饒榮華，張俊威，吳小剛*

（1.廣西農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，北京 100193）

群體感應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensing，QS）是細(xì)菌群體利用自身產(chǎn)生的信號(hào)分子進(jìn)行交流，調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，從而影響細(xì)菌多種生物學(xué)性狀的一種重要調(diào)控機(jī)制[1]。這一調(diào)控機(jī)制賦予了細(xì)菌一定的社會(huì)性能力，可幫助其快速適應(yīng)外部多變的環(huán)境[2]。目前研究表明，QS系統(tǒng)控制細(xì)菌的生物學(xué)功能，包括胞外裂解酶的產(chǎn)生、生物發(fā)光、抗生素的合成及Ti質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移等[3]。許多植物革蘭氏陰性病原細(xì)菌的致病相關(guān)基因表達(dá)也受QS系統(tǒng)嚴(yán)格調(diào)控，如引起馬鈴薯、大白菜和胡蘿卜等多種作物軟腐病的胡蘿卜軟腐果膠桿菌Pectobacterium carotovorum subsp.carotovora（Pcc），在侵染寄主植物的過(guò)程中可合成果膠酶、纖維素酶和蛋白酶等胞外酶，從而破壞植物細(xì)胞壁，造成軟腐癥狀[4]。而這些胞外水解酶的產(chǎn)生即受到ExpI/ExpR QS系統(tǒng)的嚴(yán)格調(diào)控[5]。除果膠桿菌外，QS系統(tǒng)還影響其他植物病原細(xì)菌的致病性，如根癌土壤桿菌Agrobacterium tumefaciens中TraI/TraR QS系統(tǒng)利用其產(chǎn)生的信號(hào)分子3-氧-辛酰高絲氨酸內(nèi)酯（3-oxo-octanoyl-homoserine lactone，3-oxo-C8-HSL）激活tra調(diào)節(jié)子的表達(dá)，引起感病寄主植物的根癌病[6]。同樣，引起玉米細(xì)菌性枯萎病的斯氏泛菌 Pantoea stewartii ssp.stewartii，其主要致病因子胞外多糖（exopolysaccharide）的產(chǎn)生受EsaI/EsaR QS系統(tǒng)的調(diào)控，QS系統(tǒng)相關(guān)突變體的致病力較野生菌株顯著降低[7]。這些研究結(jié)果表明，QS系統(tǒng)廣泛參與調(diào)控植物病原細(xì)菌的致病性。

QS系統(tǒng)在植物病原細(xì)菌致病過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，但該系統(tǒng)缺失并不影響細(xì)菌的生長(zhǎng)，因此QS系統(tǒng)作為細(xì)菌病害防治的新靶點(diǎn)是目前微生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)之一，而對(duì)細(xì)菌QS系統(tǒng)的干擾和破壞被稱(chēng)為群體感應(yīng)淬滅（quorum quenching，QQ）[8]。根據(jù)QS系統(tǒng)分子機(jī)制的特點(diǎn)，目前QQ的作用靶點(diǎn)主要有3種策略：（1）抑制信號(hào)分子的合成；（2）特異性降解合成的信號(hào)分子，使其濃度下降到QS系統(tǒng)被激活的閾值以下；（3）阻止信號(hào)分子－受體蛋白互作[9]，其中以N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（N-acyl homoserine lactones，AHLs）信號(hào)分子降解酶的研究最為深入。AHL降解酶主要分為AHL內(nèi)酯酶、AHL?；D(zhuǎn)移酶和AHL氧化還原酶[10]。來(lái)源于芽胞桿菌Bacillus sp.240B1中的AiiA內(nèi)酯酶是最早發(fā)現(xiàn)的AHL降解酶，Dong等[11]將aiiA基因轉(zhuǎn)入煙草和馬鈴薯植株中，可顯著提高植株對(duì)Pcc的抗病性。AHL內(nèi)酯酶除具有較高的AHL降解活性外，目前還發(fā)現(xiàn)了熱穩(wěn)定性較好的耐熱酶[12]，因此這類(lèi)酶具有較好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。AHL?；D(zhuǎn)移酶則通過(guò)水解AHL信號(hào)分子酰基側(cè)鏈上的酰胺鍵生成高絲氨酸內(nèi)酯和相應(yīng)脂肪酸。最早鑒定的AHL酰基轉(zhuǎn)移酶是來(lái)源于拉爾氏菌Ralstonia sp.XJ12B中的AiiD，過(guò)量表達(dá)AiiD可使銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa PAO1游動(dòng)性、蛋白酶和綠膿菌素產(chǎn)量顯著降低[13]。AHL氧化還原酶是研究較少的一類(lèi)QQ降解酶，該酶主要是對(duì)AHL信號(hào)分子?；鶄?cè)鏈進(jìn)行修飾，從而降低AHL信號(hào)分子的活性，但這類(lèi)酶具有QQ活性較低的缺點(diǎn)[14]。

