許 樂(lè)，王子強(qiáng)，張 爽，邢 倩，劉麗娜，灑榮波

（山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）生命科學(xué)學(xué)院，泰安 271000）

丹參Salvia miltiorrhiza為多年生草本藥用植物，以根入藥，具有祛瘀止痛、活血調(diào)經(jīng)、養(yǎng)心除煩等功效，廣泛用于心腦血管病的治療[1,2]。丹參是栽培面積較大的藥材之一，在人工栽培條件下，由于種植生態(tài)環(huán)境中生物群落多樣性差、豐富度低，常常發(fā)生嚴(yán)重的病蟲(chóng)害，影響到丹參植株的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致藥材產(chǎn)量下降，品質(zhì)變劣[3]。丹參根腐病是由腐皮鐮刀菌Fusarium solani引起的一種土傳病害，近年來(lái)傳播蔓延較快，染病后的丹參植株長(zhǎng)勢(shì)衰弱，嚴(yán)重時(shí)地上部枯死，根的木質(zhì)部完全腐爛成黑褐色，產(chǎn)量顯著降低，其外觀性狀和品質(zhì)均不符合藥用要求[4]。對(duì)丹參根腐病的防治，目前主要采用化學(xué)農(nóng)藥防治，但防效甚微[5]；而利用有益微生物菌劑防治丹參真菌病害是解決中藥材土傳病害的最佳選擇[6]。

藥用植物內(nèi)生菌作為寶貴的微生物資源庫(kù)，在植物病害生物防治方面越來(lái)越引起研究者們的關(guān)注。根據(jù)Partida-Martínez等[7]的研究表明，任何植物物種中均會(huì)分離到內(nèi)生菌。藥用植物內(nèi)生細(xì)菌、真菌及放線菌均具有一定的抑菌活性，這 3類(lèi)內(nèi)生菌都是重要的植物病害生防菌種的重要資源[8]。畢江濤等[9]從藥用植物沙冬青中分離出32株內(nèi)生細(xì)菌，通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其中有23株對(duì)枸杞黑果病菌具有明顯抑菌活性，18株對(duì)小麥全蝕病菌具有不同程度的抑菌活性。宋利沙等[10]從廣西青天葵植株中分離得到23株內(nèi)生真菌，以 15種病原真菌為指示菌株，用平板對(duì)峙法對(duì)分離的內(nèi)生真菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌MQY-1對(duì)多種病原真菌指示菌具有較強(qiáng)的抗菌活性。祖麗皮亞木·木沙爾[11]從新疆藥用植物百里香中分離到126株內(nèi)生放線菌，通過(guò)對(duì)指示菌的抗菌活性結(jié)果顯示，有54株菌株對(duì)一個(gè)或多個(gè)指示菌表現(xiàn)出了抑制能力，說(shuō)明百里香內(nèi)生放線菌具有抑菌廣譜性，對(duì)蘋(píng)果腐爛病菌、番茄早疫病菌、腸炎沙門(mén)氏菌等病原菌具有較好的拮抗效果。

對(duì)丹參這一重要中藥材內(nèi)生菌的相關(guān)研究也陸續(xù)有報(bào)道。Li等[12]從山東產(chǎn)區(qū)的丹參根、莖和葉中分離到14株內(nèi)生真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子鑒定，將分離到的內(nèi)生真菌分為4個(gè)屬：鏈格孢屬、鐮刀菌屬、裂褶菌屬和曲霉菌屬，并對(duì)鏈格孢屬菌株Sa-F2和鐮刀菌屬菌株Sa-R2次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了抗氧化活性研究；顏華等[13]從健康丹參植株中進(jìn)行內(nèi)生菌分離，共分離得到69株內(nèi)生菌，其中真菌62株、放線菌7株，病原菌拮抗性試驗(yàn)表明，有12株內(nèi)生菌對(duì)2種及以上靶標(biāo)病原菌具有拮抗活性，表明丹參內(nèi)生菌具有一定的廣譜抗菌性；唐坤等[14]分析了我國(guó)河南產(chǎn)區(qū)丹參內(nèi)生真菌的多樣性，從野生、栽培、仿野生3種生境的丹參內(nèi)分離到277株內(nèi)生真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定分屬于25個(gè)屬。前人報(bào)道多是從丹參植株分離內(nèi)生真菌，而具有拮抗效果的丹參植株內(nèi)生細(xì)菌的分離卻鮮有人報(bào)道。本研究中，對(duì)山東省泰安市丹參種植基地的丹參植株進(jìn)行了內(nèi)生細(xì)菌的分離、純化、培養(yǎng)，以丹參根腐病病原菌腐皮鐮刀菌為靶標(biāo)菌，分離到一株對(duì)腐皮鐮刀菌有較強(qiáng)抑菌效果的細(xì)菌并對(duì)其進(jìn)行了鑒定，并對(duì)此細(xì)菌對(duì)腐皮鐮刀菌的抑菌機(jī)制進(jìn)行了初步研究。本研究對(duì)開(kāi)發(fā)新的中藥丹參資源，降低丹參真菌病害，提高丹參產(chǎn)量具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 丹參植株采集 于山東省泰安市泰山腳下某丹參種植基地采集長(zhǎng)勢(shì)健康的3年生丹參植株，采樣時(shí)將整棵植株連根撥出放入無(wú)菌袋中帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌分離。

