冶福春，馬文林，楊曉龍

（青海農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，西寧 812100）

燕麥Avena sativa是禾本科Gramineae早熟禾亞科Pooideae燕麥族Aveneae燕麥屬Avena一年生草本植物，目前在全球均有分布[1-3]，因其富含蛋白質(zhì)、抗氧化物和礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分，具有調(diào)節(jié)血脂、延緩衰老、改善血液循環(huán)等保健功能，被認(rèn)為具有獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、生態(tài)價(jià)值和醫(yī)療價(jià)值等[4]。此外，燕麥的葉片和秸稈柔嫩多汁，適口性好，粗脂肪、粗蛋白含量高，纖維含量低，是農(nóng)牧區(qū)冬春補(bǔ)飼與抗災(zāi)保畜的優(yōu)良飼草料，在畜牧業(yè)發(fā)展中具有舉足輕重的地位[5]。近年來，隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)燕麥的需求量增加，燕麥的種植面積正逐漸擴(kuò)大[6]。然而，燕麥病害嚴(yán)重制約其生產(chǎn)，不僅影響燕麥的產(chǎn)量及品質(zhì)，部分還可能產(chǎn)生毒素，導(dǎo)致取食燕麥的人、畜代謝紊亂[7,8]。

我國(guó)當(dāng)前在燕麥病害方面的研究相對(duì)較少，其中真菌性病害25種，主要包括根腐病Pythium spp.，葉斑病Drechslera avenae、稈銹病Puccinia graminis、白粉病Blumeriagraminis、紋枯病Rhizoctonia cerealis、堅(jiān)黑穗病Ustilago segetum等；細(xì)菌性病害4種，主要包括條紋葉枯病Pseudomonas syringae pv.striafaciens、細(xì)菌性斑點(diǎn)病P.syringae pv.coronafaciens等；國(guó)際上報(bào)道的燕麥病毒性病害共5種，而我國(guó)目前發(fā)現(xiàn)兩種，分別是由燕麥紅條花葉病毒ORSMV引起的花葉病和由大麥黃矮病毒BYDV引起的紅葉?。欢鴫乃腊唏g病毒ONMV、燕麥花葉病毒OMV及病毒性矮縮病毒OBDV引起的花葉病在我國(guó)未見報(bào)道[8,9]。我國(guó)對(duì)燕麥病害的研究存在主要病害種類、病原菌類型及流行規(guī)律等了解不清的問題，對(duì)很多主要病害以及多發(fā)病害缺乏深入、系統(tǒng)地研究[8]。

近年來，燕麥葉斑病危害日趨嚴(yán)重，已成為燕麥生產(chǎn)中的主要病害，多數(shù)燕麥主產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生[10,11]。該病害由半知菌類內(nèi)臍孺孢屬（又稱德氏霉屬）燕麥內(nèi)臍蠕孢菌D.avenae （Eidam） Shoemaker引起，有性階段為子囊菌門燕麥核腔菌Pyrenophora avenae Eidam Ito et Kurib[12]。袁軍海等[13]研究發(fā)現(xiàn)，燕麥葉斑病在冀西北地區(qū)發(fā)生范圍廣泛，84.31%的品種感病，病葉率達(dá)90%以上，造成燕麥光合作用下降、產(chǎn)量降低，一般減產(chǎn)5%～10%，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)30%。

針對(duì)該病害，生產(chǎn)上主要采用化學(xué)藥劑進(jìn)行防治。40%多菌靈對(duì)燕麥葉斑病的防治效果較佳，但是化學(xué)防治高毒、對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重、對(duì)人畜不安全、易誘導(dǎo)病原物抗性的產(chǎn)生，不利于有機(jī)燕麥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，加之燕麥生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益低，化學(xué)防治在燕麥生產(chǎn)上并不可取[14]。有研究人員認(rèn)為，選育燕麥抗病品種是燕麥葉斑病防治最經(jīng)濟(jì)、最有效以及對(duì)自然環(huán)境安全的一種防治措施。對(duì)于抗病品種的選育，主栽品種（系）是其抗病基因的重要來源，但截至目前，未發(fā)現(xiàn)有關(guān)我國(guó)燕麥主栽品種（系）抗葉斑病鑒定的相關(guān)報(bào)道。因此，環(huán)境友好的生物防治措施逐漸被運(yùn)用于燕麥葉斑病的防治當(dāng)中。

