江征 ，張國梅 ，張哲罡 ，鄧濤 ，劉京 ，呂傳碩 ，樂洋 ，馬寧 ，周蓉 ，張家友 ，李長貴 ，楊曉明

1.武漢生物制品研究所病毒性疫苗研究二室，湖北武漢430207；2.中國食品藥品檢定研究院，北京102629；3.國家聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430207；4.中國生物技術(shù)股份有限公司，北京100029

流感病毒持續(xù)威脅著人類健康。據(jù)WHO 數(shù)據(jù)顯示，每年約有10 億人感染流感病毒，并造成300萬 ～500 萬重癥病例和30 萬 ～50 萬死亡病例［1］。流感病毒屬正黏科病毒，其基因組由7 或8 個不連續(xù)片段的單股負鏈RNA 構(gòu)成。流感病毒目前分為甲、乙、丙、丁4 型，甲型流感病毒又分為不同亞型，如H1N1、H3N2 等；乙型流感病毒分為 Victoria 和Yamagata 兩個不同的譜系［2］。目前，每年一度的疫苗接種仍是預(yù)防流感的主要有力措施［3］，全球的流感疫苗主要是傳統(tǒng)的基于雞胚基質(zhì)的裂解疫苗和亞單位疫苗。由于雞胚基質(zhì)疫苗存在諸多不足，如病毒的雞胚適應(yīng)性突變會降低免疫原性，疫苗的生產(chǎn)依賴于雞胚的供應(yīng)，不能快速靈活地應(yīng)對流感大流行等，近年來出現(xiàn)了基于細胞基質(zhì)的流感疫苗，并有研究通過改造細胞特性使其更適于流感疫苗培養(yǎng)［4］?；贛DCK 細胞流感疫苗的研究表明，該細胞適用于流感病毒的培養(yǎng)，具有較強的病毒復(fù)制能力，適用于大規(guī)模培養(yǎng)［5-6］。

流感病毒在感染細胞過程中其表面血凝素（hemagglutinin，HA）需從未活化狀態(tài)HA0 經(jīng)胰蛋白酶裂解為具有感染能力的HA1 和HA2［7-9］，而細胞內(nèi)不存在該類的蛋白酶，因此為提高流感病毒在細胞中培養(yǎng)的病毒滴度，中國食品藥品檢定研究院呼吸道病毒疫苗室構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達牛胰蛋白酶原的MDCK 細胞系，即MTY6 細胞。牛胰蛋白酶原經(jīng)微量胰酶的加入即可活化轉(zhuǎn)變?yōu)榕Ｒ鹊鞍酌?，簡化了細胞基質(zhì)流感疫苗的生產(chǎn)工藝［10］。本研究對4型流感病毒疫苗株在MTY6 細胞中的增殖條件進行優(yōu)化，比較4 型疫苗株在兩株細胞中培養(yǎng)的病毒滴度及對于兩株細胞易感性等的差異，以期為MTY6細胞基質(zhì)的四價流感病毒裂解疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞株及病毒株 MTY6 細胞由中國食品藥品檢定研究院呼吸道病毒疫苗室惠贈；MDCK 細胞（ATCC-CCL-34）購自ATCC，由武漢生物制品研究所有限責任公司病毒性疫苗研究二室保存；H1N1（IVR-215）、H3N2（NIB-121）、BV（BVR-11）、BY（BVR-1B）疫苗株均購自NIBSC，由武漢生物制品研究所病毒性疫苗研究二室保存。

1.2 實驗動物 白羽雞購自湖北峪口禽業(yè)有限公司。

1.3 主要試劑及儀器 DMEM 培養(yǎng)基購自美國賽默飛公司；新生牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司；重組胰酶購自上海雅心生物技術(shù)有限公司；青霉素／ 鏈霉素溶液購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PBS 緩沖液和除菌濾器購自德國賽多利斯公司；實時細胞分析（RTCA）儀器購自安捷倫公司。細胞培養(yǎng)基為DMEM 培養(yǎng)基加入5%新生牛血清，病毒維持液為DMEM 培養(yǎng)基加入1 × 青霉素 ／ 鏈霉素溶液。

1.4 細胞培養(yǎng) 復(fù)蘇MDCK 和MTY6 細胞，穩(wěn)定培養(yǎng)3 代后，在RTCA 儀器專用96 孔細胞板中1~4列和 5 ~ 8 列按 5 × 104個 ／ 孔的濃度分別加入 100 μL MTY6 或 MDCK 細胞，培養(yǎng) 85 h，每隔 10 min 收集細胞增殖信號，由RTCA 儀器自動繪制兩種細胞85 h內(nèi)的生長曲線。