1.1.2 病原真菌 腐皮鐮刀菌Fusarium solani、立枯絲核菌Rhizoctonia solani、鏈格孢菌Alternaria alternata、尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum、炭疽病菌Colletotrichum orbiculare、禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum、葡萄座腔球菌Botryosphaeria ribis和假禾谷鐮刀菌Fusarium pseudograminearum均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）和LB培養(yǎng)基[15]。抗菌活性物質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g，玉米粉10.0 g，黃豆餅粉20.0 g，硫酸銨0.5 g，磷酸二氫鉀1.5 g，碳酸鈣1.0 g，水1000 mL。

1.2 丹參內(nèi)生拮抗細(xì)菌分離

取長(zhǎng)勢(shì)良好的丹參健康植株，用流水清洗干凈，對(duì)材料表面按以下流程進(jìn)行消毒：75%乙醇浸泡1 min，無(wú)菌水沖洗3次；0.1%升汞中浸泡3 min，無(wú)菌水沖洗3次。在無(wú)菌操作臺(tái)中將處理過(guò)的丹參根、莖、葉等組織分別用研缽研磨成漿狀，無(wú)菌水稀釋10倍后涂布于LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)3 d。待培養(yǎng)基上長(zhǎng)出可見(jiàn)菌落時(shí)，及時(shí)挑取菌落，經(jīng)多次劃線分離獲得純培養(yǎng)物[16]。取最后一遍沖洗丹參植株的無(wú)菌水，涂布于LB培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)3 d后無(wú)菌落長(zhǎng)出，表明樣品表面消毒徹底。

1.3 平板對(duì)峙試驗(yàn)篩選拮抗細(xì)菌

參照宋光桃等[17]報(bào)道的方法，以腐皮鐮刀菌為靶標(biāo)病原菌，篩選丹參內(nèi)生拮抗細(xì)菌。采用兩點(diǎn)平板對(duì)峙法將分離到的丹參內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行病原真菌拮抗性能測(cè)試，取培養(yǎng)7 d的腐皮鐮刀菌，用直徑5 mm的打孔器打孔，將5 mm的菌餅接種于PDA平板中央，距菌餅2.5 cm處上下平行劃線接種分離到的丹參內(nèi)生細(xì)菌，以不接拮抗細(xì)菌的真菌平板作為對(duì)照，置于30 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。待對(duì)照組病原菌菌落長(zhǎng)滿皿底時(shí)，測(cè)量處理組抑菌帶寬度，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.4 內(nèi)生細(xì)菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定 將菌株DS-R5接種于LB平板上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，觀察其菌落形態(tài)特點(diǎn)，進(jìn)行常規(guī)革蘭氏染色，利用光學(xué)顯微鏡和透射電鏡對(duì)菌體形態(tài)進(jìn)行觀察。菌株的生理生化鑒定參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行。

1.4.2 16S rDNA 序列分析 參考陳奕鵬[18]的方法進(jìn)行16S rDNA基因序列PCR擴(kuò)增，以菌株DS-R5的總DNA 為模板，利用通用引物（8F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1513R:5′-ACGGCTACCTTGTTA CGACTT-3′）擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA序列，擴(kuò)增產(chǎn)物交上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序，序列測(cè)定結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST同源序列比對(duì)，選取相似度高的菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 菌株DS-R5抑菌譜的測(cè)定