植物病害生物防治，指利用一些有益微生物或其代謝產(chǎn)物對(duì)農(nóng)作物病害進(jìn)行有效防治[15]。因其無抗藥性、對(duì)環(huán)境無污染、人畜友好，正逐漸被人們所關(guān)注，成為未來病害防治的有效措施。目前，燕麥葉斑病的生物防治研究較少，篩選獲得高效防治燕麥葉斑病的生防菌株對(duì)整個(gè)燕麥產(chǎn)業(yè)發(fā)展尤為重要和急迫。

本研究主要從燕麥葉斑病發(fā)生生境開展相關(guān)生防菌株篩選及其防病促生功能研究。通過平板對(duì)峙及水解酶活性測(cè)定試驗(yàn)，從燕麥生境中分離獲得一株生防菌株Qh-618，經(jīng)過生理生化試驗(yàn)、16S rDNA及gyrB基因測(cè)序鑒定其為枯草芽胞桿菌。體外評(píng)估試驗(yàn)結(jié)果顯示，生防菌 Qh-618對(duì)多種病原真菌都具有較強(qiáng)的抑菌活性，對(duì)德氏霉菌D.avenae的孢子萌發(fā)也具有顯著的抑制效果；此外水解酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Qh-618具有較強(qiáng)的蛋白酶、半乳糖苷酶、嗜鐵素酶及乙烯產(chǎn)生活性；進(jìn)一步溫室試驗(yàn)、田間試驗(yàn)結(jié)果表明，生防菌Qh-618對(duì)燕麥生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，對(duì)燕麥葉斑病的防治效果達(dá)58.57%以上。綜上所述，枯草芽胞桿菌B.subtilus Qh-618是一株對(duì)燕麥葉斑病具有高效防治潛力的生防促生菌株。本研究的順利完成為后期燕麥葉斑病高效生物農(nóng)藥開發(fā)及應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土樣、供試植物材料

燕麥根圍土采集于青海省西寧市湟源縣（101°25643′E，36°68243′N，海拔高度2753米）燕麥種植基地。試驗(yàn)所選植物為燕麥“巴燕4號(hào)”，屬于早熟品種，由青海畜牧獸醫(yī)科學(xué)院草原研究所創(chuàng)制，適合于在當(dāng)?shù)睾０屋^高地區(qū)種植，生產(chǎn)特性表現(xiàn)較佳。

1.2 供試菌株和培養(yǎng)基

供試的5個(gè)病原真菌為德氏霉菌屬Drechslera sp.、鐮刀菌屬Fusarium sp.、灰霉菌屬Botrytis sp.、赤霉病菌Gibberella sp.和蔓枯病菌Ascochyta sp.由本實(shí)驗(yàn)室自主分離于相關(guān)病害發(fā)病組織，并純化、保存。生防菌株的分離和培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂粉15 g/L，調(diào)節(jié)pH至7.0），病原真菌的活化培養(yǎng)采用PDA 培養(yǎng)基（葡萄糖20 g/L，馬鈴薯200 g/L，瓊脂粉15 g/L，調(diào)節(jié)pH至7.0）；病原真菌的平板對(duì)峙采用WA培養(yǎng)基（蛋白胨5 g/L，葡萄糖10 g/L，肉汁浸膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂20 g/L，調(diào)節(jié)pH至7.0）[16]。

1.3 拮抗細(xì)菌的分離與篩選

從青海省西寧市湟源縣燕麥種植區(qū)采集健康燕麥的根際土壤10份、健康植株葉片10份，分別使用無菌袋保存。生防菌株的分離參考文獻(xiàn)報(bào)道[17]，稱取10 g土壤，置于90 mL無菌水的錐形瓶中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)30 min。取振蕩好的土壤浸出液按不同倍數(shù)進(jìn)行稀釋，并將不同稀釋倍數(shù)的土壤浸出液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基，將平板置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h獲得細(xì)菌單菌落，最后挑取形態(tài)不同的細(xì)菌菌落，經(jīng)平板劃線純化后進(jìn)行統(tǒng)一編號(hào)保存。

1.4 體外平板對(duì)峙試驗(yàn)

