王明環(huán)，孫愛麗，趙聯(lián)晶，劉 列，趙添琦，董文漢，羅 瓊，黃惠川，李成云*，楊根華*

（1.云南農業(yè)大學/省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，昆明 650201；2.云南農業(yè)大學科技處，昆明 650201）

水稻紋枯?。≧ice sheath blight disease）是由立枯絲核菌Rhizoctonia solani感染的真菌病害，是當前水稻生產(chǎn)上的主要病害之一[1]。為了控制水稻病害，生物防治因為綠色、高效、無公害的特點已經(jīng)成為當今防治水稻病害的研究熱點[2]。諸多學者利用拮抗微生物包括拮抗真菌、細菌和放線菌或者其代謝產(chǎn)生的拮抗物質作為生物防治的材料來控制水稻病害的發(fā)生[3,4]。放線菌是環(huán)境中廣泛存在的一類微生物，能夠產(chǎn)生抗病原菌的生物活性物質[5-7]。數(shù)據(jù)顯示，放線菌產(chǎn)生的10000多種生物活性次生代謝物中，有7600多種來自鏈霉菌屬，約占75%[8,9]，顯示了鏈霉菌作為藥物生產(chǎn)者的巨大價值。過去十年，不同環(huán)境中分離的鏈霉菌分泌的生物活性新型代謝物數(shù)量在不斷增長。根據(jù)其化學結構的不同主要分為多肽、醌類、大環(huán)內酯類、萜烯類、聚酮類、吲哚類、酶、酶抑制劑以及脂類等[10]。鏈霉菌主要用于醫(yī)用抗生素和農用抗生素的生產(chǎn)，其中產(chǎn)業(yè)化的農用抗生素對防治農作物病害有著重大的作用，但就目前抗生素的數(shù)量、質量和品種而言還遠遠不能滿足農業(yè)生產(chǎn)的需要[11]。從現(xiàn)有的知識和統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析，鏈霉菌在未來的很長一段時間里仍是抗生素的主要來源[8]。

直絲紫鏈霉菌A8屬于鏈霉菌屬，是本實驗室從土壤中分離出的一株拮抗放線菌，對引起煙用香精香料變質的微生物包括芽胞桿菌、醋酸桿菌、土壤球菌均有明顯的抑制作用[12]，且對立枯絲核菌也有一定的抑制作用。前人對直絲紫鏈霉菌的研究較少，僅李紀順等[13]報道從山東省科學院中試基地內的番茄根際土中分離出一株同源性與直絲紫鏈霉菌達98.9%的菌株A-29，對供試的8種植物病原真菌均有拮抗作用，且從其發(fā)酵上清液中鑒定出 4種可能起抑菌作用的活性物質。直絲紫鏈霉菌A8發(fā)酵液中含有抑菌的活性物質，為了進一步提高其活性物質的產(chǎn)量及增強抑菌作用，我們對直絲紫鏈霉菌A8的發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件包括接種量，裝液量、初始pH和發(fā)酵溫度進行了優(yōu)化。同時為解析該活性物質的構成，本研究對菌株 A8所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物通過氣相色譜?質譜技術（GC?MS）進行初步檢測。將分離和鑒定出的不同組分以分析純物質替代，以蠟狀芽胞桿菌和立枯絲核菌AG-1作為指示菌進行生物活性測定試驗，探究菌株A8代謝活性物質從細菌到真菌的廣譜抗性。進而研究菌株A8固體發(fā)酵制劑對水稻紋枯病的大田防控效果，探究其在水稻紋枯病病害生物防治中的價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

直絲紫鏈霉菌S.rectiviolaceus A8由本實驗室鑒定并保存，蠟狀芽胞桿菌B.cereus和立枯絲核菌R.solani AG-1均由本實驗室提供，枯草芽胞桿Bacillus subtilis BT205由云南星耀生物制品有限公司提供，供試水稻品種為云粳37由楚雄市植保植檢站提供。

1.2 培養(yǎng)基及種子液的制備

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%；LB培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，瓊脂 2%；種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉 2%，NaCl 0.05%，KNO30.1%，K2HPO4·3H2O 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，pH 7.5，發(fā)酵基礎無機鹽培養(yǎng)基：NaCl 0.05%，K2HPO4·3H2O 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，pH 7.5，碳、氮源按照試驗要求加入。

