王 輝，劉 麗，黃宇飛，鄒春蕾，趙 穎，王 琦，劉長(zhǎng)遠(yuǎn)*

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，沈陽(yáng) 110161；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽(yáng) 100866；3.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，沈陽(yáng) 110161；4.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境資源研究所，沈陽(yáng) 100161；5.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，北京 100193）

辣椒疫霉菌Phytophthora capsici Leonian主要是以有性的卵孢子在土壤中越冬，翌年溫濕度適宜時(shí)可快速生長(zhǎng)繁殖，引起辣椒大面積死亡，破壞作物根際微生態(tài)環(huán)境，造成土壤連作障礙[1,2]。目前，生產(chǎn)上辣椒疫病的防治仍以化學(xué)農(nóng)藥為主[3]，導(dǎo)致了病原菌抗藥性增強(qiáng)與遺傳分化[4,5]，使防治難度加大，危害環(huán)境與人類(lèi)健康。因此，生產(chǎn)上急需安全有效的替代技術(shù)。生防微生物對(duì)環(huán)境、動(dòng)植物友好，可以通過(guò)抑制、重寄生或競(jìng)爭(zhēng)等作用改變土壤原有的微生物群落組成與結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到防治土傳病害、提高植物抗逆性、修復(fù)病土的目的[6-8]，成為植物病害綠色防控的重要手段。研究發(fā)現(xiàn)，叢枝菌根菌 AMF（Arbuscular mycorrhizal fungi）、木霉菌Trichoderma spp.、芽胞桿菌Bacillus spp.、假單胞菌Pseudomonas spp.與鏈霉菌Streptomyces spp.等對(duì)辣椒疫病均具有較好的防治效果[9,10]。曲霉屬微生物分泌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物對(duì)植物病原菌具有明顯抑制作用[11,12]，其中黃柄曲霉Aspergillus flavipes已被證實(shí)可產(chǎn)生對(duì)辣椒疫霉菌具有拮抗作用的活性成分，且具有穩(wěn)定的遺傳特性及環(huán)境適應(yīng)性[13,14]，應(yīng)用前景廣闊。

真菌作為植物根際土壤微生物的重要組成部分，構(gòu)成了大部分微生物生物量，其物種的組成與豐度變化直接影響土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化[15]、土傳病害的發(fā)生[16]與植物的健康[17]。因此，了解土壤真菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，分析與土壤環(huán)境功能因子的相關(guān)性，對(duì)有效改良土壤微環(huán)境，維持生態(tài)系統(tǒng)物種的多樣性、保持生態(tài)平衡具有重要意義。黃柄曲霉 ASD來(lái)源于遼寧設(shè)施辣椒連作土壤，其次生代謝產(chǎn)物中含有辣椒疫病活性抑菌物質(zhì)已經(jīng)被證實(shí)[13]，本文擬探討 ASD菌株是否同時(shí)具有調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)環(huán)境的功能，結(jié)果可為ASD菌株應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤采集與采集地情況

試驗(yàn)用土采集于鞍山市溫香鎮(zhèn)東高村，該地區(qū)連續(xù)種植辣椒達(dá)10 a以上，是遼寧省辣椒種植主產(chǎn)區(qū)，種植品種為牛角椒。東高村位于遼寧南部，北緯 41°04′93"，東經(jīng) 122°60′07"，年平均氣溫 10.4 ℃，年降水量721.3 mm，日照時(shí)數(shù)為1551.25 h。2018年7月于東高村選取3棟未發(fā)病的溫室，利用5點(diǎn)取樣法[18]，每點(diǎn)取3株成株的根際土壤，用抖落法獲得根際土壤[19]。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 試驗(yàn)菌株與菌液的制備 黃柄曲霉Aspergillus flavipes ASD與辣椒疫病菌Phytophthora capsica BZ均由本研究室分離、鑒定并保存。菌株BZ為遼寧省優(yōu)勢(shì)3號(hào)生理小種、A1交配型，致病力中等。

ASD菌液的制備：將生長(zhǎng)于PDA平板[20]的ASD菌株接種于裝有100 mL PDA培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，25 ℃ 140 r/min培養(yǎng)7 d后，將發(fā)酵液5000 r/min離心1 min，沉淀大塊的菌絲球，將上清液配制成濃度為1×107孢子/mL的菌液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