采用平板對(duì)峙法評(píng)估生防菌對(duì)病原菌的拮抗效果。將待試生防菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h待用。將5個(gè)病原真菌分別接種于PDA平板進(jìn)行活化，待真菌長(zhǎng)滿平板后，利用無菌的打孔器將長(zhǎng)滿菌的平板打成直徑為0.8 cm的菌餅。于直徑9 cm WA平板中心接種0.8 cm的菌餅，將拮抗菌株接種距離真菌菌餅2.5 cm處，以無菌水作為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。隨后將平板置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，待菌絲長(zhǎng)滿平板邊緣，統(tǒng)計(jì)抑菌圈的直徑，并拍照記錄。

1.5 生防細(xì)菌的鑒定及進(jìn)化樹分析

1.5.1 細(xì)菌生理生化反應(yīng)測(cè)定 本試驗(yàn)參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》的方法[17]，對(duì)篩選獲得的生防菌株Qh-618進(jìn)行革蘭氏細(xì)菌染色、運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)、生長(zhǎng)溫度試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、耐鹽性試驗(yàn)、V-P 試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、明膠液化試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、山梨醇發(fā)酵、水楊苷發(fā)酵、MR、尿素苷試驗(yàn)、鳥氨酸脫羧酶試驗(yàn)、色氨酸肉湯試驗(yàn)、苯丙氨酸試驗(yàn)、七葉苷試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、西蒙氏枸櫞酸鹽試驗(yàn)、精氨酸雙水解酶試驗(yàn)、甘油利用等生理生化試驗(yàn)。

1.5.2 16S rDNA及gyrB基因擴(kuò)增、測(cè)序鑒定及進(jìn)化樹分析 利用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，并以其為模板，對(duì) 16S rRNA 編碼基因和 gyrB基因進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。16S rDNA 通用引物 16S-F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；16S-R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGAC TT-3'；gyrB 引物：gyrB1：5'-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3'；gyrB2：5'-AGCAGGGTACGGATG TGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3'。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：2×Taq Master Mix 25 μL，上下游引物各 0.5 μL，生防菌 DNA 模板 0.5 μL，ddH2O 23.5 μL。PCR 反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性 1 min；98 ℃變性 10 s；55 ℃退水20 s；72 ℃延伸30 s；35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖水平電泳檢測(cè)后，送測(cè)序公司（南京擎科生物科技有限公司）測(cè)序分析，采用MEGA 7.0 軟件中的最大似然法構(gòu)建生防菌株Qh-618與其他相近菌株之間的進(jìn)化樹[16]。

1.6 水解酶活性測(cè)定

1.6.1 蛋白酶活性測(cè)定 在蛋白酶平板上（A：脫脂奶粉8 g，溶于300 mL去離子水中，115 ℃滅菌10 min：B：瓊脂粉 8 g，定容至300 mL，121 ℃滅菌20 min，A與B分別滅菌后混合）接種生防菌Qh-618，28 ℃培養(yǎng)3 d后觀察透明圈有無，并記錄大小[18]。

1.6.2 幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定 將細(xì)菌接種于以膠體狀幾丁質(zhì)為唯一碳源的培養(yǎng)基（Chi-Ayers）上培養(yǎng)（磷酸二氫銨1.0 g/L，氯化鉀0.2 g/L，水合硫酸鎂0.2 g/L，膠體狀幾丁質(zhì)1%（w/v）100 mL，瓊脂粉 20 g/L，調(diào)節(jié)pH至7.0），28 ℃ 培養(yǎng)3 d后觀察透明圈有無，并記錄大小[18,19]。

1.6.3 多聚半乳糖醛酸酶活性測(cè)定 將生防菌接種于多聚半乳糖醛酸酶活性測(cè)定平板上（PGA 10 g/L，酵母浸粉 10 g/L，醋酸鈉（pH 5.5）110 mmol/L，EDTA 2.2 mmol/L，瓊脂粉 20 g/L）。28 ℃培養(yǎng)3 d后，用1 g/L的剛果紅染1 h后，倒掉染液，再用1 mol/L的氯化鈉浸泡1 h，觀察透明圈有無，并記錄大小[20]。

1.6.4 產(chǎn)嗜鐵素活性測(cè)定 首先配置A、B溶液，A：①60.5 mg鉻天青S溶于50 mL去離子水；②10 mL三價(jià)鐵溶液（1 mmol/L FeCl3·6H2O鹽酸為溶劑）；③72.9 mg CTAB溶于40 mL去離子水。上述3個(gè)溶液混合定容至100 mL，pH調(diào)至中性，121 ℃滅菌20 min；B：30.24 g Pipes加入900 mL WA培養(yǎng)基，pH 6.8，121 ℃滅菌20 min。將A、B液混合倒平板，將生防菌接種于制作好的測(cè)定平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后觀察透明圈有無，并記錄結(jié)果[18,21]。