將直絲紫鏈霉菌A8均勻涂布于種子固體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)7 d至培養(yǎng)基表面菌苔出現(xiàn)紫褐色孢子。將活化好的菌株A8孢子用打孔器打成菌餅，挑取10個大小相似的菌餅接入種子培養(yǎng)基（500 mL錐形瓶裝液量200 mL），25 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)7 d，即得種子液。然后以10%（體積分數(shù)，下同）的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中（500 mL錐形瓶裝液量100 mL），相同條件培養(yǎng)7 d。

1.3 發(fā)酵碳、氮的優(yōu)化

1.3.1 碳源的選擇 玉米粉、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，以不接菌株A8但含有不同碳源的培養(yǎng)液作為空白對照，將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、120 r/min發(fā)酵7 d，每個處理3個重復，每個重復測定菌株A8菌體干重及采用牛津杯法測定菌株A8上清液對蠟狀芽胞桿菌抑菌圈的大小（下同），篩選出合適的碳源。菌絲干重測定[14]：取每種培養(yǎng)基的發(fā)酵液50 mL至已烘干稱重的離心管（W0）中，6000 r/min離心10 min，棄去上清液，將帶菌體的離心管置于65 ℃鼓風干燥箱中烘干至恒重(W1)，換算出1000 mL發(fā)酵液中菌絲體的干重，用質量濃度表示菌體干重（g/L），計算公式為W＝（W1―W0）×1000/50。抑菌圈的測定[15]：將不同處理的發(fā)酵液6000 r/min離心15 min，發(fā)酵上清液用0.45 μm濾膜過濾除菌，同時將蠟狀芽胞桿菌（濃度約為1×107cfu/mL）菌懸液加入溶化冷卻至50 ℃的LB培養(yǎng)基中，混勻制成含菌培養(yǎng)基，將牛津杯（內徑6 mm）置于平板上，加入200 μL發(fā)酵濾液，對照組中加入200 μL相應的培養(yǎng)液。然后將平板于25 ℃條件下培養(yǎng)24 h，之后測量透明圈直徑（透明圈＞6 mm，說明具有抑菌作用）。

1.3.2 氮源的選擇 分別以酵母膏、黃豆粉、牛肉膏、蛋白胨、(NH4)2SO4和NH4Cl和KNO3作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源，以不接菌株A8但含有不同氮源的培養(yǎng)液作為空白對照，將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、120 r/min發(fā)酵7 d，測定菌株A8菌體干重和抑菌圈的直徑。

1.3.3 氮源比例的確定 分別將黃豆粉和酵母膏以4:1、3:2、2:3和1:4比例總共0.1%的用量作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源，以不接菌株A8但含有不同比例氮源的培養(yǎng)液作為空白對照，接入種子液，25 ℃、120 r/min培養(yǎng)7 d后測定菌株A8菌體干重和抑菌圈的直徑。

1.3.4 碳、氮源濃度的初步確定 采用正交法設計試驗方案，把已篩選出的合適碳、氮源分別以濃度梯度加入發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中，發(fā)酵7 d，測定不同碳、氮源濃度發(fā)酵液的菌株A8菌體干重和抑菌圈大小，以確定最佳的碳、氮源濃度。

1.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.4.1 發(fā)酵時間的優(yōu)化 將種子液接入優(yōu)化碳、氮源后的培養(yǎng)基培養(yǎng)，從第1 d到第12 d每天分別取樣，過濾后取上清液放入4 ℃冰箱中備用，取樣全部結束后測定發(fā)酵液菌株A8菌體干重和抑菌活性，每個處理重復3次。

1.4.2 裝液量的優(yōu)化 在500 mL錐形瓶中分別裝入100、150、200、250、300、350 mL優(yōu)化碳、氮源的培養(yǎng)基，每個處理重復3次，25 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)8 d，測定不同裝液量條件下發(fā)酵液菌株A8菌體干重和抑菌活性。

1.4.3 接種量的優(yōu)化 用優(yōu)化碳、氮源后的培養(yǎng)基，分別按3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%的接種量接入種子液，每個處理重復3次，25 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)8 d，測定不同接種量條件下發(fā)酵液的菌體干重和抑菌活性。

1.4.4 發(fā)酵溫度的優(yōu)化 將種子液按7%接種量接種于優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基中，將發(fā)酵培養(yǎng)基分別在22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃和37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)8 d，每個處理重復3次，測定不同溫度條件下菌株A8菌體干重和抑菌活性，篩選出最適發(fā)酵溫度。

