劉建兵 ，李文龍 ，蔡芳芳 ，崔小華 ，郝建卿 ，師如意 ，林曉雨 ，李莉

1.山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學細胞生物與遺傳學教研室，山西太原030001；2.山西醫(yī)科大學細胞生理學教育部重點實驗室，山西太原030001；3.山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，山西太原030001

生物信息學是由生物學和計算機科學組成的一門新的交叉學科。該學科研究開發(fā)的生物信息學軟件可用來分析核酸的序列信息以及蛋白的理化性質、空間結構等。

胎盤特異蛋白8（placenta-specific protein 8，PLAC8）是在人樹突狀細胞中最先被發(fā)現(xiàn)［1］，由于其功能尚未被鑒定，也曾被叫作ONZIN。GALAVIZHERNANDEZ 等［2］應用多種實驗方法研究發(fā)現(xiàn)，ONZIN 在小鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞中特異表達，進一步通過cDNA 克隆技術以及基因組序列比對后，將ONZIN 更名為PLAC8。在人胎盤的研究中，PLAC8僅在母胎界面的間質絨毛滋養(yǎng)層細胞（interstitalextravillous trophoblast cells，iEVTs）中特異性表達，并可促進絨毛膜外滋養(yǎng)層細胞（extravillous trophoblast cells，EVTs）的遷移和侵襲行為［3］。此外，在骨髓、淋巴樣細胞、肺和腸的上皮細胞中，一些學者也觀察到PLAC8 的表達［4］，并且 PLAC8 可促進腫瘤細胞的增殖、侵襲等細胞行為，參與腫瘤的發(fā)展，如肺癌［5］、前列腺癌［6］和肝癌［7］等。由此可見，PLAC8 參與了細胞行為的調控，特別是胎盤發(fā)育中滋養(yǎng)細胞功能的調節(jié)，并且與疾病的發(fā)生發(fā)展有關。但目前對PLAC8的研究較少，其功能及作用機制并不完全清楚。因此，本研究應用多種生物信息學軟件對人PLAC8 的理化性質、結構、功能及蛋白相互作用等進行分析，為進一步研究PLAC8 的功能及其作用機制提供新的思路和方向，以期促進相關疾病的深入研究。

1 材料與方法

1.1 PLAC8 序列 在 National Center for Biotechnology Information（NCBI）［8］網(wǎng)站（https：／ ／ www.ncbi.nlm.nih.gov ／ protein ／ AAH12205.1）獲得 PLAC8 的氨基酸序列信息，GenBank 登錄號：AAH12205.1。

1.2 PLAC8 理化性質分析 通過ProtParam 和Protscale 軟件［9］分別進行 PLAC8 理化性質及親疏水性分析。蛋白親疏水性由親水區(qū)和疏水區(qū)面積大小決定。

1.3 PLAC8 的信號肽結構分析 通過SignalP 4.1 Server［10］進行 PLAC8 信號肽結構分析。 判斷標準：S 平均值是否高于0.500；C 值用來尋找剪切位點；Y值為綜合S 和C 值之后的一個評價標準。

1.4 PLAC8 的跨膜結構分析 通過TMHMM Server v.2.0［11］進行 PLAC8 跨膜區(qū)域分析。

1.5 PLAC8 亞細胞定位分析 通過 PSORTⅡ［11］進行PLAC8 亞細胞定位分析。

1.6 PLAC8 二級結構和結構域分析 通過SOPMA軟件［12］進行PLAC8 二級結構分析；通過Conserved Domain 數(shù)據(jù)庫進行PLAC8 結構域分析。

1.7 PLAC8 蛋白翻譯后位點修飾分析 通過NetNGlyc 1.0 Sever［13］對 PLAC8 的 N-糖基化位點進行分析；通過 YinOYang 1.2 Server［14］對 PLAC8 的 O-糖基化位點進行分析；通過Netphos 2.0 Server 工具［15］對PLAC8 的磷酸化位點進行分析。

1.8 PLAC8 相互作用蛋白預測 通過STRING 數(shù)據(jù)庫［16］尋找與PLAC8 相互作用的蛋白并構建蛋白互作網(wǎng)絡，設置為高置信度0.9，數(shù)量少于10。

1.9 PLAC8 系統(tǒng)進化樹構建 從NCBI 數(shù)據(jù)庫中獲取人、黑猩猩、鼠、羊、野豬、壁虎、家貓、獼猴和家兔的 PLAC8 序列。通過 MEGA-X 軟件［17］進行序列比對和建樹，序列比對選擇Align by ClustalW，進化樹構建選擇鄰近法。

