趙儷月，巴曉曄，王寶彥

(1．廣州市第一人民醫(yī)院口腔科，廣東 廣州 510180；2.西安高新醫(yī)院口腔科，陜西 西安 710075；3.西安交通大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜科，陜西 西安 710004)

牙周炎作為一種慢性感染性疾病，是天然牙喪失的重要原因。治療的難點(diǎn)是如何使已被破壞的牙周組織得到再生。牙周再生有兩項(xiàng)基本要素，包括病損區(qū)存在未分化的干細(xì)胞[1]，以及它們需要首先黏附于病損區(qū)的牙根表面[2-3]。牙周膜干細(xì)胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)是兩種具有牙周再生能力的干細(xì)胞[4-7]，常在牙周組織需要修復(fù)時(shí)遷移到受損區(qū)幫助修復(fù)[4，6]。它們通常會(huì)表達(dá)多種整合素，后者在細(xì)胞的黏附行為中起到關(guān)鍵作用[3、8]，在整合素家族中，α5β1可能與PDSLCs和BMMSCs的黏附過(guò)程最為相關(guān)[9-10]。苯妥英鈉(Phenytoin,PHT)已被證實(shí)具有促進(jìn)rPDLSCs遷移到牙周缺損區(qū)及黏附于牙根表面的功能[11-12]，但具體的機(jī)制尚不清楚。本項(xiàng)研究的目的旨在觀察并對(duì)比PHT對(duì)rBMMSCs和rPDSLCs黏附于牙骨質(zhì)的影響，并探究整合素α5β1在該過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 rBMMSCs、rPDLSCs的分離及鑒定

1.1.1 rBMMSCs的原代培養(yǎng) 脫頸法處死6周齡SD大鼠，取股骨，用含20%FBS(Hyclone，美國(guó))的DMEM-F12培養(yǎng)液(Hyclone，美國(guó))反復(fù)沖洗骨髓腔。密度梯度離心法獲得rBMMSCs。有限稀釋法純化細(xì)胞。

1.1.2 rPDLSCs原代培養(yǎng) 脫頸法處死6周齡SD大鼠；分離上下頜切牙，刮取根中1/3的牙周膜，采用常規(guī)酶消化法+組織塊法獲取rPDLSCs。有限稀釋法純化細(xì)胞。

1.1.3 rBMMSCs、rPDLSCs的鑒定 鑒定rBMMSCs、rPDLSCs的方法如下：①形態(tài)學(xué)觀察、生長(zhǎng)特性觀察；②成骨、成脂誘導(dǎo)分化；③流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面標(biāo)記物。

1.2 黏附實(shí)驗(yàn)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將每個(gè)制好的相同大小牙骨質(zhì)片置于96孔板內(nèi)1孔內(nèi)，使rBMMSCs、rPDLSCs分別與牙骨質(zhì)片共同培養(yǎng)，并各分為4個(gè)處理組，A組：PBS(沃爾森，中國(guó))處理，作為空白對(duì)照；B組：40 mg/L PHT(沃爾森，中國(guó))處理；C組：40 mg/L PHT+整合素α5抗體(Millipore，美國(guó))處理，D組：40 mg/L PHT+整合素β1抗體(Abcam，英國(guó))處理，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。細(xì)胞密度為105個(gè)/mL，37℃、5%CO2條件下處理4 h。

1.2.2 黏附細(xì)胞計(jì)數(shù) 處理結(jié)束后，用DMEM-F12培養(yǎng)基沖洗牙骨質(zhì)片兩遍，再將它們放入新鮮的DMEM-F12培養(yǎng)基中，在旋轉(zhuǎn)振蕩儀上振蕩3 min(75 rpm)，以去除未黏附的或黏附力較弱的細(xì)胞。處理后的牙骨質(zhì)片放于新的96孔板中，每孔加入100 μL DMEM-F12培養(yǎng)基和10 μL WST-8溶液(碧云天，中國(guó))，37℃、5%CO2條件下孵育2 h。之后將96孔板放入酶標(biāo)儀，在450 nm波長(zhǎng)條件下檢測(cè)吸光度。用Image-ProPlus軟件算得各牙骨質(zhì)片的面積，算出16 mm2面積牙骨質(zhì)片上的細(xì)胞的OD值。