BZ孢子囊懸浮液的制備：將BZ菌株接種于PDA培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)5 d，制成菌碟后接種于市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的辣椒果實(shí)上（接種前用75%乙醇消毒3次），25 ℃培養(yǎng)7 d，待果實(shí)長(zhǎng)滿(mǎn)白色霉?fàn)钗铮脽o(wú)菌水洗下孢子囊，配制成濃度為1×105個(gè)/mL的孢子囊懸浮液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 辣椒品種 選用遼寧主栽品種牛角椒37-74為試材，由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所辣椒課題組提供。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與土壤樣本采集

試驗(yàn)于遼寧省農(nóng)科院試驗(yàn)基地進(jìn)行，將采集到的土壤充分混勻后分裝到直徑20 cm、深30 cm花盆中，每盆播種2粒種子，待長(zhǎng)至8片真葉期時(shí)采用灌根法接種[7]。生防菌ASD處理：在距辣椒植株根莖約2 cm處注入ASD菌液10 mL，翌日在距辣椒根莖5 cm處注入辣椒疫病BZ孢子囊懸浮液10 mL，即為經(jīng)ASD處理的罹病土壤；辣椒疫霉菌BZ處理：于辣椒根莖5 cm處注入BZ孢子囊懸浮液10 mL，即為罹病土壤；清水對(duì)照處理（CK）：于辣椒根莖5 cm處注入清水10 mL。正常管理，每處理3次重復(fù)，每次重復(fù)20株苗。

于接入疫病菌孢子囊懸浮液第20 d連根拔起全部辣椒苗，抖落法獲得辣椒根際土壤[19]，分別將各處理土壤充分混勻后過(guò)篩2 mm，以去除根系和雜質(zhì)：5.0 g鮮土液氮速凍后?80 ℃保存用于土壤真菌菌群結(jié)構(gòu)分析；150.0 g鮮土儲(chǔ)存于?20 ℃用于測(cè)定土壤酶活，并在7 d內(nèi)完成；風(fēng)干后土樣200.0 g用于測(cè)定土壤理化因子。

1.4 土壤營(yíng)養(yǎng)測(cè)定

土壤有機(jī)質(zhì)（SOM）測(cè)定采用重鉻酸鉀容量法[21]、銨態(tài)氮（NH4+-N）采用聯(lián)合浸提－紫外光度法[22]、硝態(tài)氮（NO3--N）采用氯化鉀溶液提取－紫外分光光度法[23]、有效磷（AP）采用碳酸氫鈉浸提－紫外光度法[24]、有效鉀（AK）采用乙酸銨浸提－原子吸收分光光度法[25]。

1.5 土壤酶活性測(cè)定

蛋白酶（PRO）采用 Folin比色法[26,27]，酚氧化酶（PHO）采用二羥基苯丙氨酸比色法測(cè)定[28]，酸性磷酸單酯酶（APA）采用對(duì)硝基苯磷酸鈉比色法測(cè)定[29]，β-葡萄糖苷酶（BG）采用對(duì)-硝基苯基β-D-葡萄糖苷比色法[30]，N-乙?；?β-D-氨基葡糖苷酶（NAG）采用對(duì)硝基酚比色法[31]。

1.6 真菌多樣性分析

利用“Mobio土壤強(qiáng)力提取試劑盒”提取土壤樣品基因組DNA（美國(guó)），真菌多樣性分析基于Illumina HiSeq平臺(tái)，對(duì)ITS1區(qū)域進(jìn)行雙末端測(cè)序，測(cè)序結(jié)果利用Usearch對(duì)相似度97%以上的Tags進(jìn)行聚類(lèi)，獲得分類(lèi)單元 OTU；利用 Unite數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì) OTU進(jìn)行分類(lèi)學(xué)注釋、Heatmap進(jìn)行聚類(lèi)分析；利用 Mothur（Versionv.1.30）開(kāi)展α多樣性分析、Bray-Curtis進(jìn)行β多樣性分析；利用R Vegan對(duì)物種豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算后，選擇RDA（Redundancy Analysis）開(kāi)展與環(huán)境因子的相關(guān)性分析。