2 結 果

2.1 PLAC8 的理化性質 ProtParam 軟件分析結果顯示，PLAC8 相對分子質量為12 440.52，分子式為 C524H832N154O157S22，理論等電點（PI）= 7.34。組成PLAC8 的氨基酸有20 種，其中含量最高的為半胱氨酸（13.9%），含量最少的分別為色氨酸、谷氨酸、賴氨酸和組氨酸，僅0.9%，見圖1。PLAC8 的不穩(wěn)定指數(shù)為38.99；親水性平均總值為0.125，脂肪指數(shù)為57.65。

圖1 PLAC8 的氨基酸組成分析Fig.1 Analysis of amino acid composition of PLAC8

ProtScale 軟件分析結果顯示，PLAC8 整體的親水性區(qū)大于疏水性區(qū)。其中，疏水性最大的為第43位甘氨酸，分值為2.222；親水性最大的為第107 位酪氨酸，分值為-2.533，見圖2。

圖2 PLAC8 的親疏水性分析Fig.2 Hydrophilic-hydrophobic analysis of PLAC8

2.2 PLAC8 的信號肽結構 SignalP 4.1 Server 分析結果顯示，C 和Y 的最大值均是位于第52 位的半胱氨酸，分值分別為0.128 和0.157；S 的最大值是位于第45 位的苯丙氨酸，分值為0.274。此外，第1 ~ 51 位氨基酸的 S 和 D 的均值均為 0.156。S 的平均值小于0.5，因此，PLAC8 不具有信號肽序列，也不是經(jīng)典的分泌型蛋白。見圖3。

圖3 PLAC8 的信號肽分析Fig.3 Analysis of signal peptides of PLAC8

2.3 PLAC8 的跨膜結構 TMHMM Server 2.0 分析結果顯示，PLAC8 有115 個氨基酸序列，均位于膜內區(qū)，可知為胞內蛋白，不具有跨膜區(qū)，見圖4。

圖4 PLAC8 跨膜結構分析Fig.4 Analysis of trans-membrane domain of PLAC8

2.4 PLAC8 的亞細胞定位 PSORTⅡ分析結果顯示，PLAC8 定位于不同細胞器的可能性分別為細胞外基質（44.4%）、細胞質（33.3%）、液泡（11.1%）和細胞核（11.1%）。

2.5 PLAC8 二級結構和高級結構 SOPMA 軟件分析結果顯示，PLAC8 由47%的α 螺旋、15%的延伸鏈、10%的β 轉角和43%的無規(guī)則卷曲組成，見圖5。其中，延伸鏈即氨基酸組成的肽鏈，α 螺旋和β 轉角為蛋白質常見的二級結構。α 螺旋指多肽鏈主鏈圍繞中心軸呈有規(guī)律的螺旋式上升，β 轉角是簡單的非重復性結構。Conserved Domain 數(shù)據(jù)庫分析結果顯示，PLAC8 為PLAC8 超家族成員，該結構域由77個氨基酸殘基組成，見圖6。

圖5 PLAC8 的二級結構分析Fig.5 Analysis of secondary structure of PLAC8

圖6 PLAC8 的功能結構域分析Fig.6 Analysis of functional domain of PLAC8

2.6 PLAC8 翻譯后位點修飾 NetNGlyc 1.0 Sever、YinOYang 1.2 Server 和 Netphos 2.0 Server 預測分析結果顯示，PLAC8 不存在N-糖基化位點；O-糖基化位點分別位于第11、98 和114 位的蘇氨酸以及第24 和105 位的絲氨酸位點；磷酸化位點分別位于第83 和105 位的絲氨酸位點、第72 位的蘇氨酸位點以及第78 和88 位的酪氨酸位點。

2.7 PLAC8 的相互作用蛋白 STRING 數(shù)據(jù)庫檢索結果顯示，構成PLAC8 蛋白相互作用網(wǎng)絡的蛋白有10 個，分別為中性粒細胞彈性蛋白酶（elastase，neutrophil expressed，ELANE；score：0.913）、組蛋白酶 G（cathepsin G，CTSG；score：0.913）、組蛋白酶（cathepsin G，CTSC；score：0.910）、細胞凋亡相關斑點樣蛋白（PYD and CARD domain containing，PYCARD；score：0.910）、溶菌酶（lysozyme，LYZ；score：0.908）、人髓細胞核分化抗原（myeloid cell nuclear differentiation antigen，MNDA；score：0.907）、unc-13 同系物D（unc-13 homolog D，UNC13D；score：0.906）、補體C3（complement C3，C3；score：0.906）、核糖核酸酶家族成員 2（ribonuclease A family member 2，RNASE2；score：0.906）、絲裂原活化蛋白激酶 1（mitogenactivated protein kinase 1，MAPK1；score：0.905）。見圖 7。