1.3 PHT對(duì)rBMMSCs、rPDLSCs表達(dá)整合素α5、β1的影響

1.3.1 實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定細(xì)胞整合素α5β1的表達(dá)從GenBank(Pubmed)選取靶基因mRNA的全長(zhǎng)序列，使用引物和探針設(shè)計(jì)軟件Primer Express設(shè)計(jì)引物序列如下(見(jiàn)表1)，所用引物序列乃由上海生工公司合成。

表1 引物序列

rBMMSCs、rPDLSCs分別在使用不含PHT、含PHT(40 mg/L)的DMEM-F12培養(yǎng)液(10%FBS，1%雙抗)培養(yǎng)4 h后，收集細(xì)胞，提取RNA，經(jīng)過(guò)濃度及純度測(cè)定后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。qRT-PCR反應(yīng)體系如下：cDNA溶液2 μL、上下游引物(10μM)各1 μL、dH2O 8.5 μL、SYBRPremixExTaqII(2×)12.5 μl，所用PCR試劑盒購(gòu)于日本Takara。

具體反應(yīng)條件：95℃30 s，1個(gè)循環(huán)；95℃5 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)；95℃15 s，60℃30 s，95℃15 s，1個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，根據(jù)2-△△Ct算法，求出目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 Western blot檢測(cè)細(xì)胞整合素α5β1的表達(dá)rBMMSCs、rPDLSCs在使用不含PHT、含PHT(40 mg/L)的DMEM-F12培養(yǎng)液(10%血清，1%雙抗)中各培養(yǎng)4 h后，收集細(xì)胞。用蛋白裂解液(沃爾森，中國(guó))提取總蛋白，PAGE-SDS電泳分離蛋白，然后把蛋白凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，行轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，放封閉液后，分別加入一抗【兔抗大鼠integrinα5單克隆抗體(Millipore，美國(guó))、兔抗大鼠integrin-β1單克隆抗體(Abcam，英國(guó))】，4℃振蕩過(guò)夜。清洗后加入二抗，室溫下孵育2 h，用凝膠成像儀對(duì)蛋白表達(dá)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 rBMMSCs、rPDLSCs的鑒定

2.1.1 rBMMSCs、rPDLSCs的形態(tài)觀察 rBMMSCs剛接種時(shí)為懸浮的圓形細(xì)胞。2 d換液后可見(jiàn)貼壁細(xì)胞，呈現(xiàn)出少量分散的梭性或不規(guī)則多突起的初始貼壁細(xì)胞。培養(yǎng)至第6～7 d，可見(jiàn)有細(xì)胞克隆形成，細(xì)胞由克隆中心向外擴(kuò)散生長(zhǎng)，并相互融合。細(xì)胞貼壁牢固，不易消化。篩選并傳代以后的細(xì)胞漸向多角形細(xì)胞轉(zhuǎn)化，不呈克隆樣生長(zhǎng)，為均勻分布于培養(yǎng)皿底部的生長(zhǎng)狀態(tài)(見(jiàn)圖1A)。

圖1 rBMMSCs和rPDLSCs(×100)

原代rPDLSCs細(xì)胞克隆形成平均在第7～14天，克隆內(nèi)的細(xì)胞呈梭型、緊密相鄰，中央細(xì)胞邊界不清，形態(tài)為不規(guī)則或圓形，周邊細(xì)胞為梭型、多角形。傳代后細(xì)胞貼壁快、生長(zhǎng)旺盛而均勻，呈長(zhǎng)梭形，類(lèi)似成纖維樣細(xì)胞(見(jiàn)圖1B)。

2.1.2 rBMMSCs、rPDLSCs體外誘導(dǎo)分化 ①成骨誘導(dǎo) rBMMSCs、rPDLSCs在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)8 d后體積增大、生長(zhǎng)旺盛，12 d左右細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)轭?lèi)似方形或多角形。21 d后可見(jiàn)礦化結(jié)節(jié)產(chǎn)生，茜素紅染色陽(yáng)性，對(duì)照組染色陰性(見(jiàn)圖2-1、圖2-2)。②成脂誘導(dǎo) rBMMSCs、rPDLSCs成脂誘導(dǎo)5 d后，可見(jiàn)部分細(xì)胞變?yōu)槎嘟切?，?0天鏡下觀察見(jiàn)細(xì)胞體積增大，油紅O染色見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)染色陽(yáng)性的脂滴，對(duì)照組未見(jiàn)胞內(nèi)有陽(yáng)性染色的脂滴(見(jiàn)圖3-1、圖3-2)。成脂、成骨誘導(dǎo)結(jié)果說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)分離的細(xì)胞具有干細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化潛能。