1.4.5 初始pH的優(yōu)化 將發(fā)酵液初始pH分別調節(jié)為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，每個處理重復3次，7%接種量接入種子液，28 ℃、120 r/min發(fā)酵8 d，測定不同初始pH條件下菌株A8菌體干重和抑菌活性，篩選出最適的初始pH。

1.5 活性物質粗提物的制備

取10 L菌株A8發(fā)酵液用8層紗布過濾，濾液8000 r/min離心10 min，吸取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾除菌，得到含有活性物質的發(fā)酵濾液。乙酸乙酯作為萃取劑，與濾液等體積混合于1000 mL分液漏斗中，充分振蕩后室溫靜置15 min，收集上層有機相于1000 mL錐形瓶中，萃取操作重復3次，使物質萃取充分，每1000 mL有機相中加入10 g無水硫酸鈉，室溫過夜干燥脫水。有機相通過旋轉蒸發(fā)儀40 ℃減壓濃縮，以回收液成滴狀下流為最佳蒸餾狀態(tài)。收集濃縮物，加入乙酸乙酯定量至1000 μL，用0.20 μm針式濾膜過濾器2次過濾后收集于1.5 mL棕色樣品瓶中[16]。

1.6 有機相和無機相抑菌活性的測定

將10 L乙酸乙酯萃取的發(fā)酵濾液有機相通過旋轉蒸發(fā)儀40 ℃蒸餾濃縮至干，得到的黃褐色膏狀粗提物經(jīng)DMSO溶解，稀釋成1%、3%、5%、10%、20%、30%、40%、50%的DMSO溶解液，采用平板對扣法以立枯絲核菌為指示菌測定其抑菌活性，方法為：吸取400 μL不同濃度粗提物的DMSO溶液均勻涂布在PDA平板上，取活化好的立枯絲核菌菌餅，接于PDA平板中央，與涂有粗提物的DMSO溶液平板對扣、密封，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以涂布400 μL DMSO溶液的平板作為對照，待對照平板菌絲長滿培養(yǎng)皿時觀察并測量各培養(yǎng)皿的菌落直徑，每處理5個重復[17]，抑制效果用抑制率表示，抑制率（%）＝（對照培養(yǎng)菌落直徑—處理菌落直徑）/（對照培養(yǎng)菌落直徑—菌餅直徑）×100。

1.7 菌株A8揮發(fā)性活性成分的GC-MS檢測

將1.5中收集的粗提物采用島津GCMS-QP2010型氣質聯(lián)用儀進行測定。GC條件：進樣口溫度 250 ℃，柱箱溫度 65 ℃；進樣方式：分流；載氣：He；初始壓力 500～900 kPa；流量控制方式：線速度；壓力：59.4 kPa；總流量：24.0 mL/min；柱流量：1.0 mL/min；線速度 36.6 cm/sec；吹掃流量：3.0 mL/min；分流比：20.0。MS條件：離子源溫度：200 ℃；接口溫度：250 ℃；溶劑延遲時間：3 min；檢測器電壓：0.1 kV。利用面積歸一化法計算各成分的相對含量，3次重復檢測。

1.8 揮發(fā)性純品物質對絲核菌AG-1的抑菌檢測

用分析純品物質代替氣相色譜-質譜法（GC-MS）分離鑒定出的不同組分來檢測不同組分的生物活性。分別吸取揮發(fā)性活性物質400 μL以25、125、250、500、1000 μL/mL的濃度梯度均勻涂布在PDA平板上，采用1.6中平板對扣法[17]測定揮發(fā)性純品物質的抑菌活性。

1.9 揮發(fā)性純品物質對蠟狀芽胞桿菌的抑菌檢測

將分析純品物質分別用20%的DMSO溶解并配制成濃度為10、50、100、200、400 μg/mL的溶液，以20%的DMSO無菌溶液作為對照，采用1.3.1中牛津杯法[15]測定不同濃度的純品物質對蠟狀芽胞桿菌的抑菌圈大小，每個處理3個重復。

1.10 直絲紫鏈霉菌A8對水稻紋枯病的田間防效

1.10.1 菌株A8生防固體制劑的制備 由于固態(tài)菌劑的菌體孢子數(shù)量大，且便于保存和運輸，將谷殼、麥麩和水以3:2:3的配比總共800 g加入到5 L的錐形瓶中，滅菌，每個錐形瓶中接入400 mL菌株A8發(fā)酵液，每天搖晃3～4次，使之均勻混合。室溫發(fā)酵10 d后倒出在陰涼處晾干備用。