本研究利用原位培養(yǎng)法從廣西多地植物根圍土樣中分離細(xì)菌，結(jié)合 AHL信號(hào)分子檢測(cè)平板，篩選得到一株具有較強(qiáng)AHL降解活性的菌株Shinella sp.37-1。本文進(jìn)一步研究了菌株37-1中aiiS基因編碼產(chǎn)物對(duì)多種AHL信號(hào)分子的降解作用，明確aiiS基因?qū)χ参锊≡鶳cc Z3-3中AHL信號(hào)分子、果膠酸鹽裂解酶及致病性的影響，研究結(jié)果為構(gòu)建新型高效生防菌株和轉(zhuǎn)基因抗病作物提供了重要的遺傳資源。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件

本試驗(yàn)中用到的菌株、質(zhì)粒和引物列于表1中。申氏桿菌Shinella sp.37-1、胡蘿卜軟腐果膠桿菌P.carotovorum subsp.carotovorum Z3-3、蒼白桿菌Ochrobactrum sp.T63和根癌土壤桿菌A.tumefaciens NTL4 (pZLR4)于28 ℃在LB或ABM培養(yǎng)基中培養(yǎng)[15,16]。抗生素使用濃度為卡那霉素（Km）50 μg/mL和慶大霉素（Gm）50 μg/mL。用于重組質(zhì)粒篩選的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）終濃度為40 μg/mL。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用菌株、質(zhì)粒和引物Table 1 Strains,plasmids,and primers used in this study

1.2 土壤細(xì)菌的分離及QQ活性菌株的篩選

采集廣西多地作物的根圍土樣，利用原位培養(yǎng)法分離根圍細(xì)菌[22]。取一定量土樣平鋪于直徑為15 cm的培養(yǎng)皿中，加入適量滅菌水保濕。土樣表面放置細(xì)菌捕集器，該細(xì)菌捕集器由兩層微孔濾膜（下層濾膜孔徑為0.45 μm，下層濾膜孔徑為0.2 μm）組成。上述裝置封閉，28 ℃培養(yǎng)7 d后，將細(xì)菌捕集器中培養(yǎng)基置于滅菌水中，梯度稀釋后涂布LB培養(yǎng)基平板上，挑選不同形態(tài)的單菌落，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

QQ活性細(xì)菌的篩選方法參考文獻(xiàn)[17]。候選菌株接種于0.5 mL ABM培養(yǎng)液中，28 ℃培養(yǎng)48 h后，加入 5 μL 5 mmol/L N-己?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯（N-hexanoyl-L-homoserine lactone，C6-HSL）并繼續(xù)培養(yǎng) 2 h。將上述菌液12000 r/min離心2 min，取5 μL上清液滴于A.tumefaciens NTL4 (pZLR4)報(bào)告菌平板上，晾干后于28 ℃培養(yǎng)12 h，記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.3 菌株37-1鑒定

以菌株37-1基因組為模板，利用16S rDNA通用引物530F/1492R和63F/1387R（表1）分別進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到的兩條DNA片端送上海生工公司測(cè)序。利用軟件MEGA7.0進(jìn)行遺傳距離分析，采用鄰位相連法（Neighbor Joining,NJ）構(gòu)建菌株37-1和相關(guān)菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，1000次自展檢驗(yàn)（bootstrapping）評(píng)估進(jìn)化樹(shù)的可信度[23]。

