黃芳芳，吳銳劍，李曉玲，林浩雯，邱 琴，林柏忻，黃宇戈，羅連響 （廣東醫(yī)科大學(xué).研究生院；.實驗動物中心；.第一臨床學(xué)院；.附屬醫(yī)院；5.海洋醫(yī)藥研究院，廣東湛江50）

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種細胞及細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，伴有可變的氣流受限和氣道高反應(yīng)性[1]。據(jù)估計，全球約有3 億人患有哮喘[2]。糖皮質(zhì)激素是目前控制哮喘氣道炎癥最有效的藥物，慢性持續(xù)期哮喘以吸入為首選給藥途徑[1,3]，但由于吸入糖皮質(zhì)激素治療依從性差等原因，目前哮喘控制率仍較低。而且長期高劑量吸入糖皮質(zhì)激素可出現(xiàn)全身不良反應(yīng)（如腎上腺皮質(zhì)軸抑制、骨質(zhì)疏松等[1]），因此急需尋求治療哮喘的藥物和方法。

中醫(yī)藥治療哮喘已有悠久的歷史，在治療哮喘的經(jīng)典名方（如定喘湯、麻杏石甘湯、麻黃湯等）中，紫蘇子和杏仁常作為君藥或臣藥使用，兩者均具有降氣化痰、止咳平喘、潤腸通便的功效[4-5]，可對哮喘的治療起到一定的作用。目前有研究表明，紫蘇子-杏仁藥對是今方中治療支氣管哮喘支持度前十的高頻藥對[6]。然而，現(xiàn)有關(guān)于紫蘇子-杏仁藥對的研究仍較少，對其作用機制的研究也局限于方劑或者單藥，故紫蘇子-杏仁藥對治療哮喘的作用機制尚未明了。作為一門新興學(xué)科，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已被廣泛用于研究中藥治療疾病潛在的分子機制。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探討紫蘇子-杏仁藥對治療哮喘的作用及機制，為紫蘇子-杏仁藥對治療哮喘的研究方法提供新思路。

1 材料和方法

1.1 紫蘇子-杏仁藥對有效活性成分收集及靶點預(yù)測

采用TCMSP[7]數(shù)據(jù)庫（TCMSP 2.3，http://tcmspw.com/tcmsp.php，中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺）檢索紫蘇子和杏仁的有效活性成分，以口服生物利用度（0B）＞30%、類藥性（DL)＞0.18 為篩選原則篩選出符合條件的有效活性成分，然后將其靶點輸入STRING[8]數(shù)據(jù)庫（STRING 11.0，https://string-db.org/）中，把靶點名稱(protein name)轉(zhuǎn)換為基因名(gene name)。

1.2 紫蘇子-杏仁藥對治療哮喘候選靶點的收集和篩選

在Genecards[9]數(shù) 據(jù) 庫（Genecards 4.12，https://www.genecards.org/）的關(guān)鍵詞搜索功能中輸入Asthma，選擇疾病相關(guān)Genes，與上述經(jīng)STRING 轉(zhuǎn)換的靶點基因名進行匹配，得到紫蘇子-杏仁藥對的候選作用靶點。然后在STRING 數(shù)據(jù)庫的Multiple proteins 搜索功能中輸入候選作用靶點名稱，根據(jù)得到的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜程度調(diào)整Settings 中的“minimum required interaction score”，保證網(wǎng)絡(luò)的可讀性。最后把獲得的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)保存為TSV格式。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

從STRING 數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)出蛋白互作網(wǎng)絡(luò)文件中的node1、node2 進行整合去重，得到的基因靶點及其所屬有效活性成分，把有效活性成分所屬的藥物信息導(dǎo)入Cytoscape（Cytoscape 3.7.2）軟件中構(gòu)建“藥物-有效活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)。然后把STRING 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)文件中的node1，node2 和combined score 另外導(dǎo)入Cytoscape 軟件中得到初始蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，用工具Network Analyzer對該網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，主要根據(jù)結(jié)果中的自由度(Degree)值的大小篩選出核心靶點，最后構(gòu)建核心靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析

利用DAVID[10]數(shù)據(jù)庫（DAVID 6.8，https://david.ncifcrf.gov/）對紫蘇子-杏仁藥對作用于哮喘的預(yù)測靶點進行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，以P＜0.05為截點，獲得顯著富集的信號通路。