1.5 4 型流感病毒在兩種細胞中增殖條件的優(yōu)化采用棋盤法。取對數(shù)生長期的MTY6 和MDCK 細胞，按 4 × 104個 ／ cm2的濃度接種至 T75 細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，24 h 后棄去細胞培養(yǎng)基，用PBS 洗滌，加入重組胰酶濃度分別為 0.5、1、1.5、2 μg ／ mL 的病毒維持液 17 mL，分別接種 MOI 為 0.1、0.01、0.001、0.000 1的 H1N1、H3N2、BV、BY 株病毒，于 34 ℃，5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；接種病毒后 24、48、72、96 h 分別取 500 μL病毒液，檢測血凝滴度和病毒滴度。

1.6 病毒血凝滴度檢測 采用紅細胞凝集試驗。在96 孔板第 2 ～ 12 列加入 PBS 50 μL，第 1 列加入100 μL 待檢病毒液后，吸取 50 μL 加至第 2 列的相應(yīng)各孔，依次從第2 ～12 列進行2 倍系列稀釋；各孔加入50 μL 1%雞血紅細胞，靜置30 ~ 40 min。結(jié)果判定：以出現(xiàn)完全凝集的最高稀釋度為終點，其稀釋度的倒數(shù)即為病毒的紅細胞凝集滴度。

1.7 病毒滴度檢測 在96 孔細胞板中每孔加入3 ×104個細胞，于 37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng) 24 h；棄去培養(yǎng)基，用PBS 洗滌2 次，在24 孔細胞板中取待檢病毒液，用病毒維持液進行對數(shù)稀釋，稀釋度依次為10-1～ 10-11；將各稀釋度的病毒液分別取 100 μL 加至96 孔細胞板的第1 ～11 列，第12 列各孔加入100 μL PBS 作為陰性對照，于 34 ℃，5% CO2條件下放置1 h 進行病毒吸附；更換100 μL 新鮮病毒維持液，于 34 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 h；加入 100 μL 結(jié)晶紫染色10 ~ 20 min。結(jié)果判定：以細胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）為依據(jù)進行結(jié)果判讀，若孔底染色為紫色則為陽性孔，統(tǒng)計各稀釋度下的陽性孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench 法［11］計算病毒半數(shù)組織感染劑量（median tissue culture infective dose，TCID50）。

1.8 4 型流感病毒在兩種細胞中培養(yǎng)引起CPE 敏感性的比較 參照病毒滴度檢測方法，取在MDCK 細胞中最適條件下培養(yǎng)的4 型流感病毒檢測基于MTY6細胞CPE 的TCID50值，以TCID50值反映4 型病毒在兩株細胞中培養(yǎng)時引起CPE 的敏感程度。

2 結(jié) 果

2.1 兩種細胞生長曲線的比較 兩種細胞的生長曲線重合度較高，在96 孔細胞板中每孔加入5 × 104個細胞的起始密度下，二者均于40 h 左右進入對數(shù)生長期，但MTY6 細胞的平臺期比MDCK 細胞更長，MDCK 細胞則更快進入衰退期。見圖1。

圖1 MTY6 和MDCK 細胞的生長曲線Fig.1 Growth curve of MTY6 and MDCK cells

2.2 4 型流感病毒在兩種細胞中增殖條件的優(yōu)化

2.2.1 血凝滴度的比較 H1N1、H3N2、BV 和 BY株病毒在MTY6 細胞中培養(yǎng)，血凝滴度最高分別為1 ∶27、1 ∶25、1 ∶29和 1 ∶29U ／ 50 μL；在 MDCK 細胞中培養(yǎng)，血凝滴度最高分別為 1 ∶26、1 ∶22、1 ∶28和1 ∶29U ／ 50 μL。H1N1 血凝滴度達 1 ∶26U ／ 50 μL的培養(yǎng)條件在MTY6 細胞中有11 個，在MCDK 細胞中有 2 個；H3N2 血凝滴度達 1 ∶24U ／ 50 μL 的培養(yǎng)條件在MTY6 細胞中有25 個，在MCDK 細胞中無；BV 血凝滴度達 1 ∶28U ／ 50 μL 的培養(yǎng)條件在MTY6 細胞中有 20 個，在 MCDK 細胞中有 15個；BY血凝滴度達 1 ∶28U ／50 μL 的培養(yǎng)條件在MTY6 細胞中有 24 個，在 MCDK 細胞中有 10 個。總體上，4 型流感病毒疫苗株在MTY6 細胞中培養(yǎng)更易獲得較高的血凝滴度。見表1。

表1 4 型流感病毒株在兩種細胞中培養(yǎng)的血凝滴度Tab.1 Hemagglutination titer of four subtypes of influenza virus cultured in MTY6 and MDCK cells