1.4 菌株37-1中QQ酶編碼基因的克隆

1.5 AiiS活性位點(diǎn)突變

利用軟件DNAMAN對(duì)AiiS蛋白氨基酸序列比對(duì)分析，利用Fast Mutagenesis System定點(diǎn)突變?cè)噭┖校ū本┤浇鹕锛夹g(shù)有限公司）對(duì) AiiS氨基酸序列中保守的“G98-X-Nuc100-X-G102”結(jié)構(gòu)域和 Asp（D221）和His（H250）殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變。菌株BL21（p28a-aiiS）及其衍生體于37 ℃培養(yǎng)6 h后，加入5 μL 5 mmol/L C6-HSL，并于28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h。各取菌液600 μL，12000 r/min離心1 min。將上清液用等體積的乙酸乙酯萃取，風(fēng)干有機(jī)相后溶于50 μL甲醇。各取5 μL與報(bào)告菌A.tumefaciens NTL4 (pZLR4)（OD600＝0.8）混合，培養(yǎng)6 h后，檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性。β-半乳糖苷酶活性的定量檢測(cè)參照文獻(xiàn)[12]。

1.6 AiiS降解AHL信號(hào)分子機(jī)制解析

AiiS與C6-HSL標(biāo)準(zhǔn)品（終濃度50 mmol/L）28 ℃反應(yīng)3 h后，等體積乙酸乙酯萃取反應(yīng)液。將乙酸乙酯蒸干后，用甲醇溶解反應(yīng)產(chǎn)物。本試驗(yàn)以加熱變性AiiS蛋白處理作為陰性對(duì)照，以10 mmol/L NaOH處理為陽(yáng)性對(duì)照。利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（Agilent 1260-6460）對(duì)AiiS降解產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)[12]。色譜檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，流動(dòng)相為甲醇:水(v:v)＝40:60，流速0.2 mL/min，色譜柱為XBridge C18 (2.1 mm×150 mm，3.5 μm)。質(zhì)譜條件為：ESI (+) 離子源，全掃描模式（m/z 100～250），噴霧氣體為氮?dú)猓鈮簽?.1 MPa），氣體流速為13 mL/min，噴霧電壓4000 V，溫度為350 ℃。

1.7 aiiS基因影響Pcc Z3-3AHL信號(hào)分子、果膠酸鹽裂解酶和致病性

利用引物 AiiS-F/AiiS-R將 aiiS基因克隆至 pBBR1MCS-2中，獲得穿梭質(zhì)粒 pBBR-aiiS，將質(zhì)粒pBBR1MCS-2和pBBR-aiiS分別轉(zhuǎn)入Pcc Z3-3中，獲得菌株Z3-3 (pBBR1MCS-2)和Z3-3 (pBBR-aiiS)。為定量檢測(cè)Z3-3中AHL信號(hào)分子產(chǎn)量，菌株Z3-3及其衍生菌株于28 ℃培養(yǎng)，接種6 h后每隔2 h取樣一次，測(cè)定菌液OD600并提取AHL信號(hào)分子[17]。AHL信號(hào)分子與A.tumefaciens NTL4 (pZLR4)混合培養(yǎng)6 h后，測(cè)定β-半乳糖苷酶活性[12]。

為檢測(cè)Pcc Z3-3中果膠酸鹽裂解酶含量，Z3-3及其衍生菌株于LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h。取1 mL培養(yǎng)液離心，將上清液與果膠酸鹽裂解酶反應(yīng)緩沖液混合（0.1 mol/L Tris-HCl，pH＝8.5；0.1 mmol/L CaCl2；0.5% polygalacturonate），測(cè)定混合液在OD 230 nm處的吸光值[25]。

菌株Z3-3致病性測(cè)定參照文獻(xiàn)[26]。菌株Z3-3及其衍生菌株接種于LB培養(yǎng)液，28 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。用LB培養(yǎng)液將各菌株OD600調(diào)至1.0。各取5 μL菌液接種于大白菜、胡蘿卜和馬鈴薯上，28 ℃保濕培養(yǎng)24 h后，記錄試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)中每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.8 碳源對(duì)aiiS基因表達(dá)的影響