1.7 發(fā)病率與優(yōu)勢(shì)物種相關(guān)分析

接入BZ孢子囊懸浮液第2 d開(kāi)始觀(guān)察并記錄辣椒發(fā)病情況，于第7 d、第20 d統(tǒng)計(jì)辣椒發(fā)病株數(shù)，按照下列公式計(jì)算發(fā)病率，病株率（%）＝（病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100。每處理3次重復(fù)。結(jié)合1.6試驗(yàn)結(jié)果，利用SPSS 22.4 Bivariate開(kāi)展優(yōu)勢(shì)物種與發(fā)病率相關(guān)性分析。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 22.4軟件進(jìn)行One-Way ANOVA 0.05水平的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ASD對(duì)土壤養(yǎng)分與酶活性的影響

生防菌ASD的施用明顯提高了罹病土壤NO3--N與AK含量，降低了NH4+-N含量；與清水對(duì)照相比，NO3--N與NH4+-N含量明顯下降，其余因子變化不顯著（F＝0.05，表1）；ASD施用后NAG酶活性明顯低于罹病土壤與清水對(duì)照土壤，PRO、APA、PHO與BG酶活性變化不顯著（F＝0.05，表2）。

表2 生防菌ASD對(duì)土壤酶活性的影響Table 2 Effects of biocontrol strain ASD on soil enzyme activities

2.2 真菌菌群多樣性與結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 α多樣性 稀釋性曲線(xiàn)表明（圖1），3個(gè)土壤樣品在抽取序列數(shù)量10000時(shí)出現(xiàn)拐點(diǎn)，此時(shí)的OTU數(shù)量為200～300，之后各條曲線(xiàn)趨勢(shì)逐漸平緩，增加測(cè)序數(shù)據(jù)只能產(chǎn)生少量新的OTU，數(shù)據(jù)量達(dá)到飽和，測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種（覆蓋率＞99.9%）。菌株ASD處理后與罹病土壤相比Shannon、Ace指數(shù)與Chao1指數(shù)明顯升高，Simpson變化不明顯。與對(duì)照土壤相比，Shannon與Simpson明顯升高，Ace指數(shù)與Chao1 指數(shù)變化不明顯（F＝0.05，表3），說(shuō)明生防菌ASD處理后罹病土壤真菌多樣性與豐度均提高。

2.2.2 β多樣性分析 利用主坐標(biāo)分析法進(jìn)行PCoA（Principal coordinates analysis）分析，主坐標(biāo)PC1、PC2對(duì)土壤真菌群落多樣性總解釋率達(dá)67%。在PC1（47.51%）影響下，生防菌ASD處理的3次生物學(xué)重復(fù)點(diǎn)位于橫坐標(biāo)負(fù)軸，罹病土壤與清水對(duì)照處理的3次生物學(xué)重復(fù)點(diǎn)位于正軸。樣品點(diǎn)位置與點(diǎn)間距離表明，3個(gè)處理組內(nèi)重復(fù)性均較好；罹病土壤與對(duì)照土壤真菌群落構(gòu)成差異較小，兩者與ASD處理的土壤真菌群落構(gòu)成差異較大（圖2）。

圖2 真菌PCoA分析Fig.2 PCoA analysis of fungi

2.2.3 真菌菌群組成與結(jié)構(gòu) 將Euclidean距離算法與Complete聚類(lèi)方法合并，對(duì)Genus水平豐度＞1%的真菌物種進(jìn)行聚類(lèi)分析。圖3顯示3個(gè)處理優(yōu)勢(shì)物種豐度有明顯差異：罹病土壤中斜蓋傘屬Clitopilus與近地傘屬Parasola豐度較高，ASD菌液處理后相對(duì)豐度降低；嗜熱鏈球菌屬M(fèi)ycothermus、嗜熱毀絲霉屬M(fèi)yceliophthora、瑞默氏屬Remersonia、青霉菌屬Penicillium、曲霉屬Aspergillus、鐮孢菌屬Fusarium、枝孢屬Cladosporium、鏈格孢屬Alternaria、錐蓋傘屬Conocybe與被孢霉屬M(fèi)ortierella在罹病土壤與對(duì)照土壤中豐度中等或低，ASD菌液處理后豐度升高；小脆柄菇屬Psathyrella只在清水對(duì)照土壤中豐度高，在罹病土壤與ASD處理土壤中相對(duì)豐度下降。結(jié)果說(shuō)明，ASD處理后豐度升高的優(yōu)勢(shì)物種數(shù)量明顯高于罹病與對(duì)照土壤，聚類(lèi)結(jié)果同樣顯示了罹病土壤與對(duì)照土壤真菌豐度接近，二者與生防菌ASD處理距離較遠(yuǎn)。

