尚叢珊，孟婷婷，侯亞妮，李元，劉利兵

西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院，陜西西安710125

病原體感染是引起兒童急性腹瀉和重癥腹瀉的主要原因，如輪狀病毒（rotavirus，RV）［1］、諾如病毒（Norovirus，NoV）［2］、人星狀病毒（human astrovirus，HAstV）［3］、札如病毒（Sap virus，SaV）［4］、腺病毒（adenoviruses，AdV）［5］等，其中 RV 是引起成人及兒童腹瀉的常見病毒。RV 是一種RNA 病毒，基因組為雙鏈RNA，由11 段基因組成，分別編碼6 種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1 ~ 4、VP6 和 VP7）和 6 種非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP1 ~ 6）［6-7］。根據(jù) VP6 抗原蛋白結(jié)構(gòu)不同，可分為 A~J 共 9 個(gè)群，只有 A、B 和 C 群 RV 可感染人類，且在人和動(dòng)物中均有發(fā)現(xiàn)，A 群RV 一般不感染成人，但其是感染嬰幼兒的主要病原體［8-9］，目前尚無特效藥。

RV 診斷常用的檢測(cè)方法主要有電鏡觀察、ELISA 法、膠體金法、核酸雜交法及實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（RT-qPCR）法等［10］。微滴數(shù)字 PCR（RT-ddPCR）法不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，屬于終點(diǎn)檢測(cè)，不受擴(kuò)增循環(huán)閾值的影響，定量結(jié)果更精確，對(duì)PCR 抑制劑更耐受，在改善定量分析準(zhǔn)確性和變異性上有較大優(yōu)勢(shì)［11-12］。目前PCR 檢測(cè)RV 體系主要以VP6、VP7 及NSP3 基因作為毒株的靶標(biāo)，但在RT-ddPCR 檢測(cè)體系的應(yīng)用鮮見報(bào)道。非結(jié)構(gòu)蛋白NSP5 為重要的胞質(zhì)磷蛋白，RV 感染細(xì)胞后，NSP5 在胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)并參與形成病毒池結(jié)構(gòu)，調(diào)控RV 的復(fù)制和包裝，NSP5 基因相對(duì)其他基因段具有高度保守的氨基酸序列［13-14］。因此，本研究建立一種基于NSP5 基因A組RV 的RT-ddPCR 檢測(cè)方法，以期用于RV 的臨床快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 樣本 臨床樣本來源于西安市兒童醫(yī)院2018—2019 年門診病例中5 歲以下腹瀉患兒的糞便標(biāo)本，共150 份（膠體金檢測(cè)RV 陽性98 份，陰性52 份，陽性率為65.3%）。

1.2 細(xì)胞、質(zhì)粒及病毒 MA104 細(xì)胞及質(zhì)粒pEGFP-N2購自寶生物工程（大連）有限公司；A 組RV 由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室從陽性糞便樣本中分離、鑒定和保存，NoV（基因型 GⅠ）、Adv（基因型 F4l 型）、HAstV（HAstV-1 型）及 SaV（GⅠ基因型）由該實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 主要試劑及儀器 Trizol 提取試劑及Super-Script?Ⅲ Platinum?One-Step Quantitative RT-PCR System 購自美國(guó) Invitrogen 公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit 購自德國(guó) QIAGEN 公司；Dynabeads ?mRNA Purification Kit 購自美國(guó) Life Technology 公司；7900-HT Fast 實(shí)時(shí)熒光 PCR 儀購自美國(guó)ABI 公司；一步法 RT-ddPCR 試劑盒、QX200 Droplet Digital PCR System 購自美國(guó)BIO-RAD 公司。

1.4 引物與探針的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank 中登錄的A 組人RV 毒株NSP5 基因序列（KJ748475.1），應(yīng)用MEGA3.1 軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，選擇NSP5 高度保守基因區(qū)域，通過軟件Primer 5.0 設(shè)計(jì)引物和探針，上游引物 NSP5-F：5′-AAGACAAATGCAGACGCTGG-3′，下游引物 NSP5-R：5′-TGATGGTCGTGATTGCGTTG-3′，熒光探針 NSP5-P：5′-FAM-TCTGATTCTGCTTCAAACGATCCA-BHQ-3′。引物及探針均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備 用PBS 將1 份陽性糞便樣本稀釋為 10%懸液，2 634 ×g離心 10 min，保留上清液，按mRNA Purification Kit 說明書提取RV 的RNA，根據(jù) ISO 指南 35：2006［15］要求，制備 RV 的RNA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，確定該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值為（4.9 ±1.3）× 107copies ／ μL，-80 ℃保存。