以菌株 37-1基因組為模板，引物 aiiSp-F/aiiSp-R擴(kuò)增 aiiS基因啟動(dòng)子區(qū)域，構(gòu)建報(bào)告質(zhì)粒p970Km-aiiSp。將質(zhì)粒p970Km-aiiSp并轉(zhuǎn)化至菌株37-1中，得到報(bào)告菌株37-1 (p970Km-aiiSp)。分別將甘露醇、山梨醇、檸檬酸鈉、丁二酸鈉、乙酸鈉、果糖、葡萄糖和蔗糖加入ABM基本培養(yǎng)液（碳源的終濃度為0.2%）中，菌株37-1 (pRG970-aiiSp)于28 ℃培養(yǎng)48 h后，各取200 μL菌液檢測(cè)報(bào)告質(zhì)粒aiiS-lacZ中β-半乳糖苷酶活性[12]。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AHL信號(hào)分子降解菌株的篩選及分類(lèi)鑒定

本研究從廣西各地采集不同作物的根圍土樣，利用原位培養(yǎng)法分離得到 2000多株菌落形態(tài)各異的候選細(xì)菌。通過(guò)AHL信號(hào)分子報(bào)告菌A.tumefaciens NTL4 (pZLR4)檢測(cè)平板，篩選得到7株具有QQ降解活性的候選菌株。這些候選菌株中，菌株 37-1降解AHL信號(hào)分子活性最強(qiáng)（圖1）。為進(jìn)一步鑒定菌株37-1分類(lèi)地位，本研究以37-1基因組為模板，分別以530F/1492R和63F/1387R為引物，PCR擴(kuò)增得到兩條DNA片段，這兩條DNA片段經(jīng)測(cè)序拼接后即為菌株37-1的16S rDNA序列。16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，菌株37-1與申氏桿菌屬Shinella sp.細(xì)菌16S rDNA序列一致性在97.8%以上，因此菌株37-1屬于申氏桿菌（圖2）。

圖1 AHL信號(hào)分子降解菌株的篩選Fig.1 Screening the bacteria with QQ activity

2.2 菌株37-1中aiiS基因的克隆

為篩選菌株37-1中參與降解AHL信號(hào)分子的相關(guān)基因，全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)菌株37-1全基因組存在一個(gè)全長(zhǎng)為819 bp的α/β水解酶結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因aiiS。序列分析表明，AiiS與Agrobacterium vitis中的α/β水解酶WP_156592277氨基酸序列一致性為84.93%，因此AiiS可能屬于α/β水解酶家族蛋白（圖3）。利用引物AiiS-F/AiiS-R，將aiiS基因克隆至表達(dá)載體pET-28a (+)中，獲得表達(dá)質(zhì)粒p28a-aiiS。SDS-PAGE試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外源添加IPTG可誘導(dǎo)表達(dá)一個(gè)29 kDa蛋白，與預(yù)測(cè)的AiiS蛋白大小一致（圖4A）。AHL信號(hào)分子檢測(cè)試驗(yàn)表明，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，大腸桿菌 BL21 (p28a-aiiS)可降解多種不同類(lèi)型 AHL信號(hào)分子（C6-HSL、3-oxo-C8-HSL和3-oxo-C12-HSL），而對(duì)照菌株大腸桿菌BL21 (pET-28a)則不能降解上述3種信號(hào)分子（圖4B）。氨基酸序列分析進(jìn)一步表明，AiiS具有保守的“G98-X-Nuc100-X-G102”結(jié)構(gòu)域和Asp（D221）和His（H250）殘基（圖4C）。將這5個(gè)位點(diǎn)分別點(diǎn)突變后，AiiS喪失降解C6-HSL信號(hào)分子的能力，表明“G98-X-Nuc100-XG102”、Asp（D221）和His（H250）是AiiS活性所必需的（圖4D）。這些結(jié)果表明，菌株37-1中aiiS基因參與降解AHL信號(hào)分子。