1.10.2 大田試驗區(qū)設計 根據(jù)當?shù)厣a(chǎn)實際，試驗時間為2019年4月4—24日。試驗地點設在云南省楚雄市東華鎮(zhèn)新柳村委會苴午村（N24°57′39.98″，E101°28′51.40″）。稻田土壤肥力中等，常年稻瘟病、紋枯病發(fā)生較重。試驗小區(qū)采用單因素隨機區(qū)組排列設計，設6個處理，分別為：CK（對照）、F-1（40%稻瘟靈乳油）、BT（枯草芽胞桿菌BT205）、A8-1（250 g菌株A8生防固體制劑）、A8-2（450 g菌株A8生防固體制劑）、A8-3（650 g菌株A8生防固體制劑），每個處理3個小區(qū)，每個小區(qū)10 m2，試驗田總面積1200 m2。

生防菌施用時間、用量和方法：7月15號水稻分蘗中期和8月10號孕穗期F-1小區(qū)施用40%稻瘟靈1.2 mL，兌水750 mL，噴霧施藥；7月29號在水稻處于孕穗期，施入A8生防菌到水稻田中，均勻撒開，其中A8-1小區(qū)施用250 g菌株A8固體生防制劑，A8-2小區(qū)施用450 g菌株A8固體生防制劑，A8-3小區(qū)施用650 g菌株A8固體生防制劑；同時BT小區(qū)施入枯草芽胞桿菌BT205，每個小區(qū)施用2 g，兌水1000 mL，在水稻抽穗后（施藥后28 d）開始調查病害。

1.10.3 病害程度和發(fā)病率調查 在水稻生長至分蘗末期和抽穗前期，此時試驗小區(qū)中的環(huán)境高溫高濕，易發(fā)生病害，此時調查水稻的總株數(shù)、病株數(shù)和病情指數(shù)。分級標準：0級（植株健康，全株無?。?級（稻株基部葉鞘或葉片發(fā)病，3級（頂葉或劍葉以下第三葉鞘、葉片發(fā)病），5級（頂葉或劍葉以下第二葉鞘、葉片發(fā)?。?級（頂葉或劍葉以下第二葉鞘、葉片發(fā)病），9級（頂葉葉鞘、葉片發(fā)病[18]。發(fā)病率（%）＝（發(fā)病株數(shù)/調查總株數(shù)）×100%，病情指數(shù)＝∑（病級株數(shù)×各級代表數(shù)值）/（調查總株數(shù)×發(fā)病最重級代表數(shù)值）×100。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0和Excel軟件進行統(tǒng)計和分析。

2 結果與分析

2.1 碳源篩選結果

不同碳源培養(yǎng)基中，玉米粉和可溶性淀粉有利于菌株A8的生長，菌體干重分別3.12和2.29 g/L，顯著高于其他處理（P＜0.05）；可溶性淀粉處理的抑菌圈直徑最大，為19.3 mm，顯著高于以玉米粉作為碳源的處理（P＜0.05），更有利于菌株A8代謝活性物質的產(chǎn)生（表1）。因此，綜合考慮選用可溶性淀粉作為最佳碳源。

2.2 氮源篩選結果

不同氮源試驗處理中，酵母膏和黃豆粉有利于菌株A8發(fā)酵產(chǎn)生活性物質，抑菌圈直徑分別為22.7和21.2 mm，顯著高于蛋白胨、牛肉膏、(NH4)2SO4等處理（P＜0.05）；在不同氮源菌株A8的生物量上，黃豆粉和蛋白胨處理的菌體干重最大，為4.51和4.22 g/L，顯著高于其他處理（P＜0.05）（表2）。但蛋白胨價格貴，不適于生產(chǎn)應用，綜合材料價格和抑菌活性物質產(chǎn)量考慮選用酵母膏和黃豆粉作為菌株A8發(fā)酵培養(yǎng)的氮源。

