 0 2.26±0.06*吡格列酮濃度 10 2.32±0.04 20 2.35±0.03#40 2.52±0.04##80 2.68±0.08##160 2.79±0.09##

3 討論

IR是指胰島素對外周組織靶器官的作用減弱，葡萄糖攝取和利用效率降低，導(dǎo)致機體需要產(chǎn)生更多的胰島素來維持代謝。多項研究包括筆者的前期研究均表明銀屑病患者易于發(fā)生IR[6-8]。Karadag等[7]的研究顯示銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）與IR之間有關(guān)聯(lián)。Boehncke等[10]發(fā)現(xiàn)多個IR指標(biāo)如肥胖指數(shù)、血管壁厚度、胰島素分泌和脂肪細(xì)胞因子也與PASI有顯著的相關(guān)性。Buerger等[11]研究表明IR不僅促進(jìn)心血管合并癥的發(fā)生，而且促進(jìn)銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖和分化。上述研究證實銀屑病發(fā)病與IR密切相關(guān)，而且IR能夠影響角質(zhì)形成細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和銀屑病的發(fā)病機制[12]。但是，IR影響角質(zhì)形成細(xì)胞穩(wěn)態(tài)參與銀屑病發(fā)病的機制尚不清楚。因此，筆者嘗試在體外構(gòu)建IR角質(zhì)形成細(xì)胞模型，以便用于今后IR影響銀屑病發(fā)病機制的探討。

本實驗選取HaCaT細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，通過不同濃度胰島素刺激細(xì)胞，通過檢測對比葡萄糖濃度變化，推測葡萄糖代謝情況。當(dāng)胰島素濃度為10-6mol/L，培養(yǎng)時間為36 h時，模型組葡萄糖消耗降低，提示IR HaCaT細(xì)胞模型構(gòu)建成功。但是，目前關(guān)于誘導(dǎo)IR細(xì)胞的方法、藥物的選擇、作用濃度及時間都存在一定程度的差異，無法確定統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，而且IR的效果也不穩(wěn)定[13]。因此，將來需要進(jìn)一步摸索誘導(dǎo)相對穩(wěn)定的IR細(xì)胞模型的方法。

吡格列酮是噻唑烷二酮類藥物，作用于脂肪、肌肉、肝臟等靶器官的PPARγ，增強組織對胰島素的敏感性，改善IR。此外，吡格列酮可以抑制細(xì)胞增殖，下調(diào)炎性反應(yīng)。臨床研究中發(fā)現(xiàn)吡格列酮不僅可以改善銀屑病合并代謝綜合征患者的一些指標(biāo)如空腹血糖、三酰甘油水平、收縮壓、舒張壓、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平，而且減輕患者的疾病嚴(yán)重程度[14]。在銀屑病患者中，吡格列酮可以降低白細(xì)胞介素（IL）-2、C-反應(yīng)蛋白（CRP）等炎性因子的表達(dá)，減少皮膚炎性細(xì)胞的浸潤[15]。本研究發(fā)現(xiàn)吡格列酮可以減輕HaCaT細(xì)胞IR，改善角質(zhì)形成細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，為其治療銀屑病提供部分理論依據(jù)。但是，其治療銀屑病的機制仍需要深入探討。

綜上，本研究從體外細(xì)胞水平表明吡格列酮可以減輕細(xì)胞的IR。但是，本研究僅使用HaCaT細(xì)胞，未使用正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞（NHEK）。而且，關(guān)于吡格列酮改善IR的詳細(xì)機制未做進(jìn)一步探索，后續(xù)研究會進(jìn)一步完善。