戴中亮，田 迪，張洪研，高文莉，林 苗，宋意鋒，田 雅，邢燕梅（暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，深圳市人民醫(yī)院麻醉科，廣東深圳 518020）

細(xì)胞焦亡是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的一種新的程序性細(xì)胞死亡方式，內(nèi)源性和外源性刺激信號(hào)通過(guò)不同途徑作用于炎性小體而激活caspase-1，介導(dǎo)細(xì)胞滲透性腫脹破裂，形成細(xì)胞膜小孔，胞內(nèi)物質(zhì)(如乳酸脫氫酶等)流出，IL-1β、IL-18前體裂解并誘導(dǎo)其他炎性因子、黏附分子等的合成和釋放，放大局部和全身炎癥反應(yīng)是細(xì)胞焦亡發(fā)生的主要機(jī)制［1-3］。丙泊酚（propofol，BBF）作為臨床上應(yīng)用最為廣泛的麻醉藥物之一，對(duì)機(jī)體的影響是復(fù)雜多樣的。有研究已經(jīng)證明BBF 可以介導(dǎo)巨噬細(xì)胞通過(guò)NOD 樣受體家族核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（NOD-like receptor family，pyrin domain containing 3，NLRP3）炎癥小體激活發(fā)生胱天蛋白酶-1（caspase1）依賴的炎癥性死亡，即焦亡[4]。

麻醉過(guò)程中的腦保護(hù)是近幾年麻醉專業(yè)研究的熱門(mén)問(wèn)題。小膠質(zhì)細(xì)胞作為神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞，是人們研究腦保護(hù)和神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的重點(diǎn)研究對(duì)象。線粒體產(chǎn)生的活性氧（ROS）[5-8]和線粒體自噬[9-11]和NLRP3 炎癥小體的激活密切相關(guān)。因此本研究探討B(tài)BF暴露對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞ROS、線粒體自噬和焦亡的影響，旨在為BBF麻醉過(guò)程中的腦保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系和藥物

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)，產(chǎn)品貨號(hào)0356，以體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。BBF 購(gòu)自Sigma生物技術(shù)有限公司，批次D126608。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

熒光倒置顯微鏡（德國(guó)Leica），生物安全柜（蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司），低溫離心機(jī)（濟(jì)南云騰醫(yī)療器械有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組給藥 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和BBF 組兩大組，對(duì)照組在BBF 給藥的同時(shí)更換空白培養(yǎng)基，BBF組用250 μmol/L的BBF暴露3 h，每組6個(gè)重復(fù)樣本。

1.3.2 線粒體膜電位（MMP）的檢測(cè) MMP 檢測(cè)試劑盒(JC-1)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)為C2006。BV2細(xì)胞BBF暴露以后根據(jù)試劑盒提示，JC-1工作液37 ℃避光孵育20 min以后收集樣本進(jìn)行檢測(cè)。陽(yáng)性對(duì)照組即CCCP組，在JC-1工作液處理之前以10 μmol/L(DMEM 培養(yǎng)基稀釋)CCCP 處理細(xì)胞40 min。在熒光倒置顯微鏡下攝片，用Image J 統(tǒng)計(jì)熒光強(qiáng)度。

1.3.3 線粒體活性氧（mito-ROS）的檢測(cè) MitoSOX購(gòu)自Invitrogen 公司，貨號(hào)M36008。BV2 細(xì)胞BBF暴露以后根據(jù)說(shuō)明書(shū)提示，MitoSOX 染料用HBSS 緩沖液稀釋至5 μmol/L，37 ℃避光孵育10 min 以后收集樣本進(jìn)行檢測(cè)。在熒光倒置顯微鏡下攝片，用Image J統(tǒng)計(jì)熒光強(qiáng)度。

1.3.4 線粒體呼吸鏈復(fù)合物I酶活性的檢測(cè) Complex I Enzyme Activity Microplate Assay 試劑盒購(gòu)自Abcam 公司，貨號(hào)ab109720。BV2 細(xì)胞BBF 暴露以后根據(jù)試劑盒步驟提示處理樣本，實(shí)驗(yàn)操作結(jié)束以后用Dipstick掃描儀檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度。