圖3 屬水平真菌相對(duì)豐度聚類(lèi)熱圖Fig.3 Clustering heat map of relative abundance of fungi on genus level

2.2.4 與環(huán)境因子RDA分析 選取含量顯著變化的NH4+-N、NO3--N、AK與NAG開(kāi)展相關(guān)分析。DCA（Discriminant Component Analysis）計(jì)算結(jié)果中Lengths of gradient第一軸中的Axis lengths最大值為3.31，介于3.0～4.0，在Genus水平開(kāi)展RDA線(xiàn)型相關(guān)分析。RDA1和RDA2占總解釋變量的42.82%，罹病土壤和對(duì)照土壤處理位于橫坐標(biāo)正軸內(nèi)，二者群落結(jié)構(gòu)相似，與位于負(fù)軸的ASD處理差異較大；NO3--N和AK含量與ASD處理呈正相關(guān)，并正向影響錐蓋傘屬、毀絲霉屬、瑞默氏屬、嗜熱鏈球菌屬、被孢霉屬、青霉屬、鏈格孢屬及曲霉屬的相對(duì)豐度；NH4+-N含量、NAG活性與罹病土壤及對(duì)照土壤處理呈正相關(guān)，正向影響小脆柄菇屬與斜蓋傘屬相對(duì)豐度（圖4，5）。

2.3 優(yōu)勢(shì)物種與發(fā)病率相關(guān)分析

辣椒植株從接入BZ孢子囊懸浮液第7 d后開(kāi)始陸續(xù)發(fā)病，第7 d發(fā)病率達(dá)98.33%，第20 d時(shí)發(fā)展病率達(dá)100%；施入生防菌ASD菌液后第7 d和第20 d發(fā)病率均為11.67%（表4）。Genus水平豐度＞1%的優(yōu)勢(shì)真菌與發(fā)病率的相關(guān)分析表明，斜蓋傘屬與辣椒疫病發(fā)病率呈顯著正相關(guān)（R＞0，P＜0.05），錐蓋傘屬和近地傘屬豐度與發(fā)病率呈正相關(guān)不顯著（R＞0，P＞0.05）；鏈格孢屬、曲霉屬與被孢霉屬等10個(gè)物種豐度與發(fā)病率呈不顯著負(fù)相關(guān)（R＜0，P＞0.05），結(jié)果與聚類(lèi)熱圖優(yōu)勢(shì)物種變化基本一致（表5）。

表4 生防菌ASD對(duì)辣椒發(fā)病率的影響Table 4 Effects of biocontrol strain ASD on the incidence in pepper