1.6.5 產(chǎn)吲哚乙酸活性測(cè)定 首先稱取二甲氨基苯甲醛8 g，溶于760 mL 95%酒精和160 mL濃鹽酸中，制得埃利希氏試劑。將生防菌接種于1%胰蛋白胨水溶液（pH 7.2～7.6）液體培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，將前期配置的埃利希氏試劑加入生防菌培養(yǎng)液中，觀察液面是否變紅[18,22]。

1.7 生防菌對(duì)燕麥德氏霉菌孢子萌發(fā)影響

將培養(yǎng)好的生防菌懸液用細(xì)菌過濾器過濾，取濾液2 mL均勻涂于含有水瓊脂培養(yǎng)基的90 mm平板上，待濾液完全滲入培養(yǎng)基后，吸取濃度為105孢子/mL燕麥德氏霉菌孢子懸浮液 100 μL，均勻涂布于前期準(zhǔn)備的含有生防菌懸浮液的平板上，并做好標(biāo)記。將平板置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于1、3、6、12和18 h鏡檢孢子萌發(fā)情況，并記錄萌發(fā)率。以無菌水作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。孢子萌發(fā)率（%）＝孢子萌發(fā)數(shù)/（孢子萌發(fā)數(shù)＋未萌發(fā)孢子數(shù)）×100%。

1.8 生防菌對(duì)多種病原真菌的影響

首先對(duì)燕麥“巴燕4號(hào)”種子進(jìn)行表面消毒，利用70%乙醇溶液處理30 s，3%～5%次氯酸鈉溶液處理3 min，隨后用無菌水漂洗3～5次。將消毒好的燕麥種子置于28 ℃培養(yǎng)箱中催芽。將萌發(fā)的燕麥種子置于生防菌菌懸液（1×106CFU/mL）中浸泡1 h進(jìn)行預(yù)處理，隨后將種子撈出，晾干，待用。將前期生防菌預(yù)處理燕麥種子置于含有5種參試病原真菌的水瓊脂平板表面（1×104孢子/板），每個(gè)平板4粒種子，25 ℃共培養(yǎng)7 d。其中以未接種生防菌的燕麥種子作為對(duì)照。觀察種子發(fā)芽及發(fā)病情況，并計(jì)算生防菌對(duì)種子萌發(fā)促進(jìn)作用及對(duì)病原真菌的抑菌率。萌發(fā)率（%）＝（處理種子發(fā)芽率－對(duì)照種子發(fā)芽率）/對(duì)照種子發(fā)芽率×100，抑菌率（%）＝（處理種子發(fā)病率－對(duì)照種子發(fā)病率）/對(duì)照種子發(fā)病率×100。

1.9 葉綠素含量測(cè)定

本研究葉綠素含量采用葉綠素儀（SPAD儀，型號(hào)：霍爾德 HED-YB）進(jìn)行測(cè)定。選擇生長(zhǎng)一致受光方向一致的燕麥苗進(jìn)行測(cè)定。將燕麥葉片置于葉綠素儀測(cè)量位置，并按下測(cè)量壓頭2～3 s，測(cè)定葉綠素含量，并記錄測(cè)量值。每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)取9片相同部位葉片。

1.10 溫室試驗(yàn)

促生試驗(yàn)共設(shè)2個(gè)處理，Qh-618處理組和清水對(duì)照。每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒燕麥種子。將燕麥種子均勻播撒于無菌基質(zhì)的盆缽（口徑12 cm，底徑9.5 cm，盆高13 cm）中。置于溫度為 28 ℃、光周期16L:8D、相對(duì)濕度70%以上的溫室條件下培養(yǎng)。待燕麥出苗3 d后，利用1×107CFU/mL的Qh-618菌懸液進(jìn)行噴霧接種，每盆苗接種20 mL，均勻噴施，直至液體布滿燕麥全株，以無菌水作為對(duì)照。分別于生防菌接種后5和10 d，統(tǒng)計(jì)各處理組燕麥苗的生長(zhǎng)指標(biāo)（包括：葉綠素含量、根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)、根鮮重、根干重、苗鮮重以及苗干重）。