2 結(jié)果

2.1 紫蘇子-杏仁藥對的有效活性成分及其預(yù)測靶點信息

將紫蘇子和杏仁輸入TCMSP 數(shù)據(jù)庫進行分析，以O(shè)B＞30%和DL＞0.18 作為條件，篩選得到紫蘇子中有效活性成分16個，杏仁中有效活性成分17個，其中4 個有效活性成分無靶點。進一步篩選后得到紫蘇子中有效活性成分14 個，杏仁中有效活性成分15個，共461 個靶點，重復(fù)靶點只保留1 個，去重后兩者共有靶點為179 個（見表1）。把靶點輸入STRING 數(shù)據(jù)庫，限定研究物種為“Homo sapiens(Human)”，使靶點得以成功轉(zhuǎn)換。通過與Genecards 數(shù)據(jù)庫中與Asthma相關(guān)的基因進行比對，篩選得出135個候選靶點與該疾病有關(guān)。

表1 紫蘇子-杏仁藥對中有效活性成分及其OB和DL值

2.2 紫蘇子-杏仁藥對治療支氣管哮喘核心靶點的篩選

將上述得到的135 個靶點輸入STRING 數(shù)據(jù)庫，設(shè)定研究物種為“Homo sapiens”，得到初始蛋白質(zhì)互作關(guān)系，將此數(shù)據(jù)和相關(guān)活性成分的信息導(dǎo)入Cytoscape軟件中構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，見圖1。進一步設(shè)置“minimum required interaction score”為0.97，可篩選得到72個靶點及其參與的蛋白質(zhì)互作關(guān)系，把72 個靶點及其關(guān)聯(lián)的“combined score”另外導(dǎo)入Cytoscape 軟件中得到初始蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，用NetworkAnalyzer 對其進行分析，構(gòu)建出核心靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，見圖2。

2.3 網(wǎng)絡(luò)分析

圖1為“紫蘇子杏仁—活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)，其中共有167個節(jié)點，464條邊，節(jié)點代表活性成分或作用靶點（綠色菱形節(jié)點代表紫蘇子和杏仁活性成分，黃色菱形節(jié)點代表紫蘇子和杏仁的共有活性成分，粉色橢圓節(jié)點代表作用靶點），藍色邊代表活性成分和作用靶點間的相互關(guān)系（共293 條），橙色邊代表靶點之間的相互作用關(guān)系（共171條）。圖2為核心靶點的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點代表蛋白，邊代表蛋白間的相互關(guān)系，共涉及72 個節(jié)點，171 條邊。節(jié)點的大小代表Degree 值的大小，顏色深淺代表directed Edges 值的大小。節(jié)點越大代表Degree 值越大，顏色由綠變紅對應(yīng)的directed Edges 值越大。邊的粗細代表Edge Betweenness 值的大小，邊越粗Betweenness值越大。

圖1 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

圖2 紫蘇子-杏仁藥對核心靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析

2.4.1 GO 富集分析 將篩選后的72 個靶點蛋白導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫中進行GO 富集分析，結(jié)果包括GOBP（生物過程）、GO-MF（分子功能）和GO-CC（細胞組分）分析。GO-BP 富集結(jié)果共有426 個條目，根據(jù)顯著性前10的富集結(jié)果作圖，見圖3，包括：凋亡過程的負調(diào)控、對藥物的反應(yīng)、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、對雌二醇的反應(yīng)、缺乏配體的外在凋亡信號通路、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，DNA 模板、肝再生、對抗生素的反應(yīng)、成纖維細胞增殖的正調(diào)控以及細胞增殖的正調(diào)控。GO-MF富集結(jié)果共有121個條目，根據(jù)顯著性前10 的富集結(jié)果作圖，見圖4，包括：酶結(jié)合、蛋白質(zhì)均二聚活性、藥物結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚活性、腎上腺素結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)劑活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、BH3 域綁定。GO-CC 富集結(jié)果共有55 個條目，根據(jù)顯著性前10 的富集結(jié)果作圖，見圖5，包括：核、核質(zhì)、胞質(zhì)溶膠、蛋白質(zhì)復(fù)合物、細胞質(zhì)、細胞外空間、膜筏、線粒體、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物、細胞質(zhì)核周區(qū)域。見表2。

表2 GO富集分析結(jié)果

圖3 GO富集分析的生物過程

圖4 GO富集分析的分子功能

圖5 GO富集分析的細胞組分

2.4.2 KEGG 通路富集分析 用DAVID 數(shù)據(jù)庫進行KEGG 通路富集分析，共得到99 條信號通路，經(jīng)篩選后得到相關(guān)通路55 條，并以氣泡圖的形式直觀表示這些通路,見圖6。氣泡圖中節(jié)點的顏色代表P值的大小，顏色從紅色到黃色反映P值從小到大；節(jié)點的大小代表相關(guān)基因的數(shù)量，節(jié)點從小到大反映相關(guān)基因的數(shù)量從少到多。其中，與哮喘顯著相關(guān)的通路主要有7 條,包括PI3K-Akt 信號通路、TNF 信號通路、FoxO 信號通路、P53 信號通路、HIF-1 信號通路、T 細胞受體信號通路以及VEGF信號通路，見表3。