1.6 方法的建立 將提取RV 的RNA 模板或RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)按RT-ddPCR 試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，共 20 μL（包含引物、探針、RV 的 RNA 模板），并生成微滴，加入96 孔板中，進(jìn)行RT-ddPCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：60 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)；退火 1 min，共 40 個(gè)循環(huán)；98 ℃ 10 min；4 ℃保持，反應(yīng)溫度升降速率<2.5 ℃／s。反應(yīng)結(jié)束后將96 孔板放入QX200 Droplet Digital PCR system，儀器自動(dòng)采集熒光信號(hào)，采用軟件Quanta Soft 讀取RNA 的 copies。

1.7 方法的優(yōu)化

1.7.1 RT-ddPCR 的退火溫度 按1.6 項(xiàng)方法檢測(cè)RNA 核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，退火溫度分別設(shè)為55.1、56.0、57.2、58.1、58.9、59.9、61.0、62.1、63.2、64.1、64.9 ℃，引物濃度為 100 nmol ／ L，探針濃度為60 nmol ／ L。試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。導(dǎo)出各溫度下微滴數(shù)數(shù)據(jù)，應(yīng)用Excel 軟件繪制直方圖，進(jìn)一步驗(yàn)證退火溫度可靠性。

1.7.2 RT-ddPCR 的引物及探針濃度 按1.6 項(xiàng)方法檢測(cè)RNA 核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，退火溫度為61.0 ℃，引物濃度分別設(shè)為 40、60、100、120 nmol ／ L，探針濃度分別設(shè)為 60、70、80、90、100 nmol ／ L，采用矩陣法篩選引物和探針的最佳濃度。

1.8 方法的驗(yàn)證

1.8.1 引物及探針特異性 按1.5 項(xiàng)方法提取RV、NoV、HAstV、Adv 及 SaV 的 RNA，采用優(yōu)化的 RT-ddPCR法進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證引物及探針的特異性。

1.8.2 線性范圍 將RNA 核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行102、103、104、105、5 × 105、106、5 × 106、107梯度稀釋，每個(gè)稀釋倍數(shù)的理論濃度分別為490 000、49 000、4 900、490、245、49、24.5 及 4.9 copies ／ μL，采用優(yōu)化的RT-ddPCR 法進(jìn)行檢測(cè)。以理論值為橫坐標(biāo)，檢測(cè)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè)，引物和探針序列同1.4 項(xiàng)，反應(yīng)條件為：50 ℃ 60 min; 95 ℃ 15 min；95 ℃ 15 s，共 40 個(gè)循環(huán)；55 ~ 65 ℃ 1 min，共 40 個(gè)循環(huán)；98 ℃，10 min；4 ℃ 保持。以檢測(cè)值為橫坐標(biāo)，理論值對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8.3 靈敏性及重復(fù)性 將RNA 核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行 102、103、104、105、5 × 105、106、5 × 106、107、5 ×107梯度稀釋，每個(gè)稀釋倍數(shù)的理論濃度分別為490 000、49 000、4 900、490、245、49、24.5、4.9 及2.45 copies ／ μL，采用優(yōu)化的 RT-ddPCR 及 RT-qPCR（同1.8.2 項(xiàng)）法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)稀釋濃度重復(fù)檢測(cè)4 次，計(jì)算各梯度檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.9 方法的初步應(yīng)用 按1.4 項(xiàng)方法提取2018 —2019 年收集的150 份腹瀉患兒的糞便樣本的RNA，分別采用優(yōu)化的RT-ddPCR 法及RT-qPCR 法（同1.8.2 項(xiàng)）進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 方法的優(yōu)化

2.1.1 最適RT-ddPCR 退火溫度 退火溫度在55 ~65 ℃區(qū)間內(nèi)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)拷貝數(shù)的平均值分別為260、250、245、245、260、263、289、280、261、268 及260 copies ／ μL，陽性及陰性微滴可顯著分成兩簇。溫度為61.0 及62.1℃時(shí)，陽性與陰性微滴兩簇中間彌散微滴數(shù)目較少，表明擴(kuò)增結(jié)果良好；退火溫度為61.0 ℃時(shí)拷貝數(shù)最高，即61.0 ℃時(shí)擴(kuò)增結(jié)果優(yōu)于62.1 ℃。退火溫度 < 59.9 及 > 63.0 ℃時(shí)，陽性和陰性微滴兩簇中間彌散微滴數(shù)目較多，擴(kuò)增結(jié)果較差。見圖1。因此確定最佳的退火溫度為61.0 ℃。61.0 ℃時(shí) RT-ddPCR 檢測(cè) RV 直方圖中，兩個(gè)峰（陽性峰和陰性峰）顯著分開中間無干擾，微滴數(shù)量及質(zhì)量較好，表明RT-ddPCR 在該退火溫度下檢測(cè)RV 病毒數(shù)量可靠性較高。見圖2。

