史夢(mèng)婕，任章朋，張子京，林碧霞，林碧云 （.河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)4 53000；.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院，福建福州 35000；3.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東湛江 54000）

乳腺癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率穩(wěn)居高位，嚴(yán)重威脅女性的生命健康。在我國乳腺的發(fā)病率和死亡率逐年上升，且更加年輕化。60%～70%的乳腺癌屬于雌激素受體陽性（ER+）和孕激素受體陽性（PR+）的激素依賴型惡性腫瘤。近十幾年來以內(nèi)分泌治療藥物他莫昔芬（TAM）為代表的治療方案已經(jīng)明顯降低乳腺癌發(fā)病率，提高患者生存率，但在接受內(nèi)分泌治療的患者中，30%～40%患者出現(xiàn)耐藥并復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。目前的研究表明乳腺癌的耐藥與雌激素受體的缺失或突變、多種生長因子接到的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異?；钴S密切相關(guān)，但詳細(xì)的分子機(jī)制尚未闡明。本研究以乳腺癌耐藥細(xì)胞株T-47D 為研究對(duì)象，采用CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法分析黃連素（BBR）聯(lián)合TAM 對(duì)細(xì)胞的增殖遷移能力的影響及其分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本Espec），q-PCR 儀（roche lightcycle480），流式細(xì)胞儀。耐藥性乳腺癌細(xì)胞株T-47D（購自ATCC）；抗體（cst）；CCK-8（碧云天）。

1.2 方法

1.2.1 分組 根據(jù)不同藥物干預(yù)將乳腺癌細(xì)胞株T-47D分為4組，即陰性對(duì)照（NC）組，他莫昔芬5 μmol/L（TAM）組，黃連素50 μmol/L（BBR）組，他莫昔芬5 μmol/L+黃連素50 μmol/L聯(lián)合（TAM+BBR）組。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將人乳腺癌細(xì)胞株T-47D 細(xì)胞的凍存管從液氮罐里取出，迅速放入37 ℃水浴，快速搖動(dòng)促使溶液融化。待溶液完全融化后從水浴中取出凍存管，用酒精消毒凍存管表面后在凈工作臺(tái)打開凍存管，將含有細(xì)胞的凍存液轉(zhuǎn)移至5 mL 離心管中，1 000 r/min 離心10 min(最大轉(zhuǎn)速不超過1 500 r/min，以防損傷細(xì)胞)，去除含有DMSO 的上清液，用含有10%胎牛血清、100 mg/L 鏈霉素和100 U/mL 青霉素的完全培養(yǎng)基輕輕吹打混勻后用移液槍轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中。最后把接種到培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞用8 mL DMEM 完全培養(yǎng)基稀釋，輕輕吹打均勻后，37 ℃，含5%CO2溫箱中培養(yǎng)。

1.2.3 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的T-47D 細(xì)胞，以每孔種5 000 個(gè)細(xì)胞種于96 孔板中放入培養(yǎng)箱內(nèi)；待細(xì)胞貼壁后加入藥物作用，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔；48 h后去除藥物后，加入CCK-8 工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用），放入培養(yǎng)箱孵育2～3 h；450 nm 波長測(cè)量吸光值；計(jì)算細(xì)胞的增殖能力。3 次單獨(dú)重復(fù)試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)應(yīng)的抑制率的計(jì)算公式為：抑制率=[(OD實(shí)驗(yàn)組－OD對(duì)照組)/OD對(duì)照組]×100%。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的T-47D細(xì)胞，以8×105個(gè)接種于6孔板中，待貼壁后用10 μL的tip沿標(biāo)記好的方向用力均勻地劃出相應(yīng)的劃痕，加入相應(yīng)藥物作用，48 h拍照保留數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。四次單獨(dú)重復(fù)試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果，遷移抑制率的計(jì)算公式為：遷移抑制率=[|(面積實(shí)驗(yàn)組－面積對(duì)照組)|/面積對(duì)照組]×100%