2.3 不同氮源比例試驗結果

不同比例的酵母膏和黃豆粉替代初始培養(yǎng)基中的氮源對菌體生長和抑菌活性影響表明，隨著黃豆粉和酵母膏比例中酵母膏的增加，菌體的生物量隨之減少，而抑菌活性隨之上升，這與不同氮源篩選的試驗結果相吻合。在黃豆粉、酵母膏比例為3:2和2:3時抑菌活性最高，抑菌圈直徑都為23.2 mm，但黃豆粉、酵母膏比例為3:2時菌體干重為4.07 g/L，顯著高于黃豆粉、酵母膏比例為2:3組合（P＜0.05）。因此選擇黃豆粉、酵母膏為3:2組合（表3）。

2.4 正交試驗對發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分進行優(yōu)化

在單因素試驗結果的基礎上，選擇可溶性淀粉作為碳源，黃豆粉和酵母膏比例為3:2作為氮源組合，設計A、B兩因素4水平L16（42）正交試驗，因素水平和試驗結果見表4和表5。從表5結果中可知編號11（組合A3B3）最為合適，該組合中抑菌圈直徑達到28.2 mm，抑菌活性物質產(chǎn)量相較其他試驗組合高，菌體干重為7.15 g/L，生物量相對較高，說明菌絲生長狀況良好。故確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方：可溶性淀粉3%、黃豆粉0.6%、酵母膏0.4%、NaCl 0.05%、K2HPO4·3H2O 0.05%、MgSO4·7H2O 0.05%、FeSO4·7H2O 0.001%。

表4 優(yōu)化培養(yǎng)基的L16（42）正交試驗因素和水平Table 4 The orthogonal experiment factors and level L16 (42) of optimal medium

2.5 發(fā)酵時間對菌體生長和抑菌活性物質產(chǎn)量的影響

放線菌在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，菌株A8對營養(yǎng)物質的利用速度在不同發(fā)酵時間的生長量和抑菌活性物質產(chǎn)量表現(xiàn)出如下規(guī)律，發(fā)酵2 d基本無抑菌活性物質分泌，第3 d時菌株A8有一定的生長量和少量的抑菌活性物質產(chǎn)生，此后菌株的生長量和活性物質的分泌越來越多，在第8 d達到最高的生長量和最大抑菌活性，分別為8.04 g/L和28.7 mm，顯著高于前7 d的生長量和抑菌活性物質產(chǎn)量（P＜0.05），第9 d后生長量和抑菌活性有下降的趨勢，但幅度不大（圖1）。

圖1 不同發(fā)酵時間對菌株A8菌體生長和抑菌活性的影響Fig.1 Effects of different culture time on strain A8 antifungal activity and bacteria growth mass

2.6 裝液量對菌體生長和菌株抑菌活性物質產(chǎn)量的影響

500 mL錐形瓶中不同體積的培養(yǎng)液造成相對空氣量和傳質阻力的不同，不同處理的抑菌圈大小和菌體干重存在著明顯的區(qū)別（表 6）。多個處理表現(xiàn)出空氣量大，氧氣傳質阻力小，菌株生長量和活性物質產(chǎn)量高的趨勢。其中100、150、200和250 mL裝液量處理顯著高于300和350 mL處理（P＜0.05）。

表6 不同裝液量對菌株A8菌體生長和抑菌活性的影響Table 6 Effects of different loaded liquid on the antifungal activity and bacteria growth mass of strain A8

2.7 接種量對菌體生長和菌株抑菌活性物質產(chǎn)量的影響

試驗結果表明，當接種量為3%～7%時，菌株A8的生長量和活性物質產(chǎn)量較高，沒有顯著差異。其中接種量在7%時，菌株A8的生長量和活性物質產(chǎn)量最高，分別為29.5 mm和9.26 g/L。接種量超過7%時，生長量逐漸降低，接種量為9%～15%處理顯著低于3%～7%處理（P＜0.05）；接種量超過9%時，活性物質產(chǎn)量也逐漸降低，接種量為11%～15%處理顯著低于3%～9%處理（P＜0.05）（表7）。

2.8 培養(yǎng)溫度對菌體生長和菌株抑菌活性物質產(chǎn)量的影響

試驗結果表明，當培養(yǎng)溫度在25 ℃～34 ℃，均適合菌株A8的生長，其中28 ℃培養(yǎng)菌株A8的生長量和活性物質產(chǎn)量達到最高，分別為31.0 mm和10.00 g/L；當培養(yǎng)溫度低于22 ℃或者高于34 ℃，都不利于菌株A8的生長，生長量和活性物質產(chǎn)量較低，顯著低于其他處理（P＜0.05）（表8）。說明該菌株比較適宜在相對偏高的條件下發(fā)酵培養(yǎng)。

