年媛媛，劉曉紅，孟憲梅，武 勇，陳洪鎖，江振宇，鄭連生

包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，內(nèi)蒙古 包頭 014030

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)是指胃或十二指腸內(nèi)容物反流至食管引起一系列不適癥狀或并發(fā)癥的一種疾病，是消化系統(tǒng)常見(jiàn)慢性病，還涉及呼吸系統(tǒng)、耳鼻喉科、口腔科等多器官，GERD病程遷延，很多患者需長(zhǎng)期、甚至終身服藥治療，給患者身心健康帶來(lái)嚴(yán)重影響[1-3]。

近期研究顯示，GERD的癥狀產(chǎn)生和食管黏膜損傷，除了化學(xué)性物質(zhì)直接刺激作用之外，炎癥、免疫反應(yīng)、內(nèi)臟高敏感在GERD發(fā)病過(guò)程中具有重要作用[4]。我們前期研究也顯示，反流性食管炎(reflux esophagitis，RE)大鼠食管組織IL-17、IL-23、COX-2表達(dá)量顯著增多(文章尚未發(fā)表)。既往觀點(diǎn)認(rèn)為，內(nèi)臟高敏感主要介導(dǎo)非糜爛胃食管反流病(non-erosive reflux disease，NERD)癥狀產(chǎn)生[5]，但NERD動(dòng)物模型無(wú)明確構(gòu)建方法。根據(jù)臨床實(shí)踐，我們推測(cè)認(rèn)為內(nèi)臟高敏感也參與RE癥狀產(chǎn)生過(guò)程。

辣椒素受體1(transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1)是瞬時(shí)受體電位通道的亞型之一，是一種神經(jīng)系統(tǒng)受體，TRPV1分布于辣椒素敏感傳入神經(jīng)末梢和胞體膜上，廣泛分布于胃腸道黏膜層、黏膜下層和肌層，可被多種理化因素、炎癥介質(zhì)直接激活或敏化，參與胃腸動(dòng)力、分泌和內(nèi)臟感覺(jué)。研究顯示，TRPV1與功能性消化不良、腸易激綜合征的內(nèi)臟高敏感及癥狀發(fā)生具有一定相關(guān)性[6-8]。但TRPV1在RE中的研究報(bào)道較少[9]。

促腎上腺激素釋放因子(corticotropin-releasing factor，CRF)是一種神經(jīng)肽，正常情況下CRF受體在下丘腦表達(dá)較低，當(dāng)機(jī)體受到各種應(yīng)激時(shí)，其表達(dá)量明顯增多；在外周CRF可作用于胃腸道嗜鉻細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面的CRF受體，其中與巨噬細(xì)胞表面CRF受體結(jié)合后，誘導(dǎo)脫顆粒反應(yīng)，釋放大量前列腺素、細(xì)胞因子等活性物質(zhì)，激活傳入神經(jīng)或背根神經(jīng)節(jié)，形成內(nèi)臟高敏感[9]。我們推測(cè)CRF信號(hào)通路在RE發(fā)病機(jī)制中具有一定作用。

本研究擬以大鼠為載體，采用動(dòng)物造模、免疫組化、Western blotting、qRT-PCR等方法，檢測(cè)RE大鼠和對(duì)照組大鼠下丘腦和食管下段組織中TRPV1、CRF1的表達(dá)情況，初步探索TRPV1、CRF1在RE內(nèi)臟高敏感中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及造模方法成年SD大鼠20只，體質(zhì)量(220±20)g，按照體質(zhì)量隨機(jī)分為RE實(shí)驗(yàn)組和假手術(shù)對(duì)照組。

采用部分賁門(mén)肌切開(kāi)加幽門(mén)部分結(jié)扎術(shù)制備酸反流性食管炎大鼠模型，具體步驟：3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射(1 ml/200 g)麻醉，除去腹部毛發(fā)，消毒，劍突下切口1.5 cm，暴露食管和胃，于食管-胃交界處縱行切開(kāi)賁門(mén)肌0.5 cm，使賁門(mén)松弛；半結(jié)扎幽門(mén)，即將直徑為4 mm金屬棒置入胃幽門(mén)外側(cè)，將金屬棒連同幽門(mén)同時(shí)扎緊后將金屬棒抽出。術(shù)后禁食24 h，RE實(shí)驗(yàn)組大鼠飼以高糖飲食(在普通飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，每日每只加用10%蜂蜜、10%白糖混合飲料自由飲用)。

假手術(shù)對(duì)照組大鼠開(kāi)腹后暴露食管和胃后，不進(jìn)行任何相關(guān)操作，暴露10 min后關(guān)腹，術(shù)后飼以普通飲食，其余飼養(yǎng)條件同RE實(shí)驗(yàn)組大鼠，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有兩只大鼠因造模手術(shù)操作不當(dāng)而死亡。

