郭江岸，馮 勇，趙瑞霞，韓宇婷，蘇二虎，梁紅偉，趙逸雯，張來厚

玉米是典型的異花授粉作物，表現(xiàn)出極端的近交衰退和雜種優(yōu)勢[1]。玉米骨干自交系是育種家對株行、產(chǎn)量、抗性等性狀嚴格考察篩選出的優(yōu)秀親本。我國玉米親本自交系主要劃分為唐四平頭、旅大紅骨、蘭卡斯特、國外Reid、國內(nèi)Reid 和P 群6 大遺傳類群，對應的6 個標準自交系為黃早四、丹340、Mo17、B73、掖478 和齊319[2]。利用SSR 分子標記技術分析玉米種質(zhì)遺傳多樣性是國內(nèi)外學者利用較早，且簡便、高效和準確的一種自交系分類鑒定技術，通過對樣本DNA 多態(tài)性進行分析，可以得到樣本DNA 序列以及在遺傳性狀上的調(diào)控和差異。迄今為止，國內(nèi)外已見大量關于玉米自交系及雜交種遺傳多樣性分析的報道，為玉米自交系血緣鑒定提供了分子手段，節(jié)省了自交系鑒定時間，也為優(yōu)良自交系的運用提供了理論基礎[3-7]。近年來，我國處于傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)折點，產(chǎn)量已經(jīng)不再是制約玉米育種發(fā)展的主要因素，宜機收玉米新品種的選擇和極端天氣較多導致的玉米倒伏，對玉米新品種及自交系抗病性，尤其是莖腐病抗性提出了更高的要求[8]。

本試驗運用SSR 分子標記技術對43 份玉米骨干自交系和11 份參照系進行遺傳多樣性分析，并運用田間接種方式對其莖腐病進行抗病性鑒定，以期為玉米骨干自交系高效利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗所用材料為內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院玉米研究所選育的43 份玉米骨干自交系和11 份參照系（表1）。

1.2 研究方法

1.2.1 遺傳多樣性分析

1.2.1.1 試驗材料DNA 提取 2018年4月26日將54 份試驗材料種于內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院院內(nèi)試驗地，種植密度為75 000 株/hm2，2 行區(qū)，9 m行長，2 次重復。待玉米生長至3～4 葉，逐區(qū)取幼嫩葉片，使用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的植物基因組DNA 提取試劑盒進行DNA 提取，DNA 質(zhì)量和濃度采用NanoDrop 2000（Thermo Scientific）紫外分光光度計進行測定。

1.2.1.2 SSR 分子標記及引物選擇 選用的40 對引物是由北京市農(nóng)林科學院玉米研究中心報道的第Ⅰ組的20 對基本核心引物和第Ⅱ組的20 對擴展核心引物，這40 對引物為國家玉米品種區(qū)域試驗DNA指紋鑒定指定引物，引物信息見參考文獻［5］和［9］。

1.2.1.3 PCR 反應程序及電泳檢測 PCR 反應體系為20 μL，包括DNA 2 μL，前后引物各0.5 μL，Mix 10 μL，剩余用DDH2O 補足。PCR 反應在BIO-RAD公司的PTC-100 型PCR 儀器上進行，程序為94 ℃5 min；94 ℃40 s，57 ℃35 s，72 ℃1 min，33 個循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃保存[5]。PCR 產(chǎn)物采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測[10-12]。

1.2.1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析 根據(jù)電泳結果，建立SSR擴增產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫。采用PowerMarker 3.25[13]、Ntsys 和MEGA 4.0 軟件進行等位基因變異數(shù)目和多態(tài)性信息含量（PIC）等基本統(tǒng)計量的運算分析，并進行UPGMA 樹的構建[14-16]。

1.2.2 莖腐病抗病性鑒定 2018年、2019年進行莖腐病抗性鑒定，采用禾谷鐮孢菌進行接種（菌種由北京市農(nóng)林科學院趙久然實驗室提供）。接種方法為玉米播種時埋菌接種和成株期傷莖根埋法接種相結合。成株期傷莖根埋法鑒定接種前先進行田間澆灌，土壤肥力水平和耕作管理與大田生產(chǎn)相同。在玉米進入乳熟期調(diào)查發(fā)病情況[17-19]，病情等級劃分見表2[20]。

2 結果與分析

2.1 自交系遺傳分析

40 對SSR 引物在43 份玉米骨干自交系間共檢測出等位基因變異242 個，每對引物檢測的等位基因數(shù)為3～11 個，平均每對引物能夠檢測出6.05 個等位基因。PIC 值在0.30～0.86，平均為0.61，具有較好的多態(tài)性和品種分辨能力。

表1 43 份玉米骨干自交系和11 份參照系

表2 玉米莖腐病抗性鑒定的病情級別劃分

2.2 聚類分析

結合PowerMarker 3.25 軟件計算結果，利用UPGMA 方法對54 份自交系進行聚類分析。由圖1可知，54 份材料可以劃分為7 個類群，根據(jù)材料提供系譜信息，類群與聚類分析結果一致。

