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SBPase基因超表達(dá)對(duì)煙草生長(zhǎng)的影響

2021-11-02 13:52韓平安孫瑞芬唐寬剛梁亞暉聶利珍吳新榮李曉東
關(guān)鍵詞:株系農(nóng)藝引物

韓平安,孫瑞芬,唐寬剛,常 悅,梁亞暉,聶利珍,吳新榮,李曉東

全球氣候變暖、自然災(zāi)害頻發(fā)導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量降低,已嚴(yán)重威脅人類的生存。針對(duì)這一問(wèn)題,科研工作者發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)節(jié)植物的光合作用增加農(nóng)作物產(chǎn)量是確保糧食安全的有效途徑[1-2]。綠色植物中卡爾文循環(huán)是光合作用的第一個(gè)途徑,它將大氣中的二氧化碳吸收為有機(jī)化合物的骨架,是有機(jī)大分子的前體,是植物生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)[3-4]。景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(SBPase)是植物光合作用卡爾文循環(huán)過(guò)程中的關(guān)鍵酶,SBPase 催化的反應(yīng)位于卡爾文循環(huán)中同化階段和再生階段的分支點(diǎn),對(duì)于控制該循環(huán)過(guò)程中碳源的流通具有十分重要的意義[5]。

核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)是光合碳固定的關(guān)鍵酶。研究發(fā)現(xiàn),煙草中SBPase 減少,CO2受體分子RuBP 再生能力呈線性減少[6];楊樹(shù)SBPase 活性提高,CO2受體分子RuBP 再生能力呈線性增加[7];轉(zhuǎn)基因番茄的光合速率和抗寒性隨著SBPase 活性的增強(qiáng)而提高[8];水稻的SBPase 3′端單核苷酸替換嚴(yán)重影響了植物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量[9]。研究證實(shí),SBPase 是光合作用中RuBP 形成及維持碳循環(huán)平衡的關(guān)鍵酶[10-11]。LEFEBVRE 等[12]研究發(fā)現(xiàn),在煙草中過(guò)表達(dá)SBPase 基因,酶含量和碳固定呈線性表達(dá)關(guān)系。因此,SBPase 基因具有調(diào)節(jié)RuBP 再生與促進(jìn)碳化合物形成的作用,從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育[7]。SBPase 基因的超表達(dá)研究對(duì)探索植物生長(zhǎng)具有重要意義。

研究證實(shí),通過(guò)對(duì)SBPase 基因功能的調(diào)節(jié)具有提高光合性能的作用,植物光合作用的主要生理活動(dòng)是在綠色組織中完成的,大量相關(guān)基因的表達(dá)具有很強(qiáng)的組織特異性[12]。啟動(dòng)子包含基因表達(dá)的核心調(diào)控信息,決定了基因轉(zhuǎn)錄的起始、效率及時(shí)空特異性。應(yīng)用合適的啟動(dòng)子準(zhǔn)確控制相關(guān)基因在植物體內(nèi)的表達(dá)強(qiáng)度和部位,不僅可能增加同化產(chǎn)物的積累,還可避免可能帶來(lái)的植物代謝紊亂[13]。本研究采用甜菜分子育種課題組前期構(gòu)建的擬南芥RBCS 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)SBPase 基因的植物表達(dá)載體,通過(guò)在煙草中過(guò)量表達(dá)SBPase,探究SBPase 基因?qū)煵蒉r(nóng)藝性狀與光合特性的影響,以期為加強(qiáng)SBPase 基因在作物高產(chǎn)育種上的利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本氏煙草(Nicotiana benthamiana)無(wú)菌苗,載體[pBWA(V)K-AtRBCS-SBPase]由甜菜分子育種課題組前期構(gòu)建保存,啟動(dòng)子為RBCS 啟動(dòng)子,載體篩選基因?yàn)樾旅顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶基因(NPTII),啟動(dòng)子為35S。通過(guò)Primer premier 5.0 設(shè)計(jì)SBPase 基因的特異引物,RNR2 檢測(cè)引物參照王盛等[14]的方法。引物由南京市金斯瑞公司合成,引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物信息