表8 培養(yǎng)溫度對菌株A8菌體生長量和抑菌活性的影響Table 8 Effects of different temperature on antifungal activity and bacteria growth mass of strain A8

2.9 pH對菌體生長和菌株抑菌活性物質產(chǎn)量的影響

試驗結果表明，在pH 5.0～10.0均能生長且有抑菌物質的分泌，在pH 6.0～9.0的條件下菌株生長量和抑菌活性物質產(chǎn)量較大，其中在 pH 7.0中性條件下菌株生長量和抑菌活性物質產(chǎn)量達到最大，分別為32.0 mm和10.38 g/L，顯著高于其他處理（P＜0.05）。pH 6.0以下或者pH 9.0以上隨著酸度或者堿度的增大，菌株生長量和抑菌活性物質產(chǎn)量都隨之減?。ū?）。

2.10 無機相和有機相抑菌活性測定

通過對發(fā)酵濾液粗提物的抑菌活性測定結果表明，水相中的物質對絲核菌AG-1沒有抑制作用，有機相中存在抑制絲核菌AG-1的活性物質，且隨著活性物質濃度的增加，抑制率也隨之增加，且不同活性物質濃度間的差異顯著（P＜0.05）（圖2）。

2.11 揮發(fā)性活性物質分析

菌株A8發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物GC-MS分析總離子流見圖3，由總離子流圖中分離度、分辨率和基線的穩(wěn)定性可看出本次實驗的分離鑒定方法的條件選擇是有效的?？偣卜蛛x出151個色譜峰，出峰時間主要集中在前22.5 min和后45 min，中間存在斷斷續(xù)續(xù)出峰的現(xiàn)象，其中在13.5 min左右時峰面積最大，其次是18、28.5和46 min。

圖3 直絲紫鏈霉菌A8發(fā)酵液乙酸乙酯相GC-MS圖譜Fig.3 The GC-MS spectrum of the Ethyl acetate phase from the strain A8

將所得質譜信息與NIST標準譜庫對照分析，質譜峰匹配度大于85的物質視為檢出物，按峰面積歸一化法確定各組分在揮發(fā)性物質中的相對含量，具體信息詳見表10。菌株A8所產(chǎn)生的揮發(fā)性物質主要有醇類、酮類、酰胺類、烷烴類、脂類、羧酸類和芳香烴類物質。其中脂類物質相對含量最高，達到15.7%以上，其次為芳香烴類和羧酸類物質，相對含量在11.7%和11.3%。

2.12 揮發(fā)性純物質對立枯絲核菌的生物活性測定

通過GC-MS分析菌株A8產(chǎn)生的揮發(fā)性活性物質，NIST標準譜庫檢索得到26種組分，經(jīng)過查閱文獻，有些物質不存在抑菌作用，或者因毒性較高安全起見沒有做相關生物活性測定試驗，此外，還有一些物質較難買到，因此總共購得 12 種不同組分的化合物替代菌株A8檢出物進行生物活性測定試驗。

進行生物活性測定試驗的 12種分析純物質包括：鄰苯二酚（Catechol）、1,2,4,5-四甲基苯（Benzene,1,2,4,5-tetramethyl-）、十六烷（Hexadecane）、鄰苯二甲酸二甲酯（Dimethyl phthalate）、鄰苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate）、鄰苯二甲酸二異辛酯（Diisooctyl phthalate）、鄰苯二甲酸二壬酯（1,2-Benzenedicarboxylic acid,dinonyl ester）、鄰苯二甲酸二（7-甲基辛基）酯（Phthalic acid,bis(7-methyloctyl) ester）、2-呋喃羧酸，酰肼（2-Furancarboxylic acid,hydrazide）、N-（2-苯乙基）-乙酰胺（Acetamide,N-(2-phenylethyl)-）、二氫-3-亞甲基-2,5-呋喃二酮（2,5-Furandione,dihydro-3-methylene-）、3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮（1,2-Cyclopentanedione,3-methyl-）。生測試驗結果表明鄰苯二甲酸二（7-甲基辛基）酯、十六烷、鄰苯二甲酸二壬酯、鄰苯二甲酸二異辛酯和N-（2-苯乙基）-乙酰胺5種物質的抑菌率在20%以下。另外7種物質的抑菌作用隨著接種濃度的增加而增強，其中 3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮、1,2,4,5-四甲基苯和二氫-3-亞甲基-2,5-呋喃二酮的抑菌作用明顯，在接種400 μL時達到70%以上（表11）。