1.2.5 平板單克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的T-47D 細(xì)胞，以每孔100 個(gè)細(xì)胞種于6 孔板中，加培養(yǎng)液至3 mL，放入培養(yǎng)箱；待細(xì)胞貼壁后加入藥物作用，3 d換一次液；培養(yǎng)14～17 d 后取出6 孔板，加細(xì)胞固定液2 mL 固定細(xì)胞20 min；三蒸水沖洗，加結(jié)晶紫染色15 min；三蒸水洗干凈，晾干；計(jì)數(shù)肉眼可見紫色染色點(diǎn)。

1.2.6 流式細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的T-47D細(xì)胞，以106個(gè)細(xì)胞接種于60 mm的培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁后加入藥物作用，48 h 后收集細(xì)胞，用70%的酒精固定，PI染色后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.7 Western blot 實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的T-47D 細(xì)胞，以106個(gè)細(xì)胞接種于60 mm 的培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁后加入藥物作用，48 h 后收集細(xì)胞提取蛋白，加入loading buffer 變性并配平濃度，95 ℃變性5 min，5%濃縮膠，10%分離膠，用80 V 電泳30 min 后轉(zhuǎn)成120 V 繼續(xù)電泳60 min，然后取出以300 mA，2 h進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；完成后進(jìn)行5%脫脂奶粉封閉，一抗孵育2 h、TBST 洗滌，二抗孵育1 h、TBST 洗滌，進(jìn)行曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0進(jìn)行分析，3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示，多組檢驗(yàn)用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與NC 組比較，TAM 組、BBR 組與TAM+BBR 組對(duì)乳腺癌細(xì)胞T-47D 細(xì)胞增殖率均明顯降低(P＜0.01)，以TAM+BBR組最為顯著(P＜0.01)，見圖1。

圖1 各組對(duì)乳腺癌T-47D細(xì)胞增殖率的影響

2.2 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與NC 組比較，TAM 組、BBR 組與TAM+BBR 組對(duì)乳腺癌細(xì)胞T-47D 細(xì)胞遷移的抑制率均明顯增高(P＜0.01)，以TAM+BBR組最為顯著(P＜0.01)，見圖2。

圖2 各組對(duì)乳腺癌T-47D細(xì)胞遷移能力的影響

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

與NC 組比較，TAM 組、BBR 組與TAM+BBR 組對(duì)乳腺癌細(xì)胞T-47D 細(xì)胞周期阻滯率均明顯增高(P＜0.01)，以TAM+BBR組最為顯著(P＜0.01)，見圖3。

圖3 各組對(duì)乳腺癌T-47D細(xì)胞周期G1的影響

2.4 western blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與NC組比較，TAM組、BBR組與TAM+BBR組對(duì)p-AKT/AKT、p-AMPK/AMPK 的表達(dá)量均明顯增高(P＜0.05 或0.01)，以TAM+BBR 組最為顯著(P＜0.01)，見圖4。

圖4 各組對(duì)乳腺癌T-47D細(xì)胞中p-AKT、p-AMPK蛋白表達(dá)量的變化

3 討論

TAM 是一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，由于TAM 效應(yīng)結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈和ER受體的351位氨基酸結(jié)構(gòu)相似[1-3]。因此，TAM 通過競爭結(jié)合細(xì)胞核內(nèi)的雌激素受體，引起構(gòu)象改變，阻礙共活化劑的綁定，進(jìn)而減少雌激素相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[4-6]，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。臨床上約30%～40%乳腺癌患者在接受TAM 治療后出現(xiàn)耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，這是臨床上治療乳腺癌遇到的大難題，也大幅度降低了乳腺癌患者的生存周期。在TAM 耐藥乳腺癌中Hh 通路的異常激活受到PI3K/AKT 通路的調(diào)節(jié)，而且在內(nèi)分泌治療耐藥的乳腺癌中PI3K/AKT 過度激活[7]。PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路是整合細(xì)胞外各種信號(hào)的共同通路，參與多種細(xì)胞生理活動(dòng)，如細(xì)胞代謝、蛋白合成、細(xì)胞生存與增殖、血管新生及免疫功能等[8]。PI3K/AKT 通路是整合細(xì)胞外生長因子受體信號(hào)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路，在細(xì)胞代謝、生長和存活以及糖類代謝、胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸及血管形成的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[9]。PI3K 催化亞基的突變或者基因的擴(kuò)增，下游靶點(diǎn)AKT 的擴(kuò)增，上游受體（HER-2）的增多，PI3K/AKT通路的負(fù)調(diào)控因子PTEN基因丟失等都是這一通路在癌細(xì)胞中異常激活的關(guān)鍵因素，且這些因子的異常表達(dá)或激活與乳腺癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[10-12]。