Qh-618對(duì)燕麥德氏霉菌溫室防治試驗(yàn)，首先利用1×107CFU/mL的Qh-618菌懸液對(duì)燕麥苗進(jìn)行噴施接種，生防菌接種5 d后，葉部噴霧接種燕麥德氏霉孢子懸浮液（1×105孢子/mL），均勻噴施，直至燕麥全株濕潤(rùn)，隨后進(jìn)行保濕處理，分別于病原菌接種處理后3和5 d對(duì)燕麥葉斑病發(fā)病情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算出各處理組的病害嚴(yán)重度。參考前期燕麥葉斑病病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行病害調(diào)查統(tǒng)計(jì)。具體病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0 級(jí)，無病斑；1 級(jí)，病斑面積占整片葉面積的 1%～10%；2 級(jí)，軟病斑面積占整片葉面積的11%～25%；3 級(jí)，病斑面積占整片葉面積的25%～50%；4 級(jí)，病斑面積占整片葉面積的51%以上。病情指數(shù)＝［∑（病級(jí)數(shù)×該病級(jí)植株數(shù)）/（最高病級(jí)×總植株數(shù)）］×100。

1.11 田間試驗(yàn)

試驗(yàn)地在青海省西寧市湟源縣（101°25643′ E，36°68243′ N，海拔高度2753 m）燕麥種植基地開展。選擇合適田塊設(shè)置生防細(xì)菌處理、清水對(duì)照，每個(gè)處理 4 次重復(fù)，每個(gè)小區(qū)面積 1畝。按前期菌液制作方法配制生防菌菌懸液，播種當(dāng)天用 5×107CFU/mL菌懸液20 mL浸種處理 5 min，待出苗后用1×107CFU/mL菌懸液進(jìn)行地上部噴霧處理，每株苗噴霧20 mL。30 d后做同樣處理?？瞻讓?duì)照不進(jìn)行浸種，其他方面與生防菌處理相同，將菌懸液調(diào)換成清水，田間管理措施相同。于播種后60 d對(duì)燕麥生長(zhǎng)指標(biāo)（葉綠素、麥苗株高、鮮重、干重）及發(fā)病情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，調(diào)查病害發(fā)病率并計(jì)算生防效果。采收期對(duì)各處理組的產(chǎn)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算出增產(chǎn)效果。

1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌的分離、篩選及鑒定

本研究共計(jì)分離獲得生防菌株280株。通過平板拮抗試驗(yàn)（圖1），最終篩選獲得一株高效生防菌株Qh-618。結(jié)果顯示，菌株Qh-618對(duì)多種真菌德氏霉菌、鐮刀菌、灰霉菌、赤霉病菌、蔓枯病菌都具有強(qiáng)的拮抗效果，抑制率分別為61.7%、39.7%、69.7%、45.5%、62.1%。孢子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株Qh-618處理能夠顯著抑制燕麥德氏霉菌的孢子萌發(fā)（圖2），處理18 h后，對(duì)燕麥德氏霉菌的孢子萌發(fā)抑制率達(dá)63.5%。通過生理生化測(cè)定試驗(yàn)及16S rDNA測(cè)序，初步鑒定其為枯草芽胞桿菌B.subtilis（表1，圖3），進(jìn)一步對(duì)gyrB基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株Qh-618與枯草芽胞桿菌模式菌株聚在同一簇上（圖3），綜合上述結(jié)果，最終鑒定菌株Qh-618為芽胞桿菌屬枯草芽胞桿菌。

圖1 生防菌Qh-618對(duì)多種病原真菌平板拮抗效果Fig.1 Antagonistic effect of Qh-618 on a variety of pathogenic fungi

圖2 生防菌Qh-618對(duì)燕麥德氏霉菌孢子萌發(fā)的影響Fig.2 Effect of Qh-618 on spore germination of D.avenae

表1 生防菌株Qh-618生理生化反應(yīng)Table 1 The physiological and biochemical reaction of bacterial strain Qh-618