第一類為旅大紅骨群體，包括參照系丹340（24）及骨干自交系M53-122（23）、M15N01（54）、M5168（22）、MZYF（5）；第二類為黃改群體，包括參照系黃早四（46）及骨干自交系M17Y336（18）、四287（52）、M09N007（38），參照系昌7-2（16）及骨干自交系MZ4（34）、M09N041（48）、M09N230（27）、MXZXJ853（28）；第三類群體為P 群，包括參照系齊319（49）、1145 （51） 及骨干自交系M17Y339（20）、M16NC（13）、M17Y73（2）；第四類群體為國外Reid群，包括參照系B73（44）、PH6WC（50）及骨干自交系M17Y11 （9）、M17Y338 （19）、M17Y332（15）、M18Y174（35）、M17N109（37）、M17N65（3）、M051（43）、M132Z（31）、M26Z（30）、M927（8）、M10ND101（25）、M17Y18（4）、Ms2-P6（33）、M17Y26（1）、M16Y041（40）、M17Y07（6）、M8349（12）、MZJ（10）；第五類群體為蘭卡斯特群體，包括參照系Mo17（45） 及骨干自交系M5N32（47）、M17N358（36）、M17Y331（14）；第六類群體為國內(nèi)Reid 群，包括參照系鄭58（53）、掖478（32）及骨干自交系MK-461（42）、M3401（26）；另外，M17Y130（11）、MU6（41）、M18N41（7）、M17Y334（17）、M85Z（29）、MU7（39）、M17Y340（21）單獨劃分，與黃改、旅大紅骨遺傳距離較近，暫定為M 群。

圖1 54 份自交系的SSR 標記聚類圖

2.3 自交系莖腐病抗性鑒定

由表3 可知，43 份玉米骨干自交系莖腐病抗性差異明顯，其中，高度抗?。℉R）材料14 份、抗病（R）材料14 份、中度抗病（MR）材料9 份、感病（S）材料3 份、高度感病（HS）材料3 份。發(fā)病率低于30%的抗病材料37 份，占86.05%?？共∽越幌抵饕獊碓从诼么蠹t骨群、P 群和國外Reid 群，其他類群自交系對莖腐病抗性表現(xiàn)不同。

表3 43 份玉米骨干自交系田間莖腐病抗性鑒定

3 結論與討論

選取的43 份玉米骨干自交系，加入了11 份參照系，選用了40 對農(nóng)業(yè)行業(yè)標準推薦SSR 引物，具有多態(tài)性高、擴增效果好等特點。聚類分析結果顯示，其中47 份玉米自交系被劃入6 個類群，分別為旅大紅骨群、黃改群、P 群、國外Reid 群、蘭卡斯特群和國內(nèi)Reid 群，另外M17Y130、MU6、M18N41、M17Y334、M85Z、MU7 和M17Y340 單獨劃為同一群體，暫定為M 群。根據(jù)自交系系譜來源，M 群部分材料來源于加拿大群體，部分材料來源于國外雜交種選系，若明確其血源歸屬，還需進一步加入其他類群（例如Iodent）種質(zhì)對照。

43 份玉米骨干自交系中，包含5 個“內(nèi)單”系列雜交種雙親，聚類分析結果顯示，內(nèi)單314 屬于旅大紅骨群×國內(nèi)Reid 群，內(nèi)早209 屬于M 群×國外Reid 群，內(nèi)單408、內(nèi)單35（2018年審定）、內(nèi)單407（2020年審定）均屬于黃改群×其他群。黃改群×其他群雜優(yōu)模式被重點應用，黃改群材料優(yōu)點是豐產(chǎn)性高、綜合抗性好，缺點是植株較繁茂、穗位高，脫水速率慢也較為突出，這與近年來玉米早熟、宜機收、耐密等需求相悖。因此，該雜種優(yōu)勢模式的繼續(xù)應用更應該注意材料改良方向，取長補短或者注重雜交種區(qū)域化需求。

田間條件下，莖腐病發(fā)病程度除了受遺傳因素影響，還受到環(huán)境條件因素影響。內(nèi)蒙古地區(qū)環(huán)境較黃淮海、西南山區(qū)等地區(qū)干燥，濕度較低，腐霉菌接種效果不佳，本試驗采用禾谷鐮孢菌種并且連續(xù)兩年在同一地塊進行莖腐病病菌接種試驗，接種前灌溉，播種前埋菌和多次傷莖根埋法相結合，最大限度地提高莖腐病發(fā)病水平，調(diào)查結果能夠充分反映玉米自交系對莖腐病的抗性。試驗結果顯示，對莖腐病表現(xiàn)為抗病的自交系主要來源于旅大紅骨群、國外Reid 群和P 群。P 群材料全部表現(xiàn)為高度抗病，這種現(xiàn)象應該和該群體材料生育期較長、生活力旺盛有關。黃改群、蘭卡斯特群體、國內(nèi)Reid 群體對莖腐病抗性表現(xiàn)不同。M 群中M17Y130、MU7 和MU6 對莖腐病抗性表現(xiàn)為感病和高度感病，系譜顯示其全部來源于加拿大群體選系，M17Y340、M18N41 和M85Z 莖腐病抗性表現(xiàn)抗病和高度抗病，系譜顯示全部來源于國外雜交種選系。因此，黃改群、蘭卡斯特群、國內(nèi)Reid 群和M 群材料的利用應結合其抗病性特點。