圖1 退火溫度對(duì)RT-ddPCR 檢測(cè)結(jié)果的影響Fig.1 Effect of annealing temperature on detection result by RT-ddPCR

圖2 不同退火溫度RT-ddPCR 法檢測(cè)RV 的直方圖Fig.2 Histograms of RV detection by RT-ddPCR at various annealing temperatures

2.1.2 最適RT-ddPCR 的引物及探針濃度 引物及探針濃度分別為 100 和 60 nmol ／ L 時(shí)，陽性熒光信號(hào)最強(qiáng)、陰性液滴熒光與陽性液滴熒光可顯著分開，且陽性液滴生成的數(shù)量最高，見圖3。因此，確定最佳引物及探針濃度分別為100 和60 nmol ／ L。

圖3 不同引物及探針濃度對(duì)RT-ddPCR 檢測(cè)結(jié)果的影響Fig.3 Effect of primer and probe concentrations on detection result by RT-ddPCR

2.2 方法的驗(yàn)證

2.2.1 引物及探針特異性 RV 檢測(cè)有陽性微滴生成，其他4 種病毒均無陽性液滴生成，且RV 陽性微滴簇與陰性微滴簇可顯著分開，微滴簇之間彌散微滴較少，見圖4。表明設(shè)計(jì)的引物及探針特異性良好。

圖4 引物和探針特異性的驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 Verification for specificity of primer and probe

2.2.2 線性范圍 RNA 核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)理論拷貝數(shù)過大（490 000 copies／μL）時(shí)，RT-ddPCR 法無法檢出，但RT-qPCR 可檢出；當(dāng)理論拷貝數(shù)為4.9 copies／μL時(shí)，兩種方法均可檢出，理論值與檢測(cè)值基本保持一致。RT-ddPCR 及RT-qPCR 法分別在4.95 ~49 000 即 4.95~490 000 copies ／μL 范圍內(nèi)，與檢測(cè)值呈良好的線性關(guān)系；線性方程分別為y=1.100 0x-44.257 0 和y= 0.185 4x- 0.112 2，R2分別為1.000 0 和 0.997 2，見圖 5。表明 RT-qPCR 法比 RT-ddPCR 法的檢測(cè)范圍廣。

圖5 A 群 RV RT-ddPCR（A）和RT-qPCR（B）檢測(cè)方法的線性關(guān)系Fig.5 Linear relationship of RT-ddPCR（A）and RT-qPCR（B）for detection of groups A RV

2.2.3 靈敏性及重復(fù)性 RNA 核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)理論拷貝數(shù)過大（490 000 copies ／ μL）時(shí)，RT-ddPCR 法無法檢出；RT-qPCR 可檢出，RSD為 4.68，但Ct過低，為12.15；當(dāng)拷理論貝數(shù)達(dá) 4.9 copies／μL 時(shí)，RT-ddPCR法的RSD略高于 RT-qPCR 法，但 RT-qPCR 的Ct過大，表明此時(shí)RT-qPCR 法擴(kuò)增效率可能較低；其他濃度兩種方法檢測(cè)的RSD分別為1.75% ~ 5.24%和0.34% ~ 4.68%。兩種方法最低檢測(cè)稀釋倍數(shù)均為 5 × 107，即檢測(cè)最低拷貝數(shù)為 2.45 copies ／ μL。見圖 6、表 1 和表 2。

圖6 不同稀釋濃度對(duì)RT-ddPCR 檢測(cè)結(jié)果的影響Fig.6 Effect of dilution factor on detection result by RT-ddPCR

表1 A 群RV RT-ddPCR 檢測(cè)法的靈敏性和重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果Tab.1 Verification for reproducibility and sensitivity of RT-ddPCR for detection of group A RV

表2 A 群RV RT-qPCR 檢測(cè)法的靈敏性和重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果Tab.2 Verification for reproducibility and sensitivity of RT-qPCR for detection of group A RV

2.3 方法的初步應(yīng)用 RT-ddPCR 和RT-qPCR 法檢測(cè)150 份腹瀉患兒的糞便樣本，98 份為RV 陽性，52 份陰性，與膠體金檢測(cè)結(jié)果一致，兩種方法的符合率100%。表明RT-ddPCR 法可用于RV 的臨床快速檢測(cè)。

