周潔琦 徐圣杰 高莉蓉 劉澤毅

肺癌是導致癌癥相關性死亡的主要原因[1]，肺癌的發(fā)病率和死亡率均位于全球首位[2]。盡管有針對非小細胞肺癌(NSCLC)的多種治療方法，對于晚期患者療效仍然有限，五年生存率仍然較低[3]。因此，迫切需進一步研究NSCLC的發(fā)病機理，并尋找有效的治療方法。去整合素金屬蛋白酶(ADAM)屬于去整合素金屬蛋白酶家族成員，包括信號肽，前肽，金屬蛋白酶域，去整合素域等區(qū)域，在調節(jié)細胞與細胞和細胞與基質的相互作用中起到重要作用[4-5]。研究表明ADAM15在許多實體惡性腫瘤中表達上調，且ADAM15的高表達與腫瘤的發(fā)生和轉移有關，提示ADAM15高表達的患者預后較差[4, 6]。因此，本研究旨在探討ADAM15對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其可能的機制，旨在為肺癌的治療提供新的靶點。

資料與方法

一、組織樣本

收集2016至2018年蘇州大學附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科20對肺癌組織及相應的癌旁組織樣本。所有患者術前均未經放化療和介入等治療。此研究經蘇州大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準[2016倫理(申報)批第157-1號], 并獲得所有涉及此研究患者的知情同意。

二、實驗試劑

Trizol、RT-PCR試劑盒及SYBR Green RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；ADAM15引物(蘇州金唯智科技有限公司)；Lipofectamine 2000轉染試劑(賽默飛公司)；ADAM15干擾序列(蘇州吉瑪基因股份有限公司)；Cell counting kit-8(CCK8)試劑(碧云天公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清(Gibco公司)；結晶紫染液(上海生工公司)；ADAM15抗體(Santa Cruz公司)、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK、MMP2、MMP9抗體(CST公司)；β-actin抗體、山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG(北京康為世紀生物科技有限公司)。

三、細胞培養(yǎng)

人肺癌細胞系A549、H1299、SPC、H460及人正常肺上皮細胞BEAS-2B均從上海中國科學院細胞庫購買。細胞均在含有10%FBS和1%雙抗(100U/ml青霉素和鏈霉素)的RPMI-1640的完全培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2條件下恒溫培養(yǎng)。

四、瞬時轉染

將H460細胞接種在六孔板中，當細胞密度達到40%～60%時，我們按照制轉染試劑盒說明書使用Lipofectamine 2000進行轉染。48～72 h后，收集細胞用于進一步實驗。AMAM15的干擾序列如下：ADAM15-1 siRNA：5′-CCCAGC UGUCACCCUCGAA-TT-3′; ADAM15-2 siRNA：5′-GAUCUACUCUGGGAGA CAATT-3′。

五、實時熒光定量PCR

嚴格按照Trizol試劑說明提取細胞總RNA，并進行反轉錄及RT-PCR檢測。ADAM15上游引物：AGCCTCAAAAAGGTGCTTCA，下游引物：TGGTAGCA GCAGTTCTC；β-actin的上游引物：CACAGAGCCTCGCCTT TGCC，下游引物：ACCCATGCCCACCATCAC。

六、CCK8細胞增殖實驗

根據CCK8試劑說明書，使用CCK-8試劑檢測細胞的增殖能力。將H460細胞以每孔3×103個細胞的密度接種在96孔板中，每孔設計3個復孔，分別在鋪板后24、48、72 h加入10ul CCK8試劑，繼續(xù)放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，然后用酶標儀測定細胞在450nm和630nm的光密度值(OD值)。

七、劃痕實驗

將H460細胞接種在6孔板中，轉染48 h，待細胞密度達到90%后，使用10 μl移液器吸頭以及無菌標尺輕輕、緩慢地在水平線劃一條劃痕，垂直線劃三條劃痕。用PBS洗后換無血清培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)48h。在顯微鏡下分別在0h和48h取同樣的位置進行拍照。

八、小室(Transwell)檢測遷移和侵襲

將H460細胞接種在6孔板中，轉染48 h，待細胞密度達到90%。消化細胞進行計數，然后用含1% FBS的培養(yǎng)基重懸。向基質膠包被的小室上室加入200 ul含12×104細胞的細胞懸液，向基質膠未包被的小室上室加入200ul含8 ×104細胞懸液，下室均加入800ul完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h，取出小室，PBS洗滌后甲醇固定30min，再用結晶紫染色2h，用棉棒輕輕擦去上室面細胞，于顯微鏡下觀察拍照并計數。

九、蛋白質印記(Western blot)檢測蛋白

轉染H460細胞系后使用RIPA法提取細胞總蛋白并制作蛋白樣品。以每孔50ug蛋白樣品加樣，用濕轉法將蛋白轉至NC膜上，一抗4°過夜孵育，TBST洗4次/5 min，二抗室溫孵育2 h，TBST洗4次/5 min，顯影檢測蛋白表達。