2.13 分析純物質對蠟狀芽胞桿菌的生物活性測定

通過菌株 A8活性物質不同組分對蠟狀芽胞桿菌的抑菌作用研究表明：鄰苯二甲酸二（7-甲基辛基）酯、鄰苯二甲酸二壬酯、鄰苯二甲酸二異辛酯、1,2,4,5-四甲基苯和十六烷無抑菌圈的形成，對蠟狀芽胞桿菌沒有抑制作用。其他7種化合物對蠟狀芽胞桿菌表現(xiàn)出明顯的抑制作用，都隨著濃度的增加抑菌作用增強，且不同濃度間的差異顯著（P＜0.05）。其中二氫-3-亞甲基-2,5-呋喃二酮、2-呋喃羧酸，酰肼、鄰苯二酚和3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮在微劑量的濃度（50 μg/mL）下就形成較大的抑菌圈，分別是27.0、25.9、26.7和22.0 mm，二氫-3-亞甲基-2,5-呋喃二酮、2-呋喃羧酸，酰肼和鄰苯二酚在400 μg/mL的濃度下更是達到37.0、34.7和33.0 mm（圖4）。

2.14 生防菌A8對水稻紋枯病發(fā)病程度的防治結果

由表12可知，施藥后28 d，施了稻瘟靈和生防菌的水稻的發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著低于對照組（P＜0.05）。發(fā)病率和病情指數(shù)由高到低的處理分別為A8-3、A8-2、枯草芽胞桿菌、A8-1、稻瘟靈以及對照組，A8防效與枯草芽胞桿菌相近，且隨A8施加量的增加，對水稻紋枯病的防效越好。

表12 生防菌和農藥對水稻紋枯病的田間防效Table 12 Field control effects of biocontrol bacteria and pesticides on rice sheath blight

3 討論

放線菌的生長繁殖和生物活性次生代謝產(chǎn)物的分泌與培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和環(huán)境條件密切相關，針對篩選出的有拮抗活性的放線菌深入地研究其營養(yǎng)及發(fā)酵條件，對于拮抗放線菌的進一步開發(fā)研究及以后可能的工廠化生產(chǎn)均有重要意義[19]。直絲紫鏈霉菌A8在不同的營養(yǎng)和環(huán)境條件下菌絲生長量和抑菌活性物質的產(chǎn)量有著顯著的差異。在營養(yǎng)條件方面，可溶性淀粉和玉米粉作為緩效碳源比起葡萄糖、麥芽糖等速效碳源更加有利于菌株A8菌絲的生長和抑菌活性物質的產(chǎn)生。Nagato等[20]研究發(fā)現(xiàn)速效碳葡萄糖有利于Streptomyces griseoviridus G-89菌絲體的生長，但肽內酯抗生素neoviridogrisein II的產(chǎn)量低，而以緩效碳作為碳源時，菌株G-89的生長雖慢，但是抗生素產(chǎn)量高。黃豆粉和酵母膏組合作為有機氮源其菌絲生長量和活性物質產(chǎn)量比起無機氮源KNO3要更高，說明有機氮源更加適合菌株A8的發(fā)酵培養(yǎng)。在發(fā)酵培養(yǎng)基碳、氮源正交實驗中，適量的增加培養(yǎng)基中碳、氮源的含量能明顯提高菌株A8的菌絲生長量和活性物質的產(chǎn)量，但是可溶性淀粉、黃豆粉和酵母膏含量過大后，培養(yǎng)基的液態(tài)性較差而影響搖床培養(yǎng)，因此兼顧較好的產(chǎn)量及培養(yǎng)液性狀，選擇3%含量的可溶性淀粉，0.6%黃豆粉和0.4%酵母膏作為最佳的碳、氮源配比濃度。同時碳、氮源配比濃度的增加菌株A8的生物量也更高，但是其活性物質的產(chǎn)量并沒有隨之增加，說明菌株A8次生代謝物質的產(chǎn)量并不完全由菌絲體的生物量決定，其代謝途徑復雜[11]。發(fā)酵環(huán)境條件對菌株A8的發(fā)酵培養(yǎng)也有著顯著的影響，研究結果表明，該菌株最適宜的培養(yǎng)溫度是28 ℃～31 ℃，初始pH 7.0～8.0，裝液量是500 mL錐形瓶裝液100～200 mL，相對空氣量高、氧氣傳質阻力小更有利于菌株A8的生長，接種量3%～7%，過高的接種量其次生代謝物質含量高從而在菌株A8生長前期階段可能影響其擴大生長繁殖。本試驗菌株A8發(fā)酵條件的優(yōu)化是在高氏一號培養(yǎng)基的基礎上，雖然菌絲的生物量和代謝活性物質產(chǎn)量經(jīng)過碳、氮源以及發(fā)酵環(huán)境條件的優(yōu)化有一定的提高，但是相關微量元素如Na+、K+、Fe2+等的優(yōu)化并未驗證，有待進一步的研究。