植物中提取的純天然抗腫瘤化合物是抗癌新藥開發(fā)的重要手段之一。研究發(fā)現(xiàn)中藥中許多單體成分具有抗腫瘤活性，如黃連素可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖遷移等活性。黃連素是一種常見的草本科異喹啉類生物堿，許多研究顯示黃連素在抗腫瘤方面有積極作用，能誘導(dǎo)乳腺癌、肺癌、腸癌、肝癌細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤增殖，還能和細(xì)胞毒性藥物如長春新堿、伊立替康聯(lián)用具有協(xié)同作用，且可降低腫瘤的耐藥作用[13-14]。在乳腺癌中黃連素可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT 通路抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[15]。黃連素不僅抑制細(xì)胞生長的周期蛋白從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，也作用于胞質(zhì)中相關(guān)通路的關(guān)鍵蛋白并發(fā)揮抗腫瘤作用，如抑制Ras、Raf、MER-K 和PI3K 等關(guān)鍵蛋白活性而降低PI3K/AKT 和MAPK 通路信號(hào)傳導(dǎo)功能。黃連素還能作用于EGFR、HER-2 等相關(guān)受體而抑制細(xì)胞的生長，而內(nèi)分泌耐藥的乳腺癌患者與其EGFR 被異常激活進(jìn)一步激活PI3K/AKT有著潛在的關(guān)系[16]。

本課題通過研究黃連素與TAM 共同作用對(duì)TAM 耐受的乳腺癌細(xì)胞株的影響進(jìn)而闡述其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。本研究過程中通過CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TAM 和BBR 單獨(dú)作用于T-47D 細(xì)胞時(shí)其增殖率明顯低于對(duì)照組，且以兩種藥物聯(lián)合的效果更為顯著，說明在藥物TAM 和BBR 聯(lián)合作用下可抑制細(xì)胞的增殖能力。通過劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)TAM 和BBR 單獨(dú)作用于T-47D 細(xì)胞時(shí)其遷移抑制率高于對(duì)照組，以聯(lián)合藥物組更為顯著，證明了兩種藥物的聯(lián)合作用抑制細(xì)胞遷移能力強(qiáng)于單獨(dú)作用時(shí)抑制遷移能力。通過流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)分析驗(yàn)證了兩種藥物單獨(dú)或聯(lián)合作用都會(huì)將細(xì)胞阻滯在G1 期，其中兩種藥物聯(lián)合作用時(shí)G1期的阻滯效果相對(duì)于兩種藥物單獨(dú)作用時(shí)的更強(qiáng)；通過western blot 檢測(cè)了p-AKT 與p-AMPK 的表達(dá)量時(shí)，TAM+BBR 組對(duì)p-AKT/AKT、p-AMPK/AMPK的表達(dá)量均明顯增高(P＜0.05 或0.01)，以TAM+BBR 組最為顯著(P＜0.01)，說明兩種藥物聯(lián)合作用時(shí)上調(diào)p-AMPK 和p-AKT 的表達(dá)效果比兩種單獨(dú)藥物作用時(shí)更有好。

通過以上實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)BBR 與TAM 具有協(xié)同作用。BBR 可以提高TAM 耐受細(xì)胞對(duì)TAM 的敏感性，進(jìn)而達(dá)到抑制細(xì)胞增殖和遷移的作用，將更多的細(xì)胞阻滯在G1 期，上調(diào)p-AMPK 和p-AKT 的表達(dá)。并且BBR 作為成熟的中成藥用于臨床治療，本研究可為臨床TAM 耐受型乳腺癌治療提供新的方案與理論支持。