1.2 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

剪取煙草無(wú)菌苗幼葉,切成1 cm×1 cm 的小葉盤(pán),并在每個(gè)葉盤(pán)上制造傷口,切取100 個(gè)葉盤(pán)備用。將切好的葉盤(pán)轉(zhuǎn)入滅菌的小燒杯,加入活化的農(nóng)桿菌EHA105 菌液(菌液濃度OD 值為0.5~0.6),避光條件下侵染10 min。將侵染后的葉盤(pán)放在滅菌濾紙上吸去多余菌液并迅速將其轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS 4.4 g/L、蔗糖30.0 g/L、6-BA 1.0 mg/L、瓊脂7.0 g/L,pH 值為5.8)上,25 ℃暗培養(yǎng)3 d。將其培養(yǎng)3 d 的葉盤(pán)轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基(MS 4.4 g/L、蔗糖30.0 g/L、6-BA 1.0 mg/L、頭孢250.0 mg/L、Kan 50.0 mg/L、瓊脂7.0 g/L,pH 值為5.8)中誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生。待叢生芽長(zhǎng)到1~2 cm 時(shí)從葉盤(pán)上切下移入生根培養(yǎng)基(MS 2.2 g/L、蔗糖15.0 g/L、Kan 50.0 mg/L、頭孢250.0 mg/L、瓊脂7.0 g/L,pH 值為5.8)中誘導(dǎo)生根。

1.3 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及分子檢測(cè)

1.3.1 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR 檢測(cè) 切取卡那抗性植株幼葉,利用高通量核酸提取儀(KingFisher Flex,Thermo Fisher)提取基因組DNA,具體步驟按磁珠法植物DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 質(zhì)量,并利用超微量生物檢測(cè)儀測(cè)定其濃度(NanoDrop onec,Themo)。以DNA 為模板,用特異引物2F 和2R(表1)進(jìn)行目的基因SBPase 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系(15.0 μL):DNA 模板1.0 μL,2×Taq Master Mix 7.5 μL,正、反向引物(10 μmol/L)各0.3 μL,RNase-Free water 5.9 μL。PCR 反應(yīng)程序:94 ℃3 min;94 ℃45 s,58 ℃45 s,72 ℃1 min,32 個(gè)循環(huán);72 ℃10 min,4 ℃保存。

1.3.2 目的基因SBPase 拷貝數(shù)檢測(cè) 利用微滴式數(shù)字PCR(droplet digital,ddPCR) 技術(shù),首先對(duì)SBPase 基因的擴(kuò)增引物(3F/3R)和內(nèi)參基因RNR2的擴(kuò)增引物(1F/1R)的特異性進(jìn)行檢測(cè)。之后用特異引物3F 和3R(表1)對(duì)PCR 檢測(cè)陽(yáng)性植株進(jìn)行SBPase 基因插入拷貝數(shù)檢測(cè)。ddPCR 擴(kuò)增體系(25.0 μL):模板2.0 μL,2×PerfeCTa Qpcr ToughMix UNG 5.0 μL,Alexa FluorTM647 1.0 μL,EvaGreen 20×in water 2.0 μL,上、下游引物各0.4 μL,ddH2O 14.2 μL。將25.0 μL 反應(yīng)液加入芯片,利用數(shù)字PCR 儀(Naica,Stilla Techn Logieso,F(xiàn)rance)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。內(nèi)參基因?yàn)闊煵莺颂呛怂崦富颍≧NR2),在煙草中拷貝數(shù)為1。數(shù)字PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃5 min;95 ℃30 s,60 ℃30 s,72 ℃30 s,40 個(gè)循環(huán);72 ℃5 min,每個(gè)樣品進(jìn)行3 次平行重復(fù)試驗(yàn)。擴(kuò)增反應(yīng)完畢后,將芯片放入微滴讀取儀依據(jù)熒光信號(hào)的有無(wú)對(duì)陽(yáng)性微滴和陰性微滴進(jìn)行判定讀值。利用軟件Crystal Reader 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到核酸絕對(duì)定量結(jié)果。外源基因拷貝數(shù)的計(jì)算方法:外源基因拷貝數(shù)=外源基因濃度/內(nèi)參基因濃度。