圖2-1 rBMMSC的成骨誘導(dǎo)茜素紅染色(×100)

圖2-2 rPDLSCs的成骨誘導(dǎo)茜素紅染色(×100)

圖3-1 rBMMSC的成脂誘導(dǎo)油紅O染色(×200)

圖3-2 rPDLSCs的成脂誘導(dǎo)油紅O染色(×200)

2.1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)rBMMSCs、rPDLSCs的表型流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示rBMMSCs細(xì)胞表面分子CD90、CD44陽(yáng)性表達(dá)率分別為96.3%和97.1%，CD45、CD34陽(yáng)性表達(dá)率分別是1.9%和8.4%(見(jiàn)圖4-1)，rPDLSCs細(xì)胞表面分子CD29陽(yáng)性表達(dá)率為97.8%、CD44陽(yáng)性表達(dá)率為94.1%，CD45、CD34則分別為1.2%和9.3%(見(jiàn)圖4-2)。均符合rBMMSCs、rPDLSCs表面特異性標(biāo)志物特征。

圖4-1 流式細(xì)胞儀鑒定rBMMSC表面標(biāo)記物

圖4-2 流式細(xì)胞儀鑒定rPDLSCs表面標(biāo)記物

2.2 PHT對(duì)rBMMSCs、rPDLSCs黏附的影響與整合素α5β1的關(guān)系

經(jīng)過(guò)PHT處理后，黏附于牙骨質(zhì)片的rBMMSCs、rPDLSCs細(xì)胞數(shù)量多于對(duì)照組，但在干預(yù)過(guò)程中加入整合素α5或整合素β1抗體(C、D組)，均使黏附于牙骨質(zhì)片上的細(xì)胞數(shù)目減少，且C、D組的黏附細(xì)胞數(shù)量少于對(duì)照組(P<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)，將rBMMSCs與rPDLSCs的黏附數(shù)目對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖5)。

圖5 整合素α5、β1抗體對(duì)PHT促進(jìn)rBMMSCs、rPDLSCs黏附作用的影響

2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)PHT對(duì)rBMMSCs、rPDLSCs的整合素α5、β1表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，PHT處理后的rBMMSCs、rPDLSCs的整合素α5、整合素β1的基因表達(dá)量顯著升高(P<0.01)。另外，無(wú)論在實(shí)驗(yàn)組還是對(duì)照組，將rBMMSCs與rPDLSCs的整合素α5、整合素β1mRNA表達(dá)量相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖6)。

圖6 PHT對(duì)rBMMSCs、rPDLSCs表達(dá)整合素α5、β1mRNA的影響

2.4 Western blot檢測(cè)PHT對(duì)rBMMSCs、rPDLSCs的整合素α5、β1表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，PHT處理后，rBMMSCs、rPDLSCs中整合素α5、整合素β1表達(dá)均增加(P<0.05)。在實(shí)驗(yàn)組內(nèi)和對(duì)照組內(nèi)，將rBMMSCs與rPDLSCs的整合素α5、整合素β1蛋白表達(dá)量相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖7)。

圖7 PHT對(duì)rBMMSCs、rPDLSCs表達(dá)整合素α5、β1蛋白的影響

注：*：與對(duì)照組相比，P<0.05

3 討論

牙周組織再生的基礎(chǔ)是缺損區(qū)必須存在具有分化潛能的干細(xì)胞[1]。PDLSCs、BMMSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，能夠在組織受損后遷移到病損區(qū)，且在合適的理化條件下分化為成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞從而形成牙周軟硬組織，是重要的牙周再生的細(xì)胞來(lái)源。將它們植入牙周缺損中，可以減少探診出血、增加臨床附著水平和修復(fù)牙槽骨缺損[4-6，13]。因此，上述兩種細(xì)胞均為有牙周再生潛能的干細(xì)胞。在組織工程學(xué)中，將干細(xì)胞移植到目標(biāo)區(qū)域或器官時(shí)，移植細(xì)胞的黏附效率會(huì)影響再生效果[7]。同時(shí)，牙周組織破壞后能否形成理想的愈合形式，也取決于破壞區(qū)的根面會(huì)被什么細(xì)胞優(yōu)先黏附及占據(jù)[2]。所以，為了發(fā)揮PDLSCs和BMMSCs重要的牙周再生作用，關(guān)鍵是研究如何使它們加速黏附到根面上。