1.3.5 免疫印跡試驗(yàn) Western bloting 檢 測(cè)LC3B（abcam，ab192890）、p62（abcam，ab109012）、COX4I1（abcam，ab33985）、cathepsin B（abcam，ab214428）、NLRP3（CST，#15101）、ASC（CST，#67824）、caspase1（abcam，ab179515）、GSDMD（abcam，ab 209845）、IL-1β（abcam，ab234437）和GAPDH（abcam，ab8245）的表達(dá)。BV2 細(xì)胞BBF 暴露以后，收集細(xì)胞蛋白備用。沉淀蛋白用BCA 試劑盒(酶標(biāo)儀562 nm)進(jìn)行定量。經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5% BSA 封閉，一抗(Cytochrome C 1∶5 000;其余一抗1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜(12～14 h)，HRP 標(biāo)記的二抗(GAPDH 用山羊抗小鼠IgM 1∶5 000；其余蛋白用山羊抗兔IgG 1∶5 000)室溫1 h孵育，化學(xué)凝膠成像儀檢測(cè)成像，最后Image J統(tǒng)計(jì)信號(hào)強(qiáng)度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析，如方差齊性選用LSD 分析，如方差不齊選用Dunnett’s T3分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BBF暴露介導(dǎo)BV2細(xì)胞線粒體損傷

MMP 檢測(cè)結(jié)果顯示，BBF 處理后的BV2 細(xì)胞MMP 明顯下降，GFP 熒光強(qiáng)度明顯增加（P＜0.01），RFP 熒光強(qiáng)度明顯降低（P＜0.01），見(jiàn)圖1。Mito-ROS結(jié)果顯示，BBF 處理后的BV2 細(xì)胞Mito-ROS 生成顯著增加（P＜0.01），見(jiàn)圖2。線粒體ComplexI酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，BBF 處理后的BV2 細(xì)胞ComplexI酶活性受到顯著抑制（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖1 BBF暴露降低BV2細(xì)胞的MMP

圖2 BBF暴露促進(jìn)BV2細(xì)胞Mito-ROS的生成

圖3 BBF暴露降低BV2細(xì)胞的線粒體復(fù)合物I的酶活性（n=6）

2.2 BBF暴露抑制BV2細(xì)胞線粒體自噬

免疫印跡結(jié)果顯示，BBF 處理以后BV2 細(xì)胞的蛋白p62（P＜0.01）和COX4I1（P＜0.05）的表達(dá)明顯增加，LC3BⅡ/I的比值明顯降低（P＜0.05），Cathepsin B重鏈的表達(dá)明顯增加（P＜0.01），Cathepsin B輕鏈的表達(dá)明顯減少（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 BBF暴露抑制BV2細(xì)胞的線粒體自噬（n=6）

2.3 BBF暴露介導(dǎo)BV2細(xì)胞焦亡

免疫印跡結(jié)果顯示，BBF 處理以后BV2 細(xì)胞的蛋白NLRP3（P＜0.01）和ASC（P＜0.05）的表達(dá)顯著增加，caspase1 和GSDMD 剪切帶的表達(dá)顯著增加（P＜0.01），白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1，IL-1β）的剪切（P＜0.05）和分泌（P＜0.01）均顯著增加。見(jiàn)圖5。

圖5 BBF暴露介導(dǎo)BV2細(xì)胞通過(guò)NLRP3/ASC炎癥小體激活發(fā)生caspase1依賴的焦亡（n=6）

3 討論

線粒體在細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)中起著非常關(guān)鍵的作用，能夠?yàn)榧?xì)胞的正?；顒?dòng)提供能量，對(duì)細(xì)胞的壽命起著決定性的作用[12]。眾所周知，自噬是消除受損或多余的線粒體的主要機(jī)制，稱為線粒體自噬[13]。而自噬通量障礙被認(rèn)為是線粒體功能損傷，或者線粒體質(zhì)量差的主要貢獻(xiàn)者之一。而自噬通量障礙的兩個(gè)關(guān)鍵因素是自噬小體的形成和物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)[14-16]。因此本研究檢測(cè)了線粒體損傷相關(guān)的指標(biāo)（包括MMP、mito-ROS、ComplexI酶活性）、線粒體自噬相關(guān)的指標(biāo)（包括自噬標(biāo)志蛋白LC3B、SQSTM1/p62、COX4I1）以及自噬過(guò)程中與溶媒體功能相關(guān)的酶。