2.2 生防菌Qh-618對(duì)多種病原真菌的影響

平板對(duì)峙與燕麥種子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果表明，生防菌株Qh-618對(duì)5種病原真菌抑菌率達(dá)61.17%～83.76%（表2）。此外，與清水對(duì)照相比，Qh-618能夠顯著提升燕麥種子的發(fā)芽，發(fā)芽率提升分別為7.4%～18%。以上結(jié)果表明，生防菌株Qh-618具有廣譜抑菌活性。此外，研究發(fā)現(xiàn)生防菌株Qh-618具有較強(qiáng)的蛋白酶、多聚半乳糖醛酸酶、嗜鐵素霉、產(chǎn)吲哚乙酸等活性（圖4）綜合上述結(jié)果顯示，生防菌株Qh-618具有較強(qiáng)的生防潛力。

2.3 生防菌Qh-618對(duì)燕麥葉斑病盆栽防治效果

溫室盆栽結(jié)果顯示，清水對(duì)照組的燕麥于病原菌接種后3 d，燕麥葉斑病病情指數(shù)達(dá)69，接種5 d后，病情指數(shù)達(dá)85；生防菌Qh-618處理組的燕麥病情指數(shù)分別為35和52，防治效果分別為49.3%和38.8%（表3）。以上結(jié)果表明，生防菌Qh-618對(duì)燕麥葉斑病具有顯著的防治效果。

表3 生防菌Qh-618對(duì)燕麥德氏霉菌的溫室防治效果Table 3 The Biocontrol effect of Qh-618 on D.avenae in greenhouse

2.4 生防菌Qh-618對(duì)燕麥溫室促生效果

經(jīng)生防菌Qh-618處理5 d的燕麥苗葉綠素含量、根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)、根鮮重、根干重、苗鮮重以及苗干重均顯著高于清水對(duì)照組（表4）。其中根長(zhǎng)與鮮重的增加最為顯著，促生效果達(dá)50%以上。與清水對(duì)照相比，生防菌Qh-618處理10 d后燕麥根鮮重、苗鮮重增加顯著，各增長(zhǎng)率達(dá)15.6%～55.1%，對(duì)燕麥根長(zhǎng)、根干重與苗干重的促生效果最為顯著，分別為69.1%、59.6%和50%（表4）。以上結(jié)果表明，生防菌Qh-618對(duì)燕麥的生長(zhǎng)促生效果顯著。

2.5 生防菌Qh-618對(duì)燕麥田間應(yīng)用效果

田間試驗(yàn)結(jié)果表明，生防菌Qh-618處理組燕麥的葉綠素含量、株高、鮮重、干重均顯著高于對(duì)照組。采收期對(duì)各處理燕麥產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)的結(jié)果顯示，Qh-618處理組畝產(chǎn)量達(dá) 226.3 kg，顯著高于對(duì)照組畝產(chǎn)量203.6 kg（表5）；生防菌Qh-618處理組燕麥葉斑病的病情指數(shù)12.56，對(duì)照組病情指數(shù)30.32，防治效果達(dá)58.57%（表5）。

3 討論

近年來，燕麥葉斑病危害日趨嚴(yán)重，成為燕麥生產(chǎn)中主要病害，在全世界大多數(shù)燕麥主產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生[10,11]。利用生防菌防治燕麥病害，不僅能直接抑制燕麥德氏霉菌菌絲的生長(zhǎng)、侵入及擴(kuò)展，還可以促進(jìn)燕麥生長(zhǎng)、提升其免疫力，進(jìn)而減輕病害發(fā)生所帶來的產(chǎn)量及品質(zhì)的下降。

據(jù)中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)（http://www.chinapesticide.org.cn/）數(shù)據(jù)顯示，迄今為止，我國(guó)已登記的生物農(nóng)藥有效成分已逾50種，產(chǎn)品數(shù)量已超千余種[23]，但還沒有以燕麥為對(duì)象登記的生物農(nóng)藥。本研究篩選獲得的生防菌株Qh-618是從青海燕麥葉斑病發(fā)生生境中分離獲得的，對(duì)燕麥病害防治潛力較大，尤其對(duì)燕麥葉斑病具有顯著防治效果。經(jīng)生理生化測(cè)定試驗(yàn)及測(cè)序鑒定，生防菌株Qh-618屬于枯草芽胞桿菌。前期研究表明，枯草芽胞桿菌作為一種有高效的生防細(xì)菌具有廣泛的應(yīng)用前景，目前也有一些優(yōu)勢(shì)菌株作為生物農(nóng)藥投入到作物生產(chǎn)過程中，其中包括黃瓜、草莓、西瓜、葡萄、辣椒、番茄、水稻、小麥、玉米、棉花等作物，對(duì)相應(yīng)的病害防治效果顯著[24]。但在燕麥病害的生物防治過程中，針對(duì)枯草芽胞桿菌報(bào)道較少，相關(guān)生防產(chǎn)品尚屬空白，本研究為燕麥病害生物防治及生物農(nóng)藥開發(fā)提供重要的資源。