目前，關(guān)于干細(xì)胞黏附的促進(jìn)劑，研究較多的對(duì)象為生長(zhǎng)因子[14-16]。生長(zhǎng)因子可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種行為，包括促進(jìn)細(xì)胞遷移和黏附等[15-16]。但有學(xué)者指出，將其直接應(yīng)用于機(jī)體時(shí)，存在代謝清除快、牙周再生效果有限且不可預(yù)測(cè)、使用成本較高等缺點(diǎn)[6]。

本研究選擇了PHT作為干細(xì)胞黏附、牙周再生的促進(jìn)劑，具有價(jià)格低廉、性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。在課題組前期的研究中，已經(jīng)證實(shí)PHT可以促進(jìn)rPDLSCs黏附于牙骨質(zhì)片，在PHT濃度低于40 mg/L時(shí)，促進(jìn)作用隨濃度增高逐漸增強(qiáng)，但在40～100 mg/L濃度范圍時(shí)，該作用與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)[12]。因此，在本實(shí)驗(yàn)中筆者選擇的PHT濃度為40 mg/L，結(jié)果提示該濃度的PHT同樣可以提高rBMMSCs在牙骨質(zhì)片上的黏附數(shù)目。證明合適濃度的PHT能夠促進(jìn)rBMMSCs、rPDLSCs黏附于牙根面上。

整合素是一種介導(dǎo)細(xì)胞黏附的跨膜蛋白，它在牙周組織愈合過(guò)程中起重要作用。動(dòng)物研究證實(shí)，整合素α5β1參與調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞黏附到種植體-骨界面并成骨的過(guò)程[17]。Ivanovski，等[9]研究結(jié)果顯示，整合素α5β1可以介導(dǎo)牙齦和牙周膜來(lái)源的成纖維細(xì)胞黏附在牙骨質(zhì)上。由此，本課題組認(rèn)為：PHT促進(jìn)rBMMSCs、rPDLSCs黏附的作用可能與整合素α5β1的表達(dá)相關(guān)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PHT對(duì)rBMMSCs、rPDLSCs黏附的增強(qiáng)作用在加入整合素α5、β1亞基抗體后，被明顯減抑制。說(shuō)明整合素α5β1在rBMMSCs、rPDLSCs黏附于牙根面的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。PHT增強(qiáng)rBMMSCs、rPDLSCs黏附的作用也與整合素α5β1的表達(dá)密切相關(guān)。

在后續(xù)試驗(yàn)中，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和Western-blot方法對(duì)PHT處理前后的rBMMSCs、rPDLSCs進(jìn)行分析，檢測(cè)了兩種細(xì)胞整合素α5β1的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)論從mRNA水平還是蛋白水平，實(shí)驗(yàn)組rBMMSCs、rPDLSCs表達(dá)整合素α5、β1水平均高于空白對(duì)照組。這進(jìn)一步解釋了黏附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果：rBMMSCs、rPDLSCs均表達(dá)整合素α5β1，PHT促進(jìn)rBMMSCs、rPDLSCs黏附于牙骨質(zhì)的作用與它上調(diào)了整合素α5β1的表達(dá)有關(guān)。

這個(gè)結(jié)果提示，PHT可以幫助有牙周再生潛能的rBMMSCs、rPDLSCs盡早黏附在牙根面，為形成與天然牙更相似的牙周組織帶來(lái)可能。另外，PHT增加rBMMSCs的黏附數(shù)量與增加rPDLSCs黏附的數(shù)量相比，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，PHT促進(jìn)上述兩種細(xì)胞間的整合素α5β1表達(dá)量相比，差異也沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明PHT對(duì)rBMMSCs、rPDLSCs的促黏附作用是相似的。由于PDLCSs僅來(lái)源于牙周膜，其數(shù)量相對(duì)較少，本研究結(jié)果提示，牙周治療中，也許可以用BMMSCs補(bǔ)充或替代PDLSCs的可能性。

綜上所述，本研究的結(jié)果表明整合素α5β1在rBMMSCs、rPDLSCs黏附于牙骨質(zhì)的過(guò)程中起著重要作用，40 mg/L PHT促進(jìn)rBMMSCs、rPDLSCs黏附于牙骨質(zhì)片的作用與整合素α5β1的表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)。然而PHT是通過(guò)什么信號(hào)通路與整合素α5β1發(fā)生作用，其中的發(fā)生機(jī)制如何仍然未知，還需要做進(jìn)一步研究。