本研究結(jié)果顯示，250 μmol/L的BBF處理可以導(dǎo)致BV2 細(xì)胞MMP 下降（P＜0.01），ComplexI酶活性下降（P＜0.01），mito-ROS 顯著增加（P＜0.01），線粒體功能受到損傷；同時(shí)，LC3B Ⅱ/I 的比值明顯下降，COX4I1 和自噬底物蛋白p62 的表達(dá)明顯增加，提示BBF 暴露導(dǎo)致線粒體自噬流阻滯。Cathepsin B 是自噬降解途徑中研究最廣泛的一種酶，與溶酶體降解功能息息相關(guān)[17-18]。BBF暴露后Cathepsin B-p44的顯著增加和Cathepsin B-p24的顯著減少，提示溶酶體的降解功能明顯受到抑制。上面結(jié)果共同證明BBF 可以抑制線粒體自噬。

線粒體自噬可以減少線粒體氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞應(yīng)激[19]。自噬作為真核生物細(xì)胞遭遇各種應(yīng)激壓力時(shí)發(fā)生的一種基本應(yīng)答方式，參與細(xì)胞的多種生命活動(dòng)，使細(xì)胞在各種應(yīng)激條件下維持一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。BBF暴露使得小膠質(zhì)細(xì)胞的自噬受到抑制，損傷或多余的細(xì)胞器清除障礙，毒性物質(zhì)蓄積，細(xì)胞的正常生理活動(dòng)受到影響，必然會(huì)衍生出一系列的病理情況出現(xiàn)，例如炎癥小體的異常激活。NLRP3炎癥小體是生物體內(nèi)防御病原微生物的固有免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分[20]。NLRP3炎癥小體通過(guò)激活caspase-1，從而促進(jìn)IL-1β 和白細(xì)胞介素-18（interleukin-18，IL-18）等促炎細(xì)胞因子的成熟和分泌，繼而介導(dǎo)炎癥的發(fā)生[21]。自噬能夠負(fù)向或正向調(diào)控NLRP3 炎癥小體的激活；同時(shí)NLRP3 炎癥小體也會(huì)逆向影響自噬的作用。ROS主要來(lái)源于線粒體[22]，當(dāng)線粒體內(nèi)膜上的電子傳遞鏈被破壞時(shí)，ROS 會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積累，當(dāng)達(dá)到一定水平時(shí)會(huì)產(chǎn)生毒性，是NLRP3 炎性小體激活過(guò)程中重要的一環(huán)，并且起著正向促進(jìn)作用[23]。

有研究證明BBF可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞通過(guò)NLRP3/ASC 途徑發(fā)生caspase1依賴的焦亡[24-26]。因此本研究對(duì)BBF 暴露后BV2 細(xì)胞的焦亡情況進(jìn)行了檢測(cè)，以期能夠在小膠質(zhì)細(xì)胞上得到進(jìn)一步的驗(yàn)證。結(jié)果證明BBF 暴露后，BV2 細(xì)胞確實(shí)通過(guò)NLRP3/ASC 途徑發(fā)生焦亡，caspase1和GSDMD的活性剪切增加（均P＜0.01），IL-1β的剪切和分泌均增加（P＜0.05）。

本研究結(jié)結(jié)果同時(shí)證明BBF 可以抑制線粒體自噬，損傷線粒體功能，促進(jìn)ROS 生成，而自噬和ROS均是與NLRP3炎癥小體激活密切相關(guān)的因素，而NLRP3 炎癥小體激活又證明可以活性剪切caspase1，促進(jìn)焦亡終端標(biāo)志GSDMD和IL-1β的剪切。

通過(guò)本研究，我們初步得出以下結(jié)論：BBF 可以通過(guò)抑制線粒體自噬，導(dǎo)致受傷或者多余的線粒體清除障礙，BV2 細(xì)胞線粒體整體功能受損，ROS 生成增加，NLRP3/ASC 炎癥小體激活，caspase1 活性剪切增加，其下游的GSDMD 和IL-1β 活性剪切增加，活性GSDMD 在細(xì)胞膜打孔，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損，大量剪切的IL-1β分泌到細(xì)胞外，形成炎性環(huán)境，BV2細(xì)胞腫脹破裂發(fā)生炎癥性死亡。同時(shí)細(xì)胞的這種死亡方式會(huì)逆向影響線粒體自噬，形成惡性循環(huán)。當(dāng)然BBF 對(duì)自噬和焦亡的調(diào)節(jié)的具體過(guò)程還需要進(jìn)一步確認(rèn)，這是目前本研究存在的缺陷，有待在以后的研究中加以修正。