郭漢青，莊 坤，馬茵茵，陳曉露*

(1.西安市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 西安 710003；2.陜西省人民醫(yī)院，陜西 西安 710068)

我國是胃癌的高發(fā)國家[1]，近年來隨著內(nèi)鏡技術(shù)的推廣，胃癌的診斷率越來越高，但由于中晚期胃癌預(yù)后差，如何甄別早期胃癌甚至癌前病變，對于降低胃癌的發(fā)病率和死亡率具有重要意義。胃黏膜的腸上皮化生是胃癌最重要的癌前病變，也是腸型胃癌的高危因素[2]。在經(jīng)典的胃癌演變過程中，從慢性萎縮性胃炎到腸上皮化生、非典型增生再到胃癌[3]，是一個基因調(diào)控和表達(dá)異常積累的過程，包括編碼蛋白的相關(guān)基因的表達(dá)異常，諸如microRNA等非編碼RNA的表達(dá)異常，其病因涉及Hp感染和膽汁酸反流等[4]。前期研究表明miRNA-296在胃癌中的表達(dá)明顯高于癌旁的腸化生組織，并且miRNA-296通過調(diào)控靶基因CDX1的表達(dá)進(jìn)而影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展[5]。但在胃黏膜的癌前病變多階段中，miRNA-296的表達(dá)及調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。本研究通過檢測miRNA-296-5p及miRNA-296-3p在慢性淺表性胃炎(chronic superficial gastritis,CSG)、慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)、腸上皮化生(intestinal metaplasia,IM)和異型增生(dysplasia,Dys)組織中的表達(dá)，分析miRNA-296-5p/3p在胃黏膜癌前病變中的表達(dá)情況，并通過膽汁酸刺激胃黏膜細(xì)胞，檢測其對miRNA-296表達(dá)的影響，從而揭示其在胃黏膜癌前病變中的意義。

1 對象與方法

1.1組織芯片分組

本研究所用組織芯片購買自艾莉娜生物公司，為182例患者的石蠟包埋胃組織樣本，每份樣本來自不同患者。依據(jù)Pelayo Correa，等[6]對胃黏膜癌前病變的分類方法，將182例病變組織分為4組：慢性淺表性胃炎(CSG)組45例、慢性萎縮性胃炎(CAG)組47例、腸上皮化生(IM)組59例、異型增生(Dys)組31例。各組患者年齡及性別組成具有可比性(P>0.05)。

1.2 主要試劑

地高辛(DIG)3′端和5′端雙標(biāo)記的miR-296-5p和miR-296-3p探針購買于EXIQON公司；原位雜交檢測試劑盒和寡核苷酸稀釋液購自Qiagen公司；顯示系統(tǒng)為生物素化鼠抗地高辛和過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素-生物復(fù)合物(SABC)；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基均購自美國Thermo公司，人胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫；鵝去氧膽酸(CDCA)購自Sigma公司；TRizol試劑購自Invitrogen公司；PrimeScript Rt試劑盒購自TaKaRa公司；PCR引物由廣州銳博生物技術(shù)公司合成。

1.3 原位雜交觀察miRNA-296-3p/5p在胃組織中的表達(dá)