3 討論

真菌作為真核生物，是土壤中植物殘?bào)w的主要分解者[32]，對(duì)改變土壤營(yíng)養(yǎng)狀況與維持植物正常生長(zhǎng)發(fā)揮重大作用[33]。本研究通過(guò)對(duì)土壤營(yíng)養(yǎng)與酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，ASD可以明顯提高罹病土壤硝態(tài)氮、有效鉀含量，降低銨態(tài)氮含量與 N-乙?；?β-D-氨基葡糖苷酶（NAG）活性。銨態(tài)氮與硝態(tài)氮的變化趨勢(shì)不同，一方面可能是由于土壤中2種形態(tài)氮素的轉(zhuǎn)化速度不同[34]，快速的硝化作用消耗了土壤中的銨態(tài)氮導(dǎo)致[35]；另一方面可能與取樣時(shí)間有關(guān)，郭媛等[36]研究結(jié)果證明，不同施肥處理下土壤中的硝態(tài)氮與銨態(tài)氮在1～28 d內(nèi)是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)變化曲線(xiàn)：銨態(tài)氮在1～4 d內(nèi)快速達(dá)到峰值，7～14 d又快速下降，28 d后趨勢(shì)于穩(wěn)定；硝態(tài)氮?jiǎng)t反之，在1～28 d內(nèi)硝態(tài)氮含量呈上升趨勢(shì)，之后含量穩(wěn)定。本研究的取樣時(shí)間點(diǎn)為接入ASD菌液第20 d，2種形態(tài)的氮素含量水平是否也存在動(dòng)態(tài)變化曲線(xiàn)這需進(jìn)一步研究證明。NAG作為降解幾丁質(zhì)和肽聚糖的微生物胞外酶，其活性會(huì)受到土壤氮素有效性的抑制[37,38]。此外，本研究在20 d取樣時(shí)發(fā)現(xiàn)，土壤有機(jī)質(zhì)、有效磷含量及蛋白酶、酸性磷酸單酯酶、β-葡萄糖苷酶活性影響不顯著，這是因?yàn)橥寥烙袡C(jī)質(zhì)與土壤酶是一個(gè)復(fù)雜長(zhǎng)期變化、互相影響的復(fù)雜綜合體，受多種因素協(xié)同作用，對(duì)土壤微生態(tài)環(huán)境具有緩沖作用，在短時(shí)間內(nèi)可以保持相對(duì)穩(wěn)定性，因此導(dǎo)致多個(gè)環(huán)境因子在短時(shí)間內(nèi)變化不顯著。

生防真菌作為外源功能微生物可以通過(guò)改變土壤原有微生物群落結(jié)構(gòu)，從而抑制病害的發(fā)生也已經(jīng)被許多研究證實(shí)：劉國(guó)坤等[39]利用生防真菌淡紫擬青霉Paecilomyces lilacinus處理柑橘慢衰病根際土壤，扈進(jìn)冬等[40]利用木霉拌種劑LTR-2處理小麥土壤后，土壤真菌多樣性與豐度均有所升高，土壤真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，降低病害的發(fā)生。均與本研究結(jié)果一致：黃柄曲霉 ASD處理后土壤真菌多樣性與豐度均有所提高。ASD的施入提高了嗜熱鏈球菌屬與嗜熱毀絲霉屬等物種豐度、降低了斜蓋傘屬與近地傘屬豐度，使土壤優(yōu)勢(shì)種群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；豐度上升的優(yōu)勢(shì)物種與發(fā)病率負(fù)相關(guān)（錐蓋傘屬除外），豐度下降的物種與發(fā)病率正相關(guān)，這也證明了菌株 ASD可以通過(guò)改變土壤優(yōu)勢(shì)真菌結(jié)構(gòu)與豐度，從而降低了辣椒疫病的發(fā)病率。此外，本研究豐度升高的物種中有8個(gè)屬為子囊菌門(mén)Ascomycota，該類(lèi)真菌多為土壤腐生真菌，廣泛存在于土壤中，可以降解木質(zhì)纖維素[41-43]，為土壤有機(jī)質(zhì)的提供起到積極作用[44,45]。值得注意的是，同為擔(dān)子菌門(mén)傘菌目的斜蓋傘屬與錐蓋傘屬在 ASD施用后豐度變化方向不同，但均與發(fā)病率正相關(guān)，這是否與ASD代謝產(chǎn)物中存在抑制或促進(jìn)其生長(zhǎng)的物質(zhì)有關(guān)，需進(jìn)一步驗(yàn)證。

由致病菌引起的土壤連作障礙是一個(gè)長(zhǎng)期的化學(xué)演變過(guò)程，生防菌作為具有活性抑菌物質(zhì)的天然產(chǎn)物對(duì)土壤的改善也需要長(zhǎng)期施用才可以實(shí)現(xiàn)，而不是短期施用可以實(shí)現(xiàn)的。生防真菌 ASD具有改變土壤營(yíng)養(yǎng)狀況、調(diào)節(jié)土壤微生物數(shù)量和種群結(jié)構(gòu)、抑制病原菌生長(zhǎng)的作用。研究結(jié)果可為黃柄曲霉 ASD作為新的生防資源應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)。