術(shù)后4周評(píng)估造模是否成功，隨機(jī)處死大鼠觀察食管下段黏膜充血水腫表明RE模型構(gòu)建成功。

之后以3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，按原手術(shù)切口開(kāi)腹，取食管下段組織(自胃食管交界上0.5 cm處向咽喉部截取1.5 cm)和下丘腦組織，部分置于4%甲醛固定，部分置于液氮、-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 免疫組化檢測(cè)RE大鼠和對(duì)照組大鼠的下丘腦和食管下段組織TRPV1、CRF1表達(dá)采用Max Vision免疫方法分別檢測(cè)RE大鼠和對(duì)照大鼠下丘腦、食管下段組織的TRPV1、CRF1表達(dá)。免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下，陰性(-)：細(xì)胞未顯示著色；弱陽(yáng)性(+)：細(xì)胞為淺黃色；中度陽(yáng)性(++)：細(xì)胞為棕黃色；強(qiáng)陽(yáng)性(+++)：細(xì)胞為棕色。如果陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>10%，則切片呈陽(yáng)性。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野,光鏡下按陽(yáng)性染色的細(xì)胞數(shù)和染色深淺分級(jí)。

1.3 Western blotting檢測(cè)RE大鼠和對(duì)照的大鼠下丘腦和食管下段組織TRPV1、CRF1蛋白表達(dá)分別取大鼠下丘腦、食管下段組織，依次提取組織總蛋白、制備濃縮膠和分離膠、電泳[每孔蛋白上樣量為50 μg，Maker上樣量為5 μl，電泳條件：濃縮膠區(qū)域電壓設(shè)為80 V，約25 min，分離膠區(qū)域電壓設(shè)為100 V(65 min)，當(dāng)顯色劑到底部，停止電泳]、轉(zhuǎn)膜、一抗和二抗孵育、顯色、照相分析，使用Image-pro-Plus軟件分析目的蛋白條帶。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)RE大鼠和對(duì)照組大鼠下丘腦和食管下段組織TRPV1、CRF1的mRNA表達(dá)大鼠TRPV1 qRT-PCR共測(cè)試3對(duì)引物，CRF1 qRT-PCR共測(cè)試4對(duì)引物，最終各確定一對(duì)引物有較好的擴(kuò)增曲線和溶解曲線，序列如下：TRPV1-Forward：5′-AGGCCGAGTTTCAGGGAGAA-3′；TRPV1-Reverse：5′-AAGCAGACCACCCAAAGACC-3′；CRF1-Forward：5′-GGGCAG-CCCGTGTGAATTATT-3′；CRF1-Reverse：5′-ATGATGACTGCAACATGGTAG-3′。

冰上操作、提取總RNA，即稱取0.05 g樣品于1.5 ml EP管內(nèi)，加入0.6 ml Trizol，馬上用組織勻漿器打勻，將樣品完全裂解，腦組織樣品能夠很好地裂解，勻漿約5 min即可，食管樣品最后會(huì)殘留部分結(jié)締組織等碎片，勻漿時(shí)間約15 min，勻漿后每個(gè)樣品再補(bǔ)加0.4 ml Trizol，使總體積至1 ml，混勻后再在冰上裂解10 min。隨后將樣品先在4 ℃，12 000g離心10 min，去除碎片沉淀，上清轉(zhuǎn)移至一支新EP管內(nèi)，按后續(xù)正常操作提取樣品的總RNA。

取1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，添加1 μl Oligo dT和1 μl Random primers，20 μl體系，42 ℃，1 h。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA樣品用ddH2O補(bǔ)至200 μl，并用于后續(xù)qRT-PCR反應(yīng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間計(jì)量資料比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)(非參數(shù)檢驗(yàn))。所有檢驗(yàn)為雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RE大鼠造?；厩闆r與對(duì)照組大鼠相比，RE大鼠食管大體觀察色澤明顯發(fā)紅，但未見(jiàn)明顯糜爛或潰瘍形成；HE染色觀察RE大鼠食管下段黏膜層可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞，少量嗜酸性粒細(xì)胞，黏膜固有層乳頭延伸明顯，提示RE大鼠造模成功(見(jiàn)圖1)。

圖1 RE大鼠和對(duì)照組大鼠食管大體標(biāo)本和HE染色結(jié)果(放大100倍)A～B：RE大鼠；C～D：對(duì)照組大鼠Fig 1 The gross specimens and HE staining results of esophagus between RE rats and control rats A-B:RE rats;C-D:control group rats