十、統(tǒng)計學分析

結 果

一、OSluca網站預測各數據庫中ADAM15與肺癌的預后的關系

通過Osluca網站(http://bioinfo.henu.edu.cn/LUCA/LUCAList.jsp)中的多個數據庫分析了ADAM15對肺癌預后的影響，結果顯示在大多數數據庫中風險比(HR)大于1，表明ADAM15可能與肺癌的預后不良有關(圖1)(P<0.05)。

圖1 OSluca預測各數據庫中ADAM15與肺癌預后的關系

二、ADAM15在肺癌細胞株和肺癌組織中呈高表達

通過Western blot的檢測，ADAM15在正常肺上皮細胞株BEAS-2B和肺癌細胞株A549、H1299、SPC、H460中相對表達水平(圖2A)，定量如(圖2B)。由于ADAM15在H460細胞株中表達較高，故選擇H460細胞株進行后續(xù)實驗。使用實時定量PCR在肺癌組織和相應的癌旁組織中也檢測ADAM15的表達，在20對肺癌組織和相應的癌旁組織中，ADAM15在13對肺癌組織中呈高表達，占比65%(圖3)(t=2.226，P=0.038)。

圖2 ADAM15在肺癌細胞株中呈高表達注：A:Western blot檢測了ADAM15在人支氣管上皮細胞BEAS-2B，以及肺癌細胞A549, H1299, SPC和H460中表達水平(n=3, 每個實驗獨立重復3次); B：為左圖的蛋白定量圖(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001)

圖3 實時熒光定量PCR檢測了ADAM15在肺癌組織和相應的癌旁組織的中的表達水平(n=20,*P<0.05)

三、ADAM15影響H460細胞的增殖，遷移和侵襲

圖4 CCK8實驗反應了H460細胞干擾ADAM15后各組間的細胞增殖能力(n=3, 每個實驗獨立重復3次，***P<0.001)

圖5 劃痕實驗反映了H460細胞干擾ADAM15后各組間的細胞遷移能力(×40)(n=3, 每個實驗獨立重復3次)

四、ADAM15對相關信號通路的影響

在H460細胞中干擾ADAM15后，檢測增殖和轉移有關的相關蛋白的變化，結果表明，磷酸化的AKT和ERK的表達隨著ADAM15的干擾顯著下降，但總的AKT和ERK的表達并沒有顯著變化。隨著ADAM15的干擾，基質金屬蛋白酶9(MMP9)的表達也顯著下降，然而，基質金屬蛋白酶2(MMP2)的表達并沒有明顯變化(圖7A)，定量如(圖7B)，具體參數(見表1)。

圖7 ADAM15對相關信號通路的影響注：A: Western blot檢測了H460細胞干擾ADAM15后各組間ADAM15和下游蛋白的表達水平，β-actin作為內參(n=3, 每個實驗獨立重復3次); B:為左圖的蛋白定量圖(**P<0.01; ***P<0.001)

表1 H460細胞增殖和轉移相關的蛋白相對定量

討 論

據報道，ADAM15在許多惡性腫瘤中表達上調，且ADAM15的高表達與腫瘤的發(fā)展和轉移有關[6-7]。然而，在某些癌癥中，例如結腸癌，ADAM15表達的降低與結腸癌患者的癌癥轉移和預后不良有關[8]，因此，我們認為ADAM15在各種類型的癌癥中起著不同的作用。在我們的研究中，我們發(fā)現ADAM15在肺癌組織中的表達高于癌旁組織，并且我們通過大數據分析觀察到ADAM15的高表達與肺癌患者的不良預后相關。

ADAM15是一種位于細胞膜上的金屬蛋白酶，它是唯一在其去整合素結構域中具有RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)位點的ADAM家族成員，它可以通過與整合素αVβ3，α5β1結合而在細胞粘附中發(fā)揮作用[5, 9-10]，因此，ADAM15是否可以通過整合素介導的信號通路進而在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用值得進一步探討。

磷酸肌醇3激酶(PI3K)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，作為多種重要基因，如表皮生長因子受體(EGFR)的下游通路，已經被證明對肺癌的增殖具有重要作用[11-13]。MMP2和MMP9屬于MMP家族的成員可以降解膠原蛋白和凝膠，和腫瘤的轉移和侵襲有關[14-17]。歐小波等人證明ADAM15可以通過影響MMP9促進乳腺癌侵襲，并將兩者聯合作為評估乳腺癌惡行生物學行為的指標[18]。本研究證明ADAM15通過調控PI3K-AKT和MAPK-ERK信號通路影響H460細胞的增殖，并且ADAM15被干擾后，MMP9的表達隨之減少，而MMP2的表達無明顯變化，表明ADAM15可能通過調控MMP9通路影響H460細胞的遷移和侵襲。

綜上所述，ADAM15的下調可以抑制H460細胞的增殖、遷移和侵襲，這將為肺癌的治療提供新的線索。