將組織芯片進(jìn)行烤片、脫蠟，梯度乙醇依次水化，各5 min；磷酸緩沖鹽液(PBS)沖洗2次，每次30 s；4%多聚甲醛固定10 min，1×PBS沖洗2次，每次5 min；0.3%枸櫞酸稀釋蛋白酶K10 g/mL，37℃消化5 min；0.1 M PBS(pH7.2)浸泡10 min；0.1 M甘氨酸/0.1 M PBS浸泡5 min；0.3%TritonX-100/0.1 M PBS浸泡10～15 min。0.1M PBS沖洗5 min×3次，加蛋白酶K(1 μg/mL)，37℃孵育30 min。 4%多聚甲醛固定5min。0.1 M PBS沖洗5 min×2次，浸入新鮮配制的含0.25%乙酸酐/0.1 M三乙醇胺中10 min。滴加適量預(yù)雜交液，42℃ 30 min。棄雜交液，切片上滴加10 μL雜交液(將探針變性后稀釋在預(yù)雜交液中，0.5 ng/μL)，覆以蓋玻片或蠟?zāi)ぃ?2℃過夜。4×枸櫞酸氯化鈉緩沖液(SSC)、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20 min；0.2×SSC 37℃沖洗10 min；0.2×SSC與0.1 M PBS各沖洗10 min；0.05 M PBS沖洗5 min×2次。3%BSA/0.05 M PBS 包被，37℃ 30 min。滴加抗地高辛-抗血清堿性磷酸酶復(fù)合物(以抗體稀釋液1∶5000稀釋)4℃孵育過夜。0.05 M PBS沖洗15 min×4次；TSM1 10 min×2次； 新鮮配制TSM2 10 min×2次。顯色：在玻片上滴加適量顯色液，4℃避光過夜，將玻片置于TE中10～30 min以終止反應(yīng)，酒精梯度脫水、二甲苯脫脂，中性樹膠封片。陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)比例評分標(biāo)準(zhǔn)：<1% (0分),1%～25% (1分),26%～50% (2分),51%～75% (3分),>75%(4分)；染色程度強(qiáng)弱評分：陰性(0分),+ (1分),++ (2分)，+++ (3分)。上述積分相乘得到積分0～4分為低表達(dá)，5～12分為高表達(dá)。染色結(jié)果均由病理醫(yī)師判讀和確認(rèn)。

1.4 CDCA刺激GES-1細(xì)胞及RNA檢測方法

人胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中；CDCA刺激細(xì)胞方法: GES-1細(xì)胞貼壁培養(yǎng)，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，50 μM CDCA刺激24 h，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA。通過TRizol試劑提取培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA，使用PrimeScript RT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR。采用加尾法對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行miRNA表達(dá)量的檢測，3′-5′均為Poly U,5′-3′的引物序列如下：min-296-5P為TGCCTAATTCAGAGGGTTGG，miRNA-256-3p為GAGGGTTGGGTGGAGGCTCTCC，使用SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa)進(jìn)行實(shí)時定量PCR，并在LightCycler 480系統(tǒng)(羅氏)中進(jìn)行測量。U6表達(dá)用作內(nèi)部對照，U6引物：U6-F:5-GCGCGTGCTGAAGCGTTC-3，U6-R：5-GTGCAGGGTCCGAGGT-3。2-△△CT是指與校準(zhǔn)樣品相比，一個樣品的RNA表達(dá)的倍數(shù)變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計數(shù)資料用卡方檢驗，計量資料使用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不同程度胃黏膜病變中miR-296-5p和miR-296-3p的表達(dá)情況

在CSG、CAG、IM、Dys病變組織中，miR-296-5p的高表達(dá)率分別為75.6%(34/45)，74.5%(35/47)，33.9%(20/59)，32.3%(10/31)，與CSG相比，miR-296-5p在CAG中的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而在IM、Dys中的表達(dá)均明顯降低(均P<0.001)；miR-296-3p的高表達(dá)率分別為73.3%(33/45)，61.7%(29/47)，50.8%(30/59)，29.0%(9/31)，與CSG相比，miR-296-3p在CAG中的表達(dá)無顯著變化，而在IM、Dys中的表達(dá)均明顯降低(P<0.05，P<0.001)，詳見表1、圖1。

圖1 miR-296-5p及miR-296-3p在胃黏膜癌前病變組織中的表達(dá)(SP×80/SP×16)

表1 各組中miR-296-5p和miR-296-3p的表達(dá)統(tǒng)計分析

2.2 CDCA刺激后miRNA-296-5p/3p表達(dá)情況

以空白(NC)組中mir-296-5p的表達(dá)為參照，經(jīng)CDCA刺激人胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1細(xì)胞后miRNA-296-5p和miRNA-296-3p的表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖2)。