2.2 RE大鼠下丘腦組織和食管下段組織TRPV1、CRF1的免疫組化結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，RE大鼠下丘腦組織TRPV1、CRF1蛋白表達(dá)高于對(duì)照組大鼠。但RE大鼠食管下段組織TRPV1和CRF1的表達(dá)與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖2)。

圖2 RE大鼠和對(duì)照組大鼠下丘腦TRPV1及CRF1免疫組化對(duì)比圖(放大100倍)Fig 2 TRPV1 and CRF1 immunohistochemistry of hypothalamus tissue between RE rats and control group rats

2.3 RE大鼠下丘腦組織和食管下段組織TRPV1、CRF1的Western blotting結(jié)果Western blotting結(jié)果顯示，RE大鼠下丘腦組織TRPV1、CRF1的蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組。RE大鼠食管下段組織TRPV1、CRF1的表達(dá)，與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖3)。

圖3 兩組大鼠下丘腦組織和食管下段組織TRPV1、CRF1的蛋白表達(dá)Fig 3 TRPV1 and CRF1 protein expression of hypothalamus tissue and lower esophageal tissue between two groups

RE大鼠和對(duì)照組大鼠下丘腦、食管組織TRPV1的Western blotting定量分析顯示，與對(duì)照組大鼠相比，RE大鼠下丘腦組織TRPV1和CRF1蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著升高，而RE大鼠食管下段組織TRPV1、CRF1蛋白相對(duì)表達(dá)水平無(wú)明顯變化(見(jiàn)表1～2)。

表1 RE大鼠和對(duì)照組大鼠下丘腦、食管下段組織TRPV1蛋白相對(duì)表達(dá)水平Tab 1 TRPV1 protein relative expression levels of hypothalamus tissueand lower esophageal tissue between RE rats and control group rats

表2 RE大鼠和對(duì)照組大鼠下丘腦、食管下段組織CRF1蛋白相對(duì)表達(dá)水平Tab 2 CRF1 protein relative expression levels of hypothalamus tissue and lower esophageal tissue between RE rats and control group rats

2.4 RE大鼠下丘腦組織和食管下段組織TRPV1、CRF1的qRT-PCR結(jié)果qRT-PCR結(jié)果顯示TRPV1、CRF1、GAPDH的擴(kuò)增曲線、溶解曲線。樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性檢驗(yàn)見(jiàn)溶解曲線，溶解曲線分析結(jié)果顯示為單一銳峰，無(wú)非特異性產(chǎn)物出現(xiàn)，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物單一，結(jié)果可信(見(jiàn)圖4)。mRNA含量用相對(duì)表達(dá)量表示。

圖4 大鼠下丘腦組織TRPV1、CRF1、GAPDH的擴(kuò)增曲線、溶解曲線Fig 4 The amplification curve and dissolution curve of TRPV1,CRF1 and GAPDH in rat’s hypothalamus

RE大鼠和對(duì)照組大鼠下丘腦組織和食管下段組織TRPV1 mRNA表達(dá)的非參數(shù)統(tǒng)計(jì)顯示，RE大鼠下丘腦中TRPV1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組大鼠，而食管下段組織中TRPV1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 RE大鼠和對(duì)照組大鼠下丘腦、食管下段組織TRPV1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平Tab 3 TRPV1 mRNA relative expression levels of hypothalamus tissue and lower esophageal tissue between RE rats and control group rats

RE大鼠和對(duì)照組大鼠的下丘腦組織CRF1 mRNA表達(dá)的非參數(shù)統(tǒng)計(jì)顯示，RE大鼠下丘腦組織中CRF1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組大鼠，而食管下段組織中CRF1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平在兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表4)。

表4 RE大鼠和對(duì)照組大鼠下丘腦、食管下段組織CRF1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平Tab 4 CRF1 mRNA relative expression levels of hypothalamus tissue and lower esophageal tissue between RE rats and control group rats

3 討論

內(nèi)臟高敏感性是指內(nèi)臟對(duì)生理性刺激產(chǎn)生不適感或?qū)π源碳し磻?yīng)強(qiáng)烈的現(xiàn)象，可能的參與因素有遺傳背景、腦腸肽、離子通道異常、受體異常、迷走神經(jīng)傳入神經(jīng)感覺(jué)異常、雌激素、精神心理因素等。GERD患者發(fā)生內(nèi)臟高敏感不僅對(duì)食管酸刺激敏感性增強(qiáng)，對(duì)食管腔內(nèi)機(jī)械性刺激、膽堿能藥物的敏感性也增強(qiáng)。學(xué)者們認(rèn)為內(nèi)臟高敏感在GERD患者，尤其是NERD癥狀產(chǎn)生中具有重要因素[10-11]。但目前對(duì)于內(nèi)臟高敏感在GERD發(fā)病機(jī)制的研究較少，其具體機(jī)制尚不清楚、也無(wú)客觀的診斷標(biāo)準(zhǔn)及臨床干預(yù)藥物。