1.4 轉(zhuǎn)基因煙草農(nóng)藝性狀及光合特性測(cè)定

將低拷貝轉(zhuǎn)基因煙草植株移栽至花盆中,收獲T0代種子。隨機(jī)將3 個(gè)株系的T0代種子播種在花盆里獲得T1代植株。分離的T1代植株經(jīng)PCR 檢測(cè)后獲得陽(yáng)性植株,每個(gè)株系選擇生長(zhǎng)良好、長(zhǎng)勢(shì)一致的同一時(shí)期陽(yáng)性植株各10 株進(jìn)行移栽。移栽后的植株放入步入式培養(yǎng)箱(Percival PR-1218)繼續(xù)生長(zhǎng),培養(yǎng)箱溫度為25 ℃,光照18 h/d,相對(duì)濕度60%。幼苗生長(zhǎng)到45 d 時(shí),測(cè)定株高、莖圍、葉長(zhǎng)、葉寬和葉片數(shù)農(nóng)藝性狀,具體測(cè)定方法參照煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)方法[15]。同時(shí),利用光合儀(LI-COR6800,USA)測(cè)定植株的光合特性,測(cè)定時(shí)間為10:00—11:00,光源為紅藍(lán)光源,光強(qiáng)為1 000 μmol(/m2·s),CO2濃度為400 μmol/mol,溫度為25 ℃。選取生長(zhǎng)狀況一致、葉片完全展開(kāi)且葉位大致相同的成熟葉片,測(cè)定凈光合指標(biāo),每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2020 軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理并作圖,借助SPSS 22.0 軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性煙草植株的獲得

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草(圖1),通過(guò)卡納霉素(50 mg/L)篩選獲得抗性叢生芽,待叢生芽長(zhǎng)到1~2 cm 時(shí),從葉盤(pán)上切下移入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng),獲得抗性煙草植株。

圖1 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草的PCR 檢測(cè)

隨機(jī)選取35 株卡那霉素抗性植株進(jìn)行目的基因SBPase 的PCR 擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),均獲得預(yù)期大小片段(圖2),初步判斷目的基因已整合到煙草染色體基因組中,獲得轉(zhuǎn)基因植株32 株。

圖2 部分轉(zhuǎn)基因煙草的PCR 檢測(cè)

2.3 目的基因拷貝數(shù)檢測(cè)

利用ddPCR 技術(shù)對(duì)32 株陽(yáng)性植株進(jìn)行插入拷貝數(shù)檢測(cè)。首先以煙草RNR2 為內(nèi)參基因,對(duì)目的基因SBPase 擴(kuò)增引物(3F/3R)的特異性進(jìn)行檢測(cè)。由圖3 可知,2 個(gè)基因?qū)?yīng)引物的陽(yáng)性微滴(藍(lán)色帶)與陰性微滴(黑色帶)都能明顯區(qū)分開(kāi)。圖3中藍(lán)色信號(hào)點(diǎn)代表發(fā)生PCR 擴(kuò)增的微滴,系統(tǒng)判讀為陽(yáng)性信號(hào);黑色信號(hào)點(diǎn)代表未發(fā)生PCR 擴(kuò)增的微滴,系統(tǒng)判讀為陰性信號(hào)。結(jié)果表明,目的基因SBPase 引物的特異性較好。其次,對(duì)ddPCR 的重復(fù)性進(jìn)行分析,所有樣品SBPase 和RNR2 基因的有效微滴總數(shù)為24 310~27 094(表2),滿足微滴式數(shù)字PCR 微滴的分析要求,生成微滴的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為2%~5%(表2),小于25%,符合歐盟核酸定量檢測(cè)的要求,說(shuō)明建立的微滴式數(shù)字PCR 體系微滴生成穩(wěn)定,重復(fù)性良好,數(shù)據(jù)可靠性高。本研究對(duì)32 株轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行拷貝數(shù)分析,共獲得低拷貝轉(zhuǎn)基因植株15 株,部分?jǐn)?shù)據(jù)見(jiàn)表3,SBPase 基因的插入拷貝數(shù)均在0.5~1.5。

圖3 ddPCR 引物特異性檢測(cè)

表2 ddPCR 重復(fù)性分析

表3 部分植株ddPCR SBPase 基因拷貝數(shù)分析

2.4 轉(zhuǎn)基因煙草植株的農(nóng)藝性狀測(cè)定

為了觀察鑒定轉(zhuǎn)基因煙草植株表型(圖4),隨機(jī)選取3 個(gè)低拷貝株系的植株,與野生型煙草進(jìn)行農(nóng)藝性狀測(cè)定。由表4 可知,轉(zhuǎn)基因煙草3 個(gè)株系的莖圍、葉長(zhǎng)均顯著高于野生型煙草(P<0.05),L1、L2、L3 株系莖圍比野生型煙草WT 分別增加了52.47%、21.34%和49.17%;葉長(zhǎng)分別增加了30.77%、25.96%和39.10%。L1、L2、L3 轉(zhuǎn)基因煙草株系的葉寬與野生型煙草WT 差異達(dá)到了極顯著水平(P<0.01),分別高于野生型煙草WT 55.48%、53.82%和65.39%;葉片數(shù)、株高均高于野生型煙草WT,但差異未達(dá)到顯著水平(P>0.05),表明SBPase在煙草中超表達(dá),提高了煙草的各項(xiàng)農(nóng)藝性狀指標(biāo)水平。