圖3 AiiS蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of AiiS protein

2.3 AiiS降解機(jī)制解析

為明確AiiS降解AHL信號(hào)分子的作用機(jī)制，課題組利用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀分析分析AiiS與C6-HSL的反應(yīng)產(chǎn)物。研究結(jié)果表明，AiiS與C6-HSL信號(hào)分子的反應(yīng)產(chǎn)物中出現(xiàn)一個(gè)保留時(shí)間為1.86 min的新峰，該峰與NaOH處理C6-HSL后產(chǎn)生的開(kāi)環(huán)產(chǎn)物正己醇－高絲氨酸（C6-HS）具有相同的保留時(shí)間；而熱變性處理的AiiS蛋白與C6-HSL反應(yīng)并沒(méi)有出現(xiàn)該峰（圖5A-D）。質(zhì)譜分析進(jìn)一步表明，新生成的產(chǎn)物荷質(zhì)比（mass-to-charge ratio,m/z）為217.1，加鈉（M+Na）的荷質(zhì)比為240.1，比標(biāo)準(zhǔn)C6-HSL加鈉的荷質(zhì)比（M+Na，m/z＝222.1）增加18，即一個(gè)H2O的分子量。該分子量與C6-HSL經(jīng)NaOH處理后的開(kāi)環(huán)產(chǎn)物C6-HS（m/z＝217.1）分子量一致。而熱變性AiiS的反應(yīng)產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)C6-HSL的荷質(zhì)比一致為222.1（圖5E-H）。上述結(jié)果表明，AiiS屬于AHL內(nèi)酯酶，水解高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)的內(nèi)酯鍵，使酯環(huán)打開(kāi)，從而生成高絲氨酸。

2.4 AiiS抑制胡蘿卜軟腐果膠桿菌Z3-3致病性

胡蘿卜軟腐果膠桿菌Z3-3通過(guò)QS系統(tǒng)調(diào)控相關(guān)毒性因子的表達(dá)，如果膠酸鹽裂解酶的產(chǎn)生等。為檢測(cè)AiiS是否影響菌株Z3-3中相關(guān)毒性因子的表達(dá)，本研究將aiiS基因轉(zhuǎn)入胡蘿卜軟腐果膠桿菌Z3-3中。研究結(jié)果表明，過(guò)量表達(dá)aiiS基因雖不影響該菌株的生長(zhǎng)，但可顯著降低AHLs的產(chǎn)量（圖6A）。而果膠酸鹽裂解酶活性檢測(cè)試驗(yàn)表明，重組菌株 Z3-3（pBBR-aiiS）培養(yǎng)液中果膠酸鹽裂解酶活性顯著低于野生型菌株Z3-3和對(duì)照菌株Z3-3（pBBR1MCS-2），表明AiiS可顯著降低菌株Z3-3果膠酸鹽裂解酶的活性（圖6B）。

將野生型菌株Z3-3、空載體對(duì)照菌株Z3-3 (pBBR1MCS-2)和重組菌株Z3-3 (pBBR-aiiS)分別接種到白菜葉片、馬鈴薯切片和胡蘿卜切塊上。28 ℃保濕培養(yǎng)24 h后，試驗(yàn)結(jié)果表明接種重組菌株Z3-3 (pBBR-aiiS)的白菜葉片、馬鈴薯和胡蘿卜和發(fā)病面積顯著小于野生型菌株Z3-3和空載體對(duì)照菌株Z3-3 (pBBR1MCS-2)（圖6C）。上述結(jié)果表明，AiiS可以顯著降低胡蘿卜軟腐果膠桿菌Z3-3的致病性。

圖6 AiiS影響Pcc Z3-3致病性Fig.6 Effect of AiiS on pathogenicity of Pcc Z3-3

2.5 不同碳源影響菌株37-1中基因aiiS的表達(dá)

外界環(huán)境條件可顯著影響生防菌株的效果，為研究菌株37-1后續(xù)的商品化，本研究構(gòu)建了aiiS基因報(bào)告質(zhì)粒p970Km-aiiSp，并檢測(cè)了不同碳源對(duì)aiiS基因表達(dá)的影響。研究結(jié)果表明，與葡萄糖、果糖及甘露醇等碳源相比，以檸檬酸鈉、丁二酸鈉為唯一碳源時(shí)，菌株37-1 (p970Km-aiiSp)的β-半乳糖苷酶活性顯著升高（圖7），可顯著提高菌株37-1中aiiS基因的表達(dá)水平。