表3 KEGG通路富集分析中與哮喘顯著相關(guān)的通路

圖6 KEGG通路富集圖

3 討論

中藥具有多成分、多靶點、多途徑協(xié)同作用的特性，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有與中醫(yī)相似的整體哲學(xué)，其在基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，通過分析現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫的信息資料，利用專業(yè)網(wǎng)絡(luò)分析軟件和算法，系統(tǒng)的、整體的從網(wǎng)絡(luò)角度去描述生物系統(tǒng)，藥物和疾病之間的復(fù)雜性，對于探索藥物-疾病之間的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)藥物靶標，明確藥物治療疾病的機制具有重要指導(dǎo)價值[11-12]。紫蘇子和杏仁作為我國傳統(tǒng)中藥，均具有止咳平喘、潤腸通便的功效，是治療哮喘的常用中藥。因此，本研究以兩者的配伍為研究對象，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探討其治療支氣管哮喘的作用機制，為后續(xù)實驗研究提供理論依據(jù)。

“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)顯示，雌酮、木犀草素、花生四烯酸、β-谷固醇、豆甾醇的靶點數(shù)較多，為紫蘇子-杏仁藥對治療哮喘的關(guān)鍵有效活性成分。有研究表明，木犀草素能有效地降低卵清蛋白（OVA）致敏小鼠的支氣管收縮和氣道高反應(yīng)性[13]。β-谷固醇可使OVA 致敏小鼠或豚鼠支氣管肺泡灌洗液中白細胞和嗜酸性粒細胞減少，減輕氣道炎癥，并能減輕肺組織炎癥細胞浸潤，減少氣道重塑過程中杯狀細胞增生和黏液產(chǎn)生[14-15]。豆甾醇能顯著降低OVA 致敏豚鼠血液中嗜酸性粒細胞的數(shù)量以及血清OVA 特異性免疫球蛋白E（OVA sIgE）的水平，并能逆轉(zhuǎn)炎癥細胞在肺組織的浸潤[16]。綜上所述，紫蘇子-杏仁藥對可能通過減輕氣道炎癥，抑制氣道重塑，降低氣道高反應(yīng)性來發(fā)揮治療哮喘的作用。

KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，主要有7 條通路與哮喘顯著相關(guān)。PI3K-Akt 信號通路是本次富集結(jié)果中最顯著富集的通路。有研究表明，PI3K-Akt信號通路在哮喘氣道重塑中起著關(guān)鍵作用[17]，通過抑制PI3K/AKT信號通路可抑制氣道上皮細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），從而抑制氣道重塑[18]。PI3K/Akt還可通過調(diào)節(jié)由HIF-1a 活性介導(dǎo)的VEGF 表達來調(diào)節(jié)氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性，有研究表明，可通過抑制PI3K/Akt/mTOR/HIF-1a/VEGF 通路來減輕過敏性氣道炎癥[19-20]。此外，TNF、p53、TCR、VEGF 等信號通路也在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。TNF 信號通路與氣道炎癥有關(guān)，TNF-TNFR2 信號的激活可通過抑制Th2 和Th17 細胞分化而減輕氣道炎癥[21]。氣道上皮細胞中整合素β4（ITGB4）缺乏可通過激活p53 途徑誘導(dǎo)氣道上皮細胞衰老，影響哮喘的發(fā)生和發(fā)展[22-23]。TCR 信號通路與T輔助細胞分化有關(guān)，其信號傳導(dǎo)的強度是決定Th1 和Th2 CD4+T 細胞分化的重要因素[24]。VEGF 信號通路在氣道血管生成中起重要作用，氣道血管生成可提示哮喘中發(fā)生的特定血管結(jié)構(gòu)重塑。研究表明，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）可通過激活VEGF 信號傳導(dǎo)來介導(dǎo)氣道平滑肌（ASM）細胞的促進血管生成的能力[25]。

綜上，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)紫蘇子-杏仁藥對可通過多成分、多靶點、多通路治療哮喘，但由于本研究主要依托數(shù)據(jù)庫信息，需通過實驗研究對結(jié)果進行進一步深入驗證。