利用鏈霉菌等拮抗微生物的生物活性次級代謝產(chǎn)物是防治植物病害的一種有效途徑[21]。最近研究表明，微生物揮發(fā)性有機化合物(MVOCs)在抑制病原菌生長，誘導植物產(chǎn)生抗病性和對非生物脅迫的耐受性有著重要的影響[22,23]。近些年來，Ahsan等[7]通過GC-MS技術從鏈霉菌KX852460產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物中提取和鑒定出二十烷、鄰苯二甲酸二丁酯等抗真菌活性物質，能抑制絲核菌AG-3菌株的生長。Jalaluldeen等[24]從辣椒根際土壤分離的鏈霉菌 KJ872546產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物中鑒定出的主要成分有六氫-吡咯并{1,2-a}吡嗪-1,4-二酮（Pyrrolo{1,2-a}pyrazine-1,4-dioe,hexahydro-）、六氫-3-（2-甲基丙基）-吡咯并{1,2-a}吡嗪-1,4-二酮（Pyrrolo{1,2-a}pyrazine-1,4-dione,hexahydro-3-(2-methylpropyl)-）和 5,10-二乙氧基-2,3,7,8-四氫-1H，6H-二吡咯并{1,2-a; 1,2-d}吡嗪（5,10-Diethoxy-2,3,7,8-tetrahydro-1H,6H-dipyrrolo{1,2-a;1,2- d}pyrazine）等物質，其能抑制尖孢鐮刀菌菌絲的生長。Prabavathy等[25]從鏈霉菌PM5中分離得到兩種脂肪族化合物 SPM5C-1和SPM5C-2分別帶有內酯和酮羰基，兩種化合物對稻瘟病菌和水稻紋枯病菌具有一定的抑制作用。但是這些報道的生防菌只是對真核真菌具有抑制作用。本研究直絲紫鏈霉菌A8次級代謝物質中含有豐富的生物活性化合物，在進行生物活性測定試驗的12種分析純物質中，鄰苯二酚、鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二丁酯、2-呋喃羧酸，酰肼、二氫-3-亞甲基-2,5-呋喃二酮和3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮對立枯絲核菌AG-1和蠟狀芽胞桿菌的生長均具有抑制作用，其中3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮和二氫-3-亞甲基-2,5-呋喃二酮在低濃度下就能對立枯絲核菌AG-1和蠟狀芽胞桿菌產(chǎn)生較強的抑制作用，具有潛在的同時抑制真菌和細菌的作用，為開發(fā)廣譜生防制劑提供很好的材料。目前關于這兩種酮類揮發(fā)性物質對立枯絲核菌 AG-1和蠟狀芽胞桿菌的抑制效果尚未報道，針對其抑菌機理還有待進一步研究。此外，本研究只進行了菌株A8的揮發(fā)性活性物質的檢測鑒定，關于其非揮發(fā)性活性物質還有待研究。

目前，國內外用于防治水稻紋枯病的微生物主要有真菌中的木霉菌Trichoderma sp.[26]、細菌中的芽胞桿菌Bacillus sp.[27,28]和假單胞菌Pseudomonas sp.[29]，以及放線菌中的鏈霉菌Streptomyces sp.等[30,31]，但尚未有用直絲紫鏈霉菌防治水稻紋枯病的研究報道。本試驗研究發(fā)現(xiàn)直絲紫鏈霉菌A8對水稻紋枯病有一定的防效，為水稻紋枯病病害的生物防控提供新的生防材料。