3 討論

QQ是防治植物細(xì)菌性病害以及消減生物膜污染的重要策略之一，而目前 QQ淬滅酶編碼基因主要通過(guò)分離土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌及宏基因組文庫(kù)方法獲得[8]。由于細(xì)菌分離技術(shù)和異源基因表達(dá)的局限性，從而制約了從細(xì)菌中挖掘新型 AHL淬滅酶生物資源[10]。本研究利用原位培養(yǎng)法分離土壤根圍細(xì)菌，提高了土壤中細(xì)菌的分離效率，并從獲得的細(xì)菌資源庫(kù)中篩選到多株具有降解AHL信號(hào)分子的候選菌株，其中菌株37-1具有較好AHL降解活性（圖1）。16S rDNA序列分析表明，菌株37-1屬于申氏桿菌，目前研究表明，申氏桿菌屬中的部分細(xì)菌如申氏桿菌HZN7和S.zoogloeoides BC026可降解尼古丁[27]、吡啶[28]和乙草胺[29]等有毒物質(zhì)，但未有該屬細(xì)菌降解AHL信號(hào)分子的報(bào)道。前期研究表明，申氏桿菌屬屬于α-變形桿菌綱根瘤菌科，成立于2006年[30]。到目前為止，該屬中僅有7個(gè)種[31]。由于該屬細(xì)菌具有高度相似的16S rDNA序列及生理生化性狀，因此很難通過(guò)傳統(tǒng)的16S rDNA序列分析以及生理生化鑒定對(duì)該屬細(xì)菌進(jìn)行分類(lèi)鑒定[31]，后續(xù)課題組將利用 gyrA-gyrB-rpoB-rpoC多基因序列比對(duì)的方法對(duì)菌株37-1進(jìn)行鑒定。

為克隆菌株37-1降解AHL信號(hào)分子的相關(guān)基因，本文對(duì)菌株37-1進(jìn)行全基因組測(cè)序，并通過(guò)功能結(jié)構(gòu)域篩選得到aiiS基因。研究表明aiiS基因編碼產(chǎn)物可降解短鏈信號(hào)分子C6-HSL和中長(zhǎng)鏈信號(hào)分子3-oxo-C8-HSL和3-oxo-C12-HSL等不同類(lèi)型的AHL信號(hào)分子，表現(xiàn)出較好的底物兼容性（圖4B）。蛋白序列分析表明，AiiS屬α/β水解酶家族蛋白（圖3），其序列中包含了保守的氨基酸序列“G-X-Nuc-X-G”以及組氨酸殘基和相對(duì)保守的天冬氨酸殘基，對(duì)這些位點(diǎn)分別點(diǎn)突變后，可影響AiiS對(duì)C6-HSL信號(hào)分子的降解活性，表明這些位點(diǎn)是該蛋白發(fā)揮功能所必須的（圖4C，D）。AHL信號(hào)分子降解機(jī)制分析表明，AiiS通過(guò)水解高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)的內(nèi)酯鍵，生成高絲氨酸，從而破壞AHL信號(hào)分子的生物活性，這些結(jié)果表明AiiS屬于AHL內(nèi)酯酶（圖5）。但AiiS與已報(bào)道的α/β水解酶家族的AHL內(nèi)酯酶一致性較低，如與來(lái)源于Rhodococcus sp.BH4 中的JydB一致性為41.4%[32]，與來(lái)源于Ochrobactrum sp.中的AidH一致性為41.1%[17]，與來(lái)源于Microbacterium testaceum StLB037中的AiiM一致性為29.3%[33]，因此推測(cè)AiiS是AHL內(nèi)酯酶的一個(gè)新亞型。

生測(cè)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胡蘿卜軟腐果膠桿菌Z3-3中過(guò)量表達(dá)aiiS基因并不影響該菌株的生長(zhǎng)，但可顯著降低該菌AHL信號(hào)分子和果膠酸鹽裂解酶的產(chǎn)生，進(jìn)而消弱該病原菌對(duì)白菜、馬鈴薯和胡蘿卜的致病性（圖6）。這些結(jié)果表明aiiS基因可抑制菌株Z3-3中受QS系統(tǒng)調(diào)控的致病因子的表達(dá)。目前AHL淬滅酶相關(guān)遺傳資源的利用僅局限在實(shí)驗(yàn)室中，商品化產(chǎn)品較少[9]。而生防菌的防治效果往往受到環(huán)境因素的影響，轉(zhuǎn)錄報(bào)告試驗(yàn)表明，檸檬酸鈉和丁二酸鈉顯著提高菌株37-1中aiiS基因的表達(dá)，而葡萄糖、果糖等碳源并不影響aiiS基因的表達(dá)（圖7）。下一步工作將詳細(xì)研究環(huán)境因子對(duì)菌株37-1中aiiS基因表達(dá)的調(diào)控作用，為新型生防制劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。