采用對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行菌株DS-R5對(duì)8種常見(jiàn)植物病原真菌抑菌試驗(yàn)。將供試真菌制成直徑5 mm的菌餅，置于PDA平板中央，然后將菌株DS-R5劃線接種于距供試病原菌菌餅 2.5 cm處，30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后測(cè)定抑菌帶寬度，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.6 拮抗細(xì)菌抑菌機(jī)制研究

1.6.1 菌株DS-R5產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)對(duì)病原真菌孢子萌發(fā)的抑制作用 取一菌環(huán)菌株DS-R5接種至LB培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃條件下過(guò)夜培養(yǎng)，以2%接種量接入抗菌活性物質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃條件下發(fā)酵72 h，6000 r/min離心取上清液。分別采用硫酸銨沉淀和酸沉淀法提取發(fā)酵液抗菌活性物質(zhì)，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)硫酸銨沉淀法不能將全部活性物質(zhì)提取出來(lái)，而酸沉淀法可以將活性物質(zhì)完全沉淀，因此試驗(yàn)中采取將發(fā)酵液用6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0，4 ℃過(guò)夜后6000 r/min離心10 min收集沉淀，用無(wú)菌水沖洗3次后冷凍干燥，得到淡黃色粉末，此為抗菌活性物質(zhì)粗提物[19]。

孢子萌發(fā)平板試驗(yàn)：將上述制備的抗菌活性物質(zhì)粗提物用pH值為6.8的磷酸緩沖液（PBS）配制成濃度分別為5和10 mg/L的抗菌活性物質(zhì)溶液備用。將病原真菌孢子在2%葡萄糖溶液中制成孢子懸浮液，濃度為1×106孢子/mL。將配好的PDA培養(yǎng)基在121 ℃、0.1 Mpa條件下滅菌20 min，冷卻至50 ℃左右還未凝固時(shí)，按孢子懸浮液：PDA培養(yǎng)基＝1:100的比例向PDA培養(yǎng)基中加入配好的孢子懸浮液，混合均勻后倒平板，待平板凝固后距平板中央2 cm處均勻放置3個(gè)滅菌的牛津杯，向其中2個(gè)牛津杯中加入200 μL濃度分別為5和10 g/L的抗菌活性物質(zhì)溶液，以加入200 μL的PBS溶液作為對(duì)照。

孢子萌發(fā)鏡檢試驗(yàn)：將10 mg/L的抗菌活性物質(zhì)溶液與孢子懸浮液等體積混和，取10 μL混和液滴于凹玻片上，蓋上蓋玻片后將凹玻片放于滅菌培養(yǎng)皿中，30 ℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，每隔8 h鏡檢觀察孢子萌發(fā)數(shù)，連續(xù)觀察至32 h[20]。計(jì)算萌發(fā)率、抑制率，萌發(fā)率（%）＝已萌發(fā)的孢子數(shù)/孢子總數(shù)×100%，抑制率（%）=（對(duì)照萌發(fā)率－處理萌發(fā)率）/對(duì)照萌發(fā)率×100%。

1.6.2 菌株DS-R5對(duì)病原真菌菌絲的抑制作用 用無(wú)菌牙簽挑取對(duì)照組病原菌正常生長(zhǎng)菌絲，以及處理組受菌株DS-R5抑制的腐皮鐮刀菌菌絲制片，在光學(xué)顯微鏡下觀察拮抗菌株DS-R5對(duì)腐皮鐮刀菌菌絲形態(tài)的影響。

參照趙欣[21]報(bào)道的方法進(jìn)行,流程如下：取正常生長(zhǎng)及受抑制菌絲樣品，先用戊二醛固定 24 h，接著用PBS緩沖液處理后OsO4固定5 h；45%和55%乙醇溶液分別處理30 min，70%乙醇處理過(guò)夜；85%、95%、100%乙醇溶液分別處理30 min；醋酸異戊酯處理1 h；CO2臨界點(diǎn)干燥、粘貼、噴金鍍膜，進(jìn)行掃描電鏡觀察。

參照康振生[22]報(bào)道的方法進(jìn)行，流程如下：取正常生長(zhǎng)及受抑制菌絲樣品，先用戊二醛固定24 h，接著用PBS緩沖液處理后OsO4固定5 h；45%和55%乙醇溶液分別處理30 min，70%乙醇處理過(guò)夜；85%、95%、100%乙醇溶液分別處理30 min；環(huán)氧丙烷處理1 h后，純樹(shù)脂處理9 h；換純樹(shù)脂和環(huán)氧樹(shù)脂（DMP-30）過(guò)夜處理；樹(shù)脂包埋后36 ℃存放10 h、45 ℃存放14 h、60 ℃存放36 h后取出，進(jìn)行透射電鏡觀察。

