周兵 熊基玲 彭麗姿

惡性胸腔積液(malignant pleural effusion ,MPE)為晚期惡性腫瘤臨床常見的并發(fā)癥之一，被認(rèn)為與腫瘤的肺轉(zhuǎn)移或胸部腫瘤直接胸膜侵犯有關(guān)[1]。MPE的產(chǎn)生往往失去手術(shù)機會而無法獲得活檢組織，給腫瘤的診斷及鑒別診斷帶來了不小的困難[2]。既往的MPE檢查多為細(xì)胞學(xué)定性診斷，僅僅能提示良惡性，往往不能確定腫瘤的原發(fā)部位，給臨床的后續(xù)針對性治療造成極大的困擾，而脫落細(xì)胞學(xué)蠟塊技術(shù)在此為我們提供了一個很好的探討方向[3]。本文收集46例MPE細(xì)胞學(xué)蠟塊，并進(jìn)行組織學(xué)切片和免疫組化標(biāo)記，探討細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組化技術(shù)在惡性胸水診斷中的作用，并分析肺腺癌惡性胸水細(xì)胞蠟塊在EGFR和ALK檢測在個體化治療中應(yīng)用價值。

資料與方法

一、一般資料

收集九江市第一人民醫(yī)院病理科2018年6月至2020年1月確診為MPE 46例，其中男性25例(54.3%)，女性21例(45.7%)，男女之比1.19:1；年齡32～84歲，平均年齡48.0±6.3歲。要求送檢MPE為新鮮液體且臨床病理資料齊全。

二、細(xì)胞蠟塊的制片

收集制作細(xì)胞學(xué)涂片后的新鮮MPE，靜置后棄上清液，充分混勻后倒入50mL的離心管，3000 rpm離心10 min，觀察離心后的細(xì)胞沉渣，較少時盡可能的重復(fù)收集幾次(血性MPE提前用冰醋酸處理，盡可能去除紅細(xì)胞影響)。倒出上清液，10%中性甲醛固定15min，再次3000 rpm離心2 min。倒出上清液，75%及 95%酒精處理靜置30min。小心用吸管或長鑷輕輕刮取沉淀物，常規(guī)取材，入包埋盒自動脫水機隔夜脫水，常規(guī)石蠟包埋、切片及HE染色。

三、免疫組化染色及結(jié)果判讀

細(xì)胞蠟塊按3μm厚度切片，置于65℃烤箱中烘烤60min，室溫冷卻，既定程序脫蠟與水化，選取抗體適合的修復(fù)液(胃蛋白酶或檸檬酸)對組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)后分別滴加一抗和二抗， DAB 顯色后進(jìn)行復(fù)染與制片。免疫組化抗體TTF-1、NapsinA、、CK7、p40、CK5/6、 GCDFP-15、ER、CD56、CgA、CA125、Villin、Calretinin、MC、CD20和CD3，DAB顯色試劑盒，3%過氧化氫、檸檬酸、PBS等為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。既往組織學(xué)陽性切片設(shè)陽性對照，以PBS設(shè)為陰性對照。2位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法觀察細(xì)胞蠟塊HE形態(tài)學(xué)變化及根據(jù)抗體定位判定免疫組化標(biāo)記結(jié)果，無染色或淺染色及高倍視野下陽性細(xì)胞比例低于5%判定為陰性。

四、基因檢測

EGFR檢測：細(xì)胞蠟塊切厚度8μm白片15張，二甲苯脫蠟后梯度酒精脫水后入EP管，嚴(yán)格按照DNA FFPE基因抽提試劑盒(德國Qiagen公司)的說明書提取DNA樣品，紫外分光光度計檢測DNA純度和濃度保持在合適范圍。ARMS法：實時熒光定量PCR儀檢測EGFR基因突變，EGFR試劑盒(武漢友芝友醫(yī)療公司)檢測11個外顯子18-21的突變，包括G719S、G719C、G719A、S768i、T790M、L858R、1861 q、外顯子19缺失和外顯子20三個插入突變，對過程中熒光信號強度進(jìn)行實時檢測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。參考內(nèi)參基因進(jìn)行解讀，通過baseline劃線，確定目的基因產(chǎn)物ct值與內(nèi)參基因ct值的大小，如果ct值比內(nèi)參ct值大(高出baseline的曲線)，即出現(xiàn)該位點突變，反之則為突變陰性。

ALK檢測：細(xì)胞蠟塊4μm厚度切片，常規(guī)脫蠟、入無水乙醇及胃蛋白酶消化后。滴加10μL ALK雙色分離探針(美國Abbott Molecular公司)，原位雜交儀75 ℃變性5min，37 ℃雜交過夜，加10μL DAPI復(fù)染劑，熒光倒置顯微鏡觀察，每個樣本分析100個腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞核≥15%細(xì)胞有紅、綠信號分離(信號間距超過2個信號直徑)或出現(xiàn)單紅信號認(rèn)為ALK重排陽性。