圖2 CDCA刺激造成miR-296-5p和miR-296-3p在胃細(xì)胞中表達(dá)降低

3 討論

miRNAs是重要的小非編碼RNAs，通常在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常，miRNA通過抑制原癌基因和抑癌基因mRNA的退化或中斷翻譯或兩者結(jié)合發(fā)揮作用[7]。在這些miRNAs中，miR-296被發(fā)現(xiàn)在調(diào)控多種惡性腫瘤表型的發(fā)生和發(fā)展中起一定作用。在食管癌中，高表達(dá)的miR-296預(yù)示低生存率，而降低miR-296水平，在體內(nèi)和體外通過調(diào)節(jié)cyclinD1和p27可抑制癌細(xì)胞生長[8]。也有研究發(fā)現(xiàn)miR-296在肝癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞富集，通過下調(diào)p53～p21通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[9]，我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，在胃癌惡性轉(zhuǎn)化中，miR-296能夠抑制靶基因CDX1的表達(dá)[5]，從而抑制細(xì)胞增殖。CDX1是腸化生的關(guān)鍵標(biāo)志分子，在腸化生組織中表達(dá)明顯升高，因此miR-296能夠促進(jìn)腸化生組織向胃癌組織進(jìn)展。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)胃黏膜癌前病變中miR-296的成熟體，miR-296-5p和miR-296-3p的表達(dá)均逐漸降低，同CSG相比，IM和Dys的胃黏膜組織中，miR-296的表達(dá)均明顯降低。因而通過原位雜交的方法明確miR-296在胃炎患者中的表達(dá)情況，可能具有篩選IM和Dys組織，識別胃黏膜癌前病變的應(yīng)用前景。但因本研究樣本量較小，仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行臨床驗證，并對不同類型的腸化生和非典型增生進(jìn)行分層分析。

腸化生是胃黏膜癌前病變的重要步驟，其過程受到多種因素的調(diào)控。目前認(rèn)為，引起胃黏膜腸化生的機(jī)制包括幽門螺旋桿菌感染、高鹽飲食、吸煙、膽汁反流等[4]。其中，膽汁酸作為腸化生的關(guān)鍵誘發(fā)機(jī)制在近年來逐漸受到重視，大量臨床研究證明，胃液中反流的膽汁酸與腸化生發(fā)生密切相關(guān)[10]；基礎(chǔ)研究也發(fā)現(xiàn)，人為造成膽汁酸反流的動物模型，能誘導(dǎo)食管和胃黏膜發(fā)生腸化生[11]。膽汁酸在機(jī)體的天然受體中法尼醇X受體(Farnoid X Receptor，F(xiàn)XR)的研究最為深入[12]，膽汁酸作為其天然配體，激活FXR后能夠使后者進(jìn)入細(xì)胞核并結(jié)合于特定基因啟動子區(qū)域，從而調(diào)控廣泛的靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，膽汁酸CDCA刺激胃上皮細(xì)胞GES-1后，引起miR-296表達(dá)降低，結(jié)合我們前期發(fā)現(xiàn)miR-296靶向CDX1的結(jié)果，這些數(shù)據(jù)提示膽汁酸抑制miR-296表達(dá)，可能是腸化生的胃黏膜組織中CDX1表達(dá)逐漸升高的原因之一。

綜上所述，本研究顯示在胃黏膜病變早期階段miR-296-5p/3p表達(dá)水平較高，并且隨著胃黏膜病變進(jìn)展到萎縮性胃炎、腸上皮化生、異型增生等癌前病變階段，miR-296-5p/3p表達(dá)下調(diào)。本研究提示miR-296-5p/3p在胃黏膜病變演變過程中可能起保護(hù)作用，并從分子通路水平上闡述了CDCA等膽汁酸可能為內(nèi)源性致癌因子，導(dǎo)致胃上皮細(xì)胞發(fā)生腸化生乃至癌變。