1.7 菌株DS-R5的盆栽防效試驗(yàn)

選取長(zhǎng)勢(shì)良好的盆栽丹參幼苗60株，每盆1株，分成健康對(duì)照組（不接菌種）、病原菌對(duì)照組（接種病原真菌）和試驗(yàn)組（接種病原真菌和拮抗細(xì)菌）3組，每組20株。向?qū)φ战M和試驗(yàn)組中分別灌根接種20 mL（孢子濃度為1×106孢子/mL）腐皮鐮刀菌孢子懸浮液，以接等量無(wú)菌水為空白組對(duì)照；10 d后向?qū)φ战M和試驗(yàn)組中分別灌根接種20 mL菌株DS-R5發(fā)酵液，以接種20 mL未接種的滅菌培養(yǎng)基為空白組對(duì)照。60 d后統(tǒng)計(jì)分析菌株DS-R5對(duì)丹參根腐病的防病效果。根據(jù)丹參幼苗根部組織的病斑面積將病情分為五級(jí)：1級(jí)為無(wú)病斑；2級(jí)為病斑面積＜5%；3級(jí)為病斑面積5%～20%；4級(jí)為病斑面積21%～50%；5級(jí)為病斑面積＞50%。病情指數(shù)＝Σ（病級(jí)數(shù)×該病級(jí)植株數(shù)）/（最大病級(jí)數(shù)×植株總株數(shù)）×100，防治效果（%）＝（對(duì)照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行處理間差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 丹參內(nèi)生拮抗細(xì)菌的分離與篩選

從健康丹參根、莖和葉中共分離得到72株細(xì)菌，其中從丹參根部組織分離到39株細(xì)菌，占分離細(xì)菌總數(shù)的54.2%；從丹參莖和葉中分別分離到24株和9株細(xì)菌，分別占分離細(xì)菌總數(shù)的33.3%和12.5%。對(duì)峙試驗(yàn)顯示，72株內(nèi)生細(xì)菌有13株對(duì)靶標(biāo)病原真菌腐皮鐮刀菌有不同程度的拮抗效果，其中菌株DS-R5對(duì)腐皮鐮刀菌抑制效果最強(qiáng)，抑菌帶寬度可達(dá)20.5 mm（表1）。因此選擇菌株DS-R5進(jìn)行下一步的深入研究。

2.2 菌株DS-R5的鑒定

2.2.1 形態(tài)和生理生化特征 菌株DS-R5在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)36 h后，菌落光滑、濕潤(rùn)，菌落形狀為圓形，不易挑起（圖1 A）；在光學(xué)顯微鏡下，菌體為桿狀，革蘭氏染色為陽(yáng)性，產(chǎn)橢圓形芽胞，且芽胞中生（圖1 B、C）；掃描電鏡顯示，菌體細(xì)胞大小為0.8 μm×2.8 μm左右（圖1 D）。菌株DS-R5的部分生理生化特性如表2所示，菌株DS-R5能利用葡萄糖、甘油發(fā)酵產(chǎn)酸，淀粉水解、明膠水解、厭氧生長(zhǎng)、接觸酶、硝酸鹽反應(yīng)、V-P 反應(yīng)、水解酪蛋白反應(yīng)等均為陽(yáng)性，氧化酶反應(yīng)、檸檬酸鹽反應(yīng)、琥珀酸鹽反應(yīng)、H2S產(chǎn)生反應(yīng)等均為陰性，在NaCl含量為5%的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)（表2）。在所測(cè)定的生理生化指標(biāo)中，菌株DS-R5與多粘類(lèi)芽胞桿菌Paenibacillus polymyxa性質(zhì)一致[23]。

2.2.2 菌株DS-R5基于16S rDNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析 結(jié)果表明，菌株DS-R5（GenBank Accession SUB9879573）與多粘類(lèi)芽胞桿菌Paenibacillus polymyxa處于同一分支（圖2）。因此，結(jié)合菌株DS-R5培養(yǎng)特征和生理生化特征，將菌株DS-R5鑒定為多粘類(lèi)芽胞桿菌。