五、統(tǒng)計分析

結(jié) 果

一、細(xì)胞蠟塊HE切片觀察

細(xì)胞蠟塊HE切片鏡下背景為數(shù)量不等的淋巴細(xì)胞及間皮細(xì)胞，其間見多量腫瘤細(xì)胞集中分布，散在或成團(tuán)簇狀排列；異型腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，高核漿比，核膜增厚且不規(guī)則，染色質(zhì)粗，部分腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)豐富，可見明顯核仁，腫瘤細(xì)胞呈片狀脫落，保持有原始腫瘤組織學(xué)結(jié)構(gòu)。肺腺癌呈腺腔樣或乳頭狀(圖1a)；乳腺癌呈團(tuán)塊狀、片狀(圖c)；肺鱗狀細(xì)胞癌呈巢團(tuán)狀、散在排列；同時肺小細(xì)胞癌、淋巴瘤及卵巢癌及間皮瘤細(xì)胞蠟塊，也具有相對應(yīng)的組織學(xué)結(jié)構(gòu)。

二、免疫組化診斷分型

46例MPE細(xì)胞蠟塊標(biāo)本經(jīng)免疫組化標(biāo)記證實肺腺癌來源27例，占所有病例的58.7%，主要表達(dá)CK7、TTF-1(圖1b)和Napsin A。乳腺癌來源6例，占所有病例的13.0%，免疫組化表達(dá)CK7、GCDFP-15(圖1d)及絕大部分的ER。肺鱗狀細(xì)胞癌來源4例，占所有病例的8.7%，主要表達(dá)P40和CK5/6。肺小細(xì)胞癌來源3例，占所有病例的6.5%，均表達(dá)特異性的神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)記CD56和CgA，同時TTF-1也有部分表達(dá)。淋巴瘤來源3例，占所有病例的6.5%， B細(xì)胞來源2例、T細(xì)胞淋巴瘤1例，腫瘤細(xì)胞分別表達(dá)B細(xì)胞來源的CD20和T細(xì)胞來源的CD3。卵巢癌來源2例，免疫組化表達(dá)CK7、CA125、ER及部分的Villin。間皮瘤來源1例，表達(dá)特異性間皮來源標(biāo)記CR和MC，同時還表達(dá)CK5/6(見表1)。

圖1 MPE細(xì)胞蠟塊鏡下形態(tài)及免疫組化表達(dá) a肺腺癌細(xì)胞蠟塊切片(HE×100),b. 肺腺癌TTF-1(+)(EnVision×100),c. 乳腺癌細(xì)胞蠟塊切片(HE×100),d. 乳腺癌GCDFP-15(+)(EnVision×100),e. ALK基因重排(+)

表1 細(xì)胞蠟塊免疫組化結(jié)果(n=46,%)

三、基因檢測

EGFR檢測：21例接受基因檢測的肺腺癌MPE細(xì)胞蠟塊中，共檢出10例(55.6%)EGFR基因突變，其中19號外顯子缺失EGFR-19del突變5例(圖1e)，21號外顯子EGFR-L858R突變4例，20號外顯子ins插入突變1例，未檢出其它3個18號外顯子(G719S、G719C、G719A)、2個20號外顯子(S768i、T790M)和21號外顯子L861 q突變；突變病例中男性突變6例，年齡<60歲突變4例。

ALK檢測：21例肺腺癌MPE細(xì)胞蠟塊中檢出2例(9.5%)ALK基因重排陽性病例(圖1f)，均為EGFR突變陰性病例；突變病例男女各1例，其中<60歲1例。

討 論

當(dāng)患者發(fā)生MPE時，意味著該患者已經(jīng)處于絕對晚期，往往無法通過手術(shù)獲得活檢組織而缺乏病理診斷依據(jù)，給后續(xù)的臨床治療帶來了困難[4]。傳統(tǒng)的胸腔積液脫落細(xì)胞學(xué)涂片雖然操作簡單，但由于手工操作厚薄不均，背景臟亂，給閱片造成了極大的困難，容易生成假陽性和假陰性片，極大的影響了診斷水平[5]。而脫落細(xì)胞學(xué)蠟塊檢查則很好的解決這一難題，蠟塊HE切片厚薄一致，背景干凈，干擾少，且胸腔積液能夠?qū)γ撀浼?xì)胞進(jìn)行有效的收集，制作細(xì)胞蠟塊后容易長期保存，同時可以用于免疫組化檢查確定腫瘤的原發(fā)部位和分子研究材料的收集，得到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛認(rèn)同[6]。本研究結(jié)果顯示，MPE細(xì)胞蠟塊腫瘤細(xì)胞更豐富，細(xì)胞結(jié)構(gòu)更清晰，各種類型腫瘤細(xì)胞都存在一定的原始腫瘤的排列方式，有助于診斷與鑒別診斷。