既往觀點(diǎn)認(rèn)為內(nèi)臟高敏感主要參與NERD癥狀產(chǎn)生，但NERD動(dòng)物模型無(wú)明確構(gòu)建方法。臨床實(shí)踐提示很多RE患者也具有焦慮狀態(tài)，焦慮狀態(tài)更加重主觀癥狀的嚴(yán)重程度。本研究擬以大鼠為載體，采用動(dòng)物造模、免疫組化、Western blotting、qRT-PCR等方法，檢測(cè)RE大鼠和對(duì)照組大鼠下丘腦組織、食管下段組織中TRPV1、CRF1的表達(dá)情況，探索TRPV1、CRF1在RE內(nèi)臟高敏感中的作用機(jī)制。

TRPV1主要分布在傷害性感覺(jué)神經(jīng)元上，是多信號(hào)探測(cè)因子及疼痛刺激整合器，可以被多種理化因素及炎癥介質(zhì)直接激活或敏化，如熱刺激(T>43 ℃)、H+(pH<6.0)、辣椒素、緩激肽等。研究表明，TRPV1廣泛分布于胃腸道感覺(jué)神經(jīng)纖維及相應(yīng)背根神經(jīng)節(jié)上，參與內(nèi)臟高敏感和胃腸動(dòng)力的改變[12]。國(guó)外研究表明，RE患者和NERD患者食管黏膜固有層神經(jīng)纖維、上皮內(nèi)游離神經(jīng)末梢及鱗狀上皮細(xì)胞TRPV1受體的表達(dá)增加，提示TRPV1受體可能與GERD癥狀的產(chǎn)生有關(guān)，RE患者和NERD患者黏膜TRPV1的表達(dá)且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[8]。這說(shuō)明了RE和NERD在分子水平上存在一定程度的共性。

本研究結(jié)果顯示，RE大鼠下丘腦TRPV1的蛋白和mRNA的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組大鼠。內(nèi)臟高敏感涉及胃腸道神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)三個(gè)層次，腦腸肽在其中具有重要作用。RE大鼠在胃食管反流的刺激下，下丘腦TRPV1表達(dá)升高，提示TRPV1可能在中樞層面介導(dǎo)RE的病理狀態(tài)，對(duì)此尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道，該研究具有一定創(chuàng)新性。

CRF是一種神經(jīng)肽，CRF參與腸易激綜合征內(nèi)臟高敏感的發(fā)生過(guò)程，腸易激大鼠腦和結(jié)腸組織中CRF表達(dá)均升高[13-14]。研究CRF信號(hào)調(diào)節(jié)系統(tǒng)有利于探索緊張和焦慮在GERD發(fā)病中的作用。CRF亞型較多，本研究初步探索CRF1在RE中的作用，研究結(jié)果顯示RE大鼠下丘腦組織CRF1的蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。說(shuō)明RE大鼠在胃食管反流的刺激下，下丘腦CRF1表達(dá)升高，提示CRF1也可能在中樞層面介導(dǎo)RE的病理狀態(tài)。除了參與焦慮外，文獻(xiàn)顯示CRF與受體結(jié)合具有抑制胃運(yùn)動(dòng)的功能[15]，推測(cè)CRF可能通過(guò)減慢胃排空而促進(jìn)GERD的發(fā)生。

但RE大鼠食管下段組織TRPV1的蛋白和mRNA表達(dá)水平與對(duì)照大鼠差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該結(jié)果與既往TRPV1在GERD患者或RE大鼠模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同[16]，分析可能的原因有：(1)本研究取大鼠食管全層為研究樣本，查閱文獻(xiàn)顯示TRPV1主要表達(dá)于RE食管黏膜的上皮、固有層；(2)本研究中RE大鼠模型盡管采用經(jīng)典方法，但食管僅表現(xiàn)為充血水腫、無(wú)明顯糜爛改變，既往研究顯示，TRPV1的表達(dá)量與內(nèi)鏡下RE的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，以上兩方面因素可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定影響。RE大鼠食管下段組織CRF1的蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)水平無(wú)顯著升高。對(duì)于CRF1在RE方面的研究很少，文獻(xiàn)報(bào)道慢性束縛應(yīng)激大鼠食管CRF受體在食管黏膜下神經(jīng)叢有表達(dá)[17]。

綜上，RE大鼠下丘腦組織中TRPV1、CRF1顯著升高，其可能在中樞層面參與RE的病理過(guò)程，這為進(jìn)一步研究RE的發(fā)病分子機(jī)制提供新的視角。