2.3 菌株DS-R5的抑菌譜

菌株DS-R5對(duì)供試8種常見(jiàn)植物病原真菌均有不同程度的抑制作用。其中對(duì)立枯絲核菌和腐皮鐮刀菌抑菌活性較強(qiáng)，抑菌帶帶寬分別為21.2和20.5 mm；對(duì)禾谷鐮刀菌和假禾谷鐮刀菌抑菌活性較弱，抑菌帶帶寬分別為7.9和6.5 mm，試驗(yàn)表明菌株DS-R5具有較寬的抑菌譜（表3）。

2.4 菌株 DS-R5產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)對(duì)腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制作用

孢子萌發(fā)平板試驗(yàn)表明，抗菌活性物質(zhì)的加入可以抑制腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)成菌絲，形成明顯的抑菌圈，而且隨著抗菌活性物質(zhì)濃度的升高，形成的抑菌圈明顯變大，而對(duì)照組孢子正常萌發(fā)成菌絲，沒(méi)有任何抑菌圈形成（圖3）。

圖3 孢子萌發(fā)平板抑制試驗(yàn)Fig.3 Spore germination plate inhibition test

菌株 DS-R5抗菌活性物質(zhì)粗提物對(duì)腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)有強(qiáng)烈的抑制作用，處理組孢子萌發(fā)率顯著低于對(duì)照組：8 h時(shí)，對(duì)照組孢子萌發(fā)率分別為17.3%；而處理組孢子萌發(fā)率僅為4.3%，此時(shí)孢子萌發(fā)抑制率為75.1%；32 h時(shí)，對(duì)照組孢子全部萌發(fā)，而處理組孢子萌發(fā)率僅為17.7%，孢子萌發(fā)抑制率為82.9%（表4）。

2.5 菌株DS-R5對(duì)腐皮鐮刀菌菌絲的影響

2.5.1 光學(xué)顯微鏡觀察菌株DS-R5對(duì)腐皮鐮刀菌菌絲的影響 光學(xué)顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)，菌株DS-R5對(duì)腐皮鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)具有明顯的破壞作用。對(duì)照組菌絲顏色發(fā)亮、細(xì)長(zhǎng)且粗細(xì)均勻（圖4A），而受拮抗菌株DS-R5抑制的腐皮鐮刀菌菌絲體大部分發(fā)生畸變，菌絲纏繞、斷裂，局部出現(xiàn)斷裂（圖4B）。

圖4 光學(xué)顯微鏡下菌株DS-R5對(duì)腐皮鐮刀菌菌絲的抑制效果Fig.4 Inhibitory effect of strain DS-R5 on F.solani hyphae under optical microscope

2.5.2 掃描電鏡觀察菌株DS-R5對(duì)腐皮鐮刀菌菌絲的影響 由圖5可知，菌株DS-R5對(duì)腐皮鐮刀菌菌絲有一定的影響。對(duì)照組的樣品菌絲排列規(guī)則，粗細(xì)均勻，形狀完整，呈現(xiàn)出正常的管狀結(jié)構(gòu)，且菌絲體表面光滑。處理組的樣品菌絲體形態(tài)上相比對(duì)照組有較大變化，大量菌絲斷裂，有菌絲碎屑產(chǎn)生，菌絲粗細(xì)不一，表面粗糙，有胞內(nèi)物質(zhì)泄露。

2.5.3 透射電鏡觀察菌株DS-R5對(duì)腐皮鐮刀菌菌絲的影響 由圖6可以看出，對(duì)照組的菌絲結(jié)構(gòu)規(guī)則，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞器清晰正常，線粒體均勻，細(xì)胞內(nèi)含物無(wú)外滲現(xiàn)象。處理組菌絲體超微結(jié)構(gòu)受到不同程度破壞，菌絲體細(xì)胞畸形，無(wú)完整細(xì)胞器存在，胞質(zhì)外流，內(nèi)部出現(xiàn)異?？斩?。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株DS-R5可以破壞腐皮鐮刀菌內(nèi)部細(xì)胞器，引起細(xì)胞變形，從而導(dǎo)致菌絲細(xì)胞死亡。

圖6 透射電鏡下菌株DS-R5對(duì)腐皮鐮刀菌菌絲的影響Fig.6 Inhibitory effect of strain DS-R5 on F.solani hyphae under TEM