3 討 論

VP6、VP7 及NSP3 基因序列是目前用來建立PCR 檢測(cè)方法常用的靶標(biāo)［16-17］，VP6 基因序列保守，但也有突變的發(fā)生。NSP3 體系建立的引物與探針對(duì)于某些物種RV（如鼠）NSP3 基因序列一致性較低［17］。MAES 等［18］研究表明，A 組 RV 中，H 基因型的 NSP5基因序列在不同物種的RV 中同源性（＞91%）高于其他基因分型。曾淵君等［17］研究比較了常見RV 不同基因型的NSP5 基因序列，其一致性高于NSP3，達(dá)83.70%，表明NSP5 相對(duì)于NSP3 更為保守，可成為建立A 組RV 檢測(cè)體系中理想靶標(biāo)。因此本研究基于A 組RV NSP5 基因序列設(shè)計(jì)了1 組引物和探針，建立了RT-ddPCR 檢測(cè)方法，檢測(cè)引起兒童腹瀉相關(guān)病毒，包括 NoV、AdV、RV、HAstV 及 SaV，結(jié)果表明，該組引物及探針具有較強(qiáng)的特異性（100%）。RT-ddPCR是PCR 技術(shù)中的一種，將20 μL 的模板采用油包水的方式分割成20 000 個(gè)小液滴，每個(gè)小液滴在PCR中反應(yīng)后，逐一通過檢測(cè)器，根據(jù)陽性與陰性微滴的比例可直接計(jì)算目標(biāo)分子的拷貝數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的絕對(duì)定量［19-20］。相對(duì) RT-qPCR 法，RT-ddPCR法無需核酸標(biāo)準(zhǔn)品，也不需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，可直接絕對(duì)定量，同時(shí)又具有RT-qPCR 的優(yōu)點(diǎn)。CAVE等［21］在檢測(cè) RT-ddPCR 和 RT-qPCR 的靈敏度時(shí)發(fā)現(xiàn)，RT-ddPCR 靈敏度是 RT-qPCR 的 100 倍，檢測(cè)限可達(dá) 2.45 copies ／ μL。但 RT-ddPCR 檢測(cè)上限不如RT-qPCR 可靠，需要對(duì)高濃度的目標(biāo)分子稀釋到一定拷貝數(shù)以下［22］。這是由于兩種檢測(cè)方式對(duì)熒光信號(hào)的閱讀過程不同造成的，RT-ddPCR 是對(duì)反應(yīng)終點(diǎn)的微滴中熒光信號(hào)進(jìn)行閱讀，而RT-qPCR 是實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化，兩種檢測(cè)方法原理相同。

本研究對(duì)RT-ddPCR 的退火溫度及探針、引物濃度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，最適退火溫度為61.0 ℃，最佳引物及探針濃度分別為100 和60 nmol ／ L。本研究方法驗(yàn)證結(jié)果表明，RNA 核算標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)理論拷貝數(shù)過大（490 000 copies ／μL）時(shí)，RT-ddPCR 法無法檢出，但 RT-qPCR 可檢出；當(dāng)拷貝數(shù)為 4.9 copies ／ μL時(shí)，兩種方法均可檢出，理論值與檢測(cè)值基本保持一致。RT-ddPCR 及RT-qPCR 法分別在4.95~49 000即 4.95 ~ 490 000 copies ／ μL 范圍內(nèi)，與檢測(cè)值呈良好的線性關(guān)系，線性方程分別為y= 1.100 0x-44.257 0 和y=0.185 4x-0.112 2，R2分別為 1.000 0和0.997 2。RT-ddPCR 的線性相關(guān)系數(shù)比RT-qPCR略優(yōu)，但RSD比RT-qPCR 略高，表明其重復(fù)性比RT-qPCR 略差。ZHAO 等［23］通過 RT-ddPCR 和 RT-qPCR法檢測(cè)副痘病毒的結(jié)果與本研究基本一致。YANG等［24］對(duì) RT-ddPCR 和 RT-qPCR 檢測(cè)性能進(jìn)行研究，結(jié)果表明，RT-ddPCR 在檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確率方面略高于RT-qPCR 法，而穩(wěn)定性和重復(fù)性比RT-qPCR法略差，兩種方法采用不同的引物和探針，可影響研究結(jié)果。另有研究表明，在檢測(cè)艾滋病病毒時(shí)，RT-qPCR 的線性關(guān)系、靈敏度和準(zhǔn)確性均優(yōu)于RT-ddPCR 法［25］。采用 RT-ddPCR 和 RT-qPCR 法檢測(cè)150 份腹瀉患兒的糞便樣本中，98 份為RV 陽性，52份陰性，與膠體金檢測(cè)結(jié)果一致，兩種方法的符合率100%。

綜上所述，本研究建立并優(yōu)化了RV 的RT-ddPCR檢測(cè)方法，該方法具有良好的特異性及精密性，與RT-qPCR 法符合率為100%，可用于RV 的臨床快速檢測(cè)。