圖7 PLAC8 的蛋白相互作用網(wǎng)絡Fig.7 Protein-protein interaction network of PLAC8

2.8 PLAC8 多重序列比對和進化關系 MEGA-X軟件構建的進化樹顯示，人PLAC8 蛋白序列與黑猩猩相似度最高，與家兔相似度最低。表明在物種進化過程中，PLAC8 始終有保守結構域存在，這與Conserved Domain 數(shù)據(jù)庫的預測結果相一致。見圖8。

圖8 PLAC8 的分子進化樹Fig.8 Phylogenetic tree of PLAC8

3 討 論

PLAC8 位于人基因組4q13 ~ 4q21，包含5 個外顯子［2］。蛋白質在細胞內合成后，需運輸至特定的位置才能發(fā)揮其功能。PLAC8 定位于不同細胞器的可能性分別為細胞外基質（44.4%）、細胞質（33.3%）、液泡（11.1%）、細胞核（11.1%）。本研究發(fā)現(xiàn)，PLAC8是胞內蛋白，表明其非經(jīng)典的分泌性蛋白，但其主要在細胞外基質中發(fā)揮功能，提示PLAC8 可能通過胞吐的方式運輸至細胞外。

糖基化和磷酸化修飾是真核生物內廣泛存在的重要的翻譯后修飾方式，能夠調控細胞增殖、信號傳遞以及基因的表達等，疾病的發(fā)生常常與關鍵分子的異常修飾存在密切關聯(lián)［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，PLAC8不存在N-糖基化位點；在第11、98 和114 位的蘇氨酸以及第24 和105 位的絲氨酸位點存在O-糖基化位點；在第83 和105 位的絲氨酸位點、第72 位的蘇氨酸位點以及第78 和88 位的酪氨酸位點存在磷酸化位點。這些修飾位點的發(fā)現(xiàn)、鑒定及功能研究，將有利于探索PLAC8 在細胞增殖、凋亡、免疫等生物過程中的作用機理。

蛋白互作是蛋白分子行使功能的重要方式［18］。構建蛋白互作網(wǎng)絡能夠發(fā)現(xiàn)與目標蛋白分子相互作用的蛋白分子，這將為進一步研究其功能機理提供依據(jù)。本研究構建的PLAC8 蛋白相互作用網(wǎng)絡顯示，PLAC8 蛋白可能與10 個蛋白具有相互作用，其中包括 ELANE、CTSG、CTSC、PYCARD、LYZ、MNDA、UNC13D、C3、RNASE2、MAPK1。已有文獻報道，ELANE 能夠調控自然殺傷細胞、單核細胞和粒細胞的功能［19］；CTSG 可增強血管內皮細胞的通透性［20］，并且可對多種免疫和炎癥途徑進行調控［21］；在細胞凋亡和炎癥中，PYCARD 可促進caspase 介導的凋亡，可能以細胞類型特異性方式參與激活線粒體凋亡途徑［22］；LYZ 可增強免疫制劑的活性并且具有溶菌的功能［23］；MNDA 可在骨髓增生異常綜合征中調節(jié)細胞凋亡［24］；UNC13D 在淋巴細胞毒性顆粒胞吐中起作用，在免疫突觸處進行顆粒成熟、顆粒對接和啟動［25］；C3 可激活 JAK2 ／ STAT3 途徑，從而參與到胃癌的進展［26］；在結直腸癌細胞侵襲行為研究中，PLAC8 通過介導MAPK1 信號通路的增強，促進細胞的侵襲［27］。由此可見，PLAC8 可能與該網(wǎng)絡中的下游蛋白分子相互作用，參與細胞增殖、凋亡、分化等過程及腫瘤的調控。但這些結論仍需相應的實驗進一步驗證。

本研究利用生物信息學方法對PLAC8 進行的分析表明，PLAC8 是一種堿性、穩(wěn)定的親水性蛋白，主要在細胞外基質發(fā)揮作用，屬于PLAC8 超家族的成員；有多個O-糖基化和磷酸化位點；能夠與多個蛋白形成互作網(wǎng)絡。這些結果將對進一步研究PLAC8功能及其作用機制提供新的科學依據(jù)。