生防菌防治植物病害的作用機(jī)制主要通過產(chǎn)生抑菌物質(zhì)、競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、搶占生態(tài)位點(diǎn)以及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等手段[25-27]。生防芽胞桿菌能夠產(chǎn)生脂肽類抗生素（伊枯草菌素（Iturin）家族、表面活性素（Surfactin）和泛革素（Fengycin A、B）等）和拮抗蛋白兩類拮抗因子，對(duì)病原菌有抗生作用[25]。芽胞桿菌的競(jìng)爭(zhēng)作用包括營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)和空間位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)，而且以空間位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)為主，在植物根圍形成致密的生物膜能提高芽胞桿菌在宿主體內(nèi)的定殖力，并且對(duì)植物防御病原物的侵染有重要作用。Chen等[29]發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌3610菌株在番茄根部形成致密的生物膜，提高其在番茄根圍的定殖能力，通過構(gòu)建生物膜的減弱和增強(qiáng)突變體，并檢測(cè)突變體對(duì)青枯病菌Ralstorinia solanacearum的生防能力發(fā)現(xiàn)，枯草芽胞桿菌3610生物膜的形成能力與生防效果正相關(guān)。Niu等[30]研究發(fā)現(xiàn)，利用蠟質(zhì)芽胞桿菌AR156噴施擬南芥，可誘導(dǎo)植株體內(nèi)防御相關(guān)基因的表達(dá)，提高植物系統(tǒng)抗性，保護(hù)植物免受病原菌入侵。為初步探究菌株 Qh-618對(duì)燕麥德氏霉菌的防病機(jī)制，本研究也對(duì)生防菌防治燕麥病害生防機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌Qh-618處理能夠顯著抑制燕麥德氏霉菌的孢子萌發(fā)（圖2）；平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果顯示，枯草芽胞桿菌Qh-618對(duì)多種病原真菌都具有顯著的抑制效果，其中包括德氏霉菌屬Drechslera sp.、鐮刀菌屬Fusarium sp.、灰霉菌屬Botrytis sp.、赤霉病菌Gibberella sp.、蔓枯病菌Ascochyta sp.（圖1）。上述結(jié)果表明，生防菌株Qh-618對(duì)真菌病害防治譜較廣，且抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生可能是枯草芽胞桿菌Qh-618生物防治作用主要機(jī)理之一，但枯草芽胞桿菌 Qh-618的抑菌活性物質(zhì)尚需進(jìn)一步分離鑒定，具體的抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生機(jī)制也仍需深入研究與探討。另外，枯草芽胞桿菌Qh-618是否存在誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性作用，有待進(jìn)一步研究[30-32]。

溫室試驗(yàn)及田間試驗(yàn)結(jié)果顯示，枯草芽胞桿菌 Qh-618對(duì)燕麥葉斑病的防治效果顯著，對(duì)燕麥生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用（表 2、3）。但生防菌的生防效果易受土壤溫濕度、pH、作物生長(zhǎng)狀況及土壤中生態(tài)系統(tǒng)等微環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致防治效果不穩(wěn)定，極大限制生防芽胞桿菌的大面積推廣應(yīng)用[16,33]。盡管生防菌枯草芽胞桿菌 Qh-618在燕麥上表現(xiàn)出較好的防病和增產(chǎn)效果，但研究人員仍舊需要綜合考慮防治對(duì)象的發(fā)病規(guī)律、栽培技術(shù)、土壤特性、使用成本及微生物菌劑的產(chǎn)品特性，開發(fā)出簡(jiǎn)單實(shí)用的田間應(yīng)用技術(shù)，使該菌劑的田間防效更加穩(wěn)定。此外，該菌劑使用后對(duì)土壤微生物群落、理化性質(zhì)、土壤酶活性的影響方面在未來也有待進(jìn)一步研究。上述問題的解析，也將更好地為枯草芽胞桿菌 Qh-618相關(guān)生防產(chǎn)品開發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。