2.6 菌株DS-R5對(duì)丹參根腐病的防治效果

盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，不接菌種的空白組的病情指數(shù)為 6.7，接種病原真菌的對(duì)照組和接種拮抗細(xì)菌的試驗(yàn)組病情指數(shù)分別為60.5和26.3，從病情指數(shù)來(lái)看，接種拮抗菌株DS-R5后對(duì)丹參根腐病具有顯著的防治效果，試驗(yàn)組的防治效果達(dá)到61.4%（表5）。

表5 菌株DS-R5對(duì)丹參根腐病的盆栽試驗(yàn)防治效果Table 5 Control efficacy of the strain DS-R5 against root rot of S.miltiorrhiza under pot experiments

3 討論

本研究從丹參健康植株中分離到一株拮抗細(xì)菌DS-R5，經(jīng)菌株形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA序列分析將其鑒定為多粘類(lèi)芽胞桿菌。多粘類(lèi)芽胞桿菌是一類(lèi)可以產(chǎn)生芽胞的非致病性細(xì)菌，可產(chǎn)生抗生素和抗菌蛋白等多種生物活性物質(zhì)，是重要的生防細(xì)菌和植物根際促生菌，多粘類(lèi)芽胞桿菌對(duì)人和動(dòng)植物沒(méi)有致病性，在植物病害生物防治方面具有誘人的前景[24]。祝久香等[25]采用涂布平板法和對(duì)峙培養(yǎng)法，從健康油菜根際土中篩選到 1株對(duì)油菜菌核病菌具有較強(qiáng)生防效果的多粘類(lèi)芽胞桿菌 HX-140，此細(xì)菌對(duì)供試8種病原真菌有顯著的拮抗作用，發(fā)酵液在離體油菜葉片上對(duì)油菜菌核病的防治效果為65.51%，在盆栽試驗(yàn)中對(duì)油菜菌核病的防治效果為 62.22%。王波等[26]從健康大豆植株中分離篩選得到拮抗效果較好的多粘類(lèi)芽胞桿菌 XZ-2，拮抗活性測(cè)定顯示該菌株對(duì)引起大豆主要病害的大豆疫霉病菌、大豆炭疽病菌和大豆菌核病菌均有較強(qiáng)的抑制作用。此外，多粘類(lèi)芽胞桿菌還對(duì)植物生長(zhǎng)具有促生作用，這種作用已經(jīng)在多種植物中得到驗(yàn)證。郭芳芳等[23]從浙江天目山柳杉中分離得到的1株多粘類(lèi)芽胞桿菌CF05，室內(nèi)生測(cè)結(jié)果表明，發(fā)酵液和菌懸液對(duì)番茄幼苗均具有明顯的促生效果。徐桑爾等[27]試驗(yàn)了多粘類(lèi)芽胞桿菌CF05菌劑對(duì)鐵皮石斛的促生長(zhǎng)作用，結(jié)果表明與對(duì)照相比，CF05菌劑處理后鐵皮石斛鮮質(zhì)量提高了31.0%，側(cè)芽增加31.58%。因此，菌株DS-R5促進(jìn)丹參植株生長(zhǎng)的作用及機(jī)制是未來(lái)研究的重點(diǎn)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，菌株DS-R5活菌及發(fā)酵液產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)均可以抑制腐皮鐮刀菌生長(zhǎng)，從而可以對(duì)丹參根腐病進(jìn)行生物防治。由于抗菌活性物質(zhì)提取過(guò)程較為繁瑣，考慮到之后的應(yīng)用開(kāi)發(fā)形式，建議使用活菌，尤其是菌株DS-R5所產(chǎn)芽胞為菌株DS-R5的的應(yīng)用形式，這樣就不需要花費(fèi)大量時(shí)間分離菌株DS-R5所產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)。另外，本研究從丹參中分離到的多粘類(lèi)芽胞桿菌DS-R5，為丹參根腐病病害的生物防治奠定了菌種基礎(chǔ)，下一步可以在實(shí)驗(yàn)室條件下就菌株DS-R5的抗菌活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，以期為丹參根腐病生防菌株的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供一定的理論指導(dǎo)，并為新藥的開(kāi)發(fā)提供功能菌株及有效代謝物。本研究不足之處是僅僅進(jìn)行了菌株DS-R5對(duì)丹參根腐病的盆栽試驗(yàn)，沒(méi)有進(jìn)行大規(guī)模的田間試驗(yàn)，另外也沒(méi)有考慮到光照、溫度、溫度、土壤等因素對(duì)試驗(yàn)的影響，在后續(xù)的試驗(yàn)過(guò)程中會(huì)進(jìn)一步進(jìn)行探討。