由于MPE細(xì)胞成分復(fù)雜，含有多量的炎癥細(xì)胞、間皮細(xì)胞及組織細(xì)胞，且部分非炎癥細(xì)胞結(jié)構(gòu)多樣，如發(fā)生反應(yīng)性增生或細(xì)胞蛻變，單純依靠細(xì)胞學(xué)或蠟塊組織學(xué)，很難將其與腫瘤細(xì)胞區(qū)別開來。然而，細(xì)胞蠟塊加做免疫組織化學(xué)標(biāo)記能夠為此提供很好的幫助，不僅能夠鑒別脫落細(xì)胞的良惡性，而且在后續(xù)工作中采用免疫組化對各器官來源的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)記[7]。Wu等認(rèn)為雖然脫落細(xì)胞學(xué)玻片能夠較快的提供診斷信息，但細(xì)胞蠟塊免疫組織化學(xué)，仍然是MPE最為重要的診斷依據(jù)[8]。本研究制作脫落細(xì)胞蠟塊后免疫組織化學(xué)標(biāo)記，結(jié)果顯示肺腺癌作為MPE最常見的腫瘤來源，占惡性胸腔積液的一半以上，這和既往的研究結(jié)果類似，免疫組化肺II型肺泡上皮標(biāo)記特異性抗體TTF-1和NapsinA被證實為最可靠的標(biāo)記，兩者聯(lián)合應(yīng)用被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移性肺腺癌的確診依據(jù)[9]。乳腺癌為MPE較為常見的腫瘤來源，絕大多數(shù)見于女性患者，聯(lián)合乳腺癌特異性標(biāo)記GCDFP-15及ER可以確診。肺鱗癌為胸部常見的腫瘤，但一般為中央型且較少產(chǎn)生積液，聯(lián)合鱗狀上皮特有的標(biāo)記物P40和CK5/6可以確診。因肺小細(xì)胞癌惡性程度高且侵襲能力強，在MPE中也不少見，雖然也表達(dá)TTF-1，但是聯(lián)合CD56和CgA等特異性的神經(jīng)內(nèi)分泌抗體和特征性的形態(tài)特點，可以很好與其它腫瘤鑒別開來；淋巴瘤來源的MPE也不少見，但要和正常的淋巴細(xì)胞相鑒別，結(jié)合既往淋巴瘤病史及異型的淋巴細(xì)胞及特異性的CD20、CD3等淋巴瘤抗體，可以鑒別和分類。卵巢癌轉(zhuǎn)移至肺后，產(chǎn)生的MPE較少，聯(lián)合應(yīng)用CA125和ER抗體陽性，結(jié)合病史可以準(zhǔn)確診斷。而胸膜原發(fā)的間皮瘤則較為罕見，表達(dá)特異性，間皮來源標(biāo)記CR和MC。簡而言之，免疫組化抗體的選擇是要綜合臨床病史及細(xì)胞學(xué)形態(tài)聯(lián)合選用，遇到疑難病例和抗體表達(dá)不確切時應(yīng)加做標(biāo)記項目，同時結(jié)合免疫組化抗體間的不同表達(dá)特點綜合判斷。由于腫瘤的分子檢測和靶向治療的引入，極大的改善了晚期病人的預(yù)后，因此對于細(xì)胞蠟塊提出更高的要求，盡可能的多收集細(xì)胞離心制作細(xì)胞蠟塊，以期獲得更多的腫瘤學(xué)標(biāo)本，同時我們應(yīng)在滿足診斷的前提下，少加做免疫組化項目，以多保留蠟塊中腫瘤成分，以利于后續(xù)驅(qū)動基因檢測研究[10]。

近年來，針對于EGFR突變和ALK融合基因的特定的靶向藥物的引入極大地改變了晚期肺腺癌的治療策略，但個體化治療需要精準(zhǔn)的驅(qū)動基因檢測結(jié)果，而既往多推薦手術(shù)組織學(xué)標(biāo)本，針對于晚期不能手術(shù)的病人，2018年美國臨床腫瘤學(xué)協(xié)會(American Society of Clinical Oncology,ASCO)指南認(rèn)為當(dāng)無法獲取組織學(xué)標(biāo)本的前提下，脫落細(xì)胞學(xué)蠟塊可以作為驅(qū)動基因的備選組織來源是合適的[11]。本研究對其中的21例肺腺癌MPE細(xì)胞蠟塊完成了基因檢測。EGFR基因突變率55.6%，其中以19號外顯子缺失和21號外顯子L858R突變最為多見，突變率和突變位點均與國內(nèi)外的大部分研究結(jié)果類似，同時檢出1例20號ins插入突變病例，目前針對于該突變研究較少，尚不能明確其臨床意義[12]。ALK基因重排率9.5%，突變率與既往研究類似；既往研究認(rèn)為ALK基因突變與年輕及女性患者有關(guān)，但本次納入病例較少，尚不能發(fā)現(xiàn)相互聯(lián)系[13]。

總之，細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組化技術(shù)應(yīng)成為惡性胸水常規(guī)的檢查手段，不僅能提高惡性腫瘤的診斷率，還可以判斷惡性腫瘤的組織學(xué)來源；同時MPE細(xì)胞學(xué)蠟塊作為合格的分子學(xué)檢測樣本，為晚期肺腺癌后續(xù)的針對性靶向治療奠定了良好的基礎(chǔ)。