圖4 煙草植物表型

2.5 煙草植株的光合特性測(cè)定

選取以上3 個(gè)低拷貝煙草植株完全展開(kāi)的成熟葉片,以野生型煙草植株為對(duì)照,測(cè)定其葉片的光合特性。結(jié)果表明,3 個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系(L1、L2、L3)植株的凈光合速率分別為5.651、4.312 和3.389 μmol/(m2·s)(圖5Ⅰ),分別比野生型植株提高了88.2%、43.6%和27.1%(P<0.05);株系蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度均略高于野生型煙草(圖5Ⅱ、圖5Ⅳ),但未達(dá)到顯著差異水平(P>0.05);胞間CO2濃度與野生型煙草達(dá)到顯著水平(P<0.05),分別高于野生型煙草13.0%、4.4%和4.3%(圖5Ⅲ),表明在煙草中超表達(dá)SBPase 基因可以增強(qiáng)光合特性。

表4 煙草農(nóng)藝性狀測(cè)定結(jié)果

圖5 煙草光合特性分析

3 討論和結(jié)論

光合作用強(qiáng)弱嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[16],植物對(duì)碳固定能力的提高會(huì)顯著促進(jìn)自身生長(zhǎng)發(fā)育[17-18]。有研究表明,SBPase 基因表達(dá)量提高,對(duì)植株的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用,植株的生物量和光合性能也隨之增加。超表達(dá)SBPase 基因?qū)M南芥生長(zhǎng)發(fā)育有明顯促進(jìn)作用,轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉面積和根長(zhǎng)明顯優(yōu)于野生型擬南芥[8]。在衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中超表達(dá)SBPase,顯著增強(qiáng)過(guò)表達(dá)植株的光合速率[19]。二穗短柄草(Brachypodium distachyon)中SBPase 基因在小麥中轉(zhuǎn)化表達(dá),溫室條件下,高表達(dá)SBPase轉(zhuǎn)基因植株葉片光合作用增強(qiáng),總生物量和干種子產(chǎn)量增加[20]。超表達(dá)SBPase 基因顯著增加擬南芥凈光合速率,葉片中的淀粉、可溶性糖含量及植株干物質(zhì)量增加[21]。在煙草上研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)增加SBPase活性的轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出較高水平的蔗糖和淀粉積累,且葉面積和生物量顯著增加[22]。利用Rubisco 小亞基啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的SBPase 反義表達(dá)載體對(duì)煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草的SBPase 活性明顯降低,植株的花期和開(kāi)花數(shù)量受到嚴(yán)重影響[23]。本研究與前人獲得了一致性研究結(jié)果,在煙草上超表達(dá)SBPase 基因后,農(nóng)藝性狀有較明顯的優(yōu)良表現(xiàn),轉(zhuǎn)基因煙草莖圍、葉長(zhǎng)、葉寬顯著提高,葉片數(shù)和株高也表現(xiàn)出不同程度的提高。轉(zhuǎn)SBPase 基因后,煙草光合性能大幅度提高,凈光合速率和胞間CO2濃度顯著提高,蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度均高于野生型煙草,確保其能維持較高的光合速率和積累更多的光合作用產(chǎn)物促進(jìn)自身生長(zhǎng)發(fā)育[24]。

啟動(dòng)子已被廣泛應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化,如35S、Actin 和Ubiquitin 具有強(qiáng)度高、非組織特異和不易受轉(zhuǎn)化基因的影響等特點(diǎn)[25]。現(xiàn)有的研究結(jié)果證明,通過(guò)對(duì)光合作用相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)節(jié)可以提高光合速率,但許多與主要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因的組成型過(guò)量表達(dá)明顯帶來(lái)負(fù)面效應(yīng),因?yàn)榇罅勘磉_(dá)外源基因會(huì)增加植物的代謝負(fù)擔(dān),導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)消耗,從而干擾植株的生長(zhǎng)發(fā)育[13]。目前,甜菜分子育種課題組正嘗試改造(弱化)擬南芥RBCS 啟動(dòng)子,微量增加轉(zhuǎn)基因煙草植株中外源SBPase 的表達(dá),能否獲得更高光合速率和生物量有待驗(yàn)證。

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