2.2.2 最適種毒條件 H1N1、H3N2、BV 和 BY 株病毒在MTY6 細胞中培養(yǎng)的最適MOI 分別為10-4、10-4、10-2、10-2，胰酶濃度分別為 0.5、1、0.5 和 0.5 μg ／mL，收毒時間分別為 96、72、48 和 72 h；在 MDCK 細胞中培養(yǎng)的最適MOI 均為10-4，胰酶濃度分別為0.5、1、0.5 和 1.5 μg ／ mL，收毒時間分別為 96、48、72和72 h。H1N1 在兩種細胞中培養(yǎng)的最適條件相同；H3N2 在MTY6 細胞中的培養(yǎng)時間比在MDCK 細胞中長；BV 在MTY6 細胞中培養(yǎng)的最適MOI 比在MDCK細胞中高，最適時間短；BY 在MTY6 細胞中培養(yǎng)的最適MOI 比在MDCK 細胞中高，最適胰酶濃度低。見表2。

表2 4 型流感病毒株種毒的最適條件Tab.2 Optimal condition for inoculation of four subtypes of influenza virus

2.2.3 血凝滴度的比較 H1N1、H3N2 和 BV 株病毒分別在MTY6 和MDCK 細胞相應(yīng)的最適條件下培養(yǎng)收獲病毒液后，在MTY6 細胞中的血凝滴度比MDCK 細胞中分別高出 2、8 和 2 倍；BY 株病毒在兩株細胞相應(yīng)的最適條件下培養(yǎng)后的血凝滴度均為1︰29U ／ 50 μL，見圖 2，但與 MDCK 細胞相比，在MTY6 細胞中培養(yǎng)時更易達到較高的血凝滴度，該現(xiàn)象同樣出現(xiàn)在其他3 型病毒株。

圖2 4 型病毒株以最適條件在兩種細胞中培養(yǎng)收獲病毒液的血凝滴度Fig.2 Hemagglutination titer of four subtypes of virus strain cultured in MTY6 or MDCK cells under optimal condition

2.2.4 病毒滴度的比較 H1N1、H3N2、BV 和 BY株病毒分別以最適條件在MTY6 細胞中培養(yǎng)的病毒滴度比在MDCK 細胞中分別高 2、3.3、0.8 和2.5 TCID50／ mL，見圖 3。

圖3 4 型病毒株以最適條件在兩種細胞中培養(yǎng)收獲病毒液的病毒滴度Fig.3 Virus titer of four subtypes cultured in MTY6 or MDCK cells under optimal condition

2.3 4 型流感病毒在兩種細胞中培養(yǎng)引起CPE 敏感性的比較 基于MTY6 細胞CPE 的H1N1、H3N2、BV、BY 株病毒的 LgTCID50／ mL 分別為 6.5、7.2、7.2、7.5，基于 MDCK 細胞 CPE 的 H1N1、H3N2、BV、BY 株病毒的 LgTCID50／ mL 分別為 5.5、5.0、7.4、5.5。能夠引起MTY6 細胞CPE 更明顯的為H1N1、H3N2 和BY 型流感病毒，BV 型流感病毒則能夠引起MDCK 細胞更明顯的CPE。見圖4。

圖4 4 型病毒株引起兩種細胞CPE 的比較Fig.4 CPEs caused by four subtypes of virus in MTY6 and MDCK cells

3 討 論

目前常用于流感疫苗培養(yǎng)的細胞基質(zhì)有MDCK、Vero 和PER.C6 細胞，由于MDCK 細胞對于各型流感病毒均易感，在流感疫苗生產(chǎn)中已被廣泛使用［12］。流感病毒在感染細胞的過程中存在關(guān)鍵一步，即HA的前體形式需在胰蛋白酶的作用下活化單堿性氨基酸的酶切位點，成為具有感染能力的HA1 和HA2［13-15］。流感病毒在雞胚中培養(yǎng)時，得益于雞胚尿囊液中存在大量蛋白酶水解HA 的作用，具有很高的病毒滴度。但流感病毒在細胞中培養(yǎng)時，細胞自身不表達能夠水解HA 的蛋白酶，因此需額外在細胞培養(yǎng)基中加入適宜濃度的胰蛋白酶來提高病毒感染能力［16］。中國食品藥品檢定研究院呼吸道病毒疫苗室成功構(gòu)建了高效表達經(jīng)密碼子優(yōu)化的牛胰蛋白酶原的MTY6 細胞系［10］。胰蛋白酶原分泌在細胞中通過添加少量胰酶即可被活化，使其轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘呐Ｒ鹊鞍酌?。培養(yǎng)病毒的細胞自身能夠合成并分泌牛胰蛋白酶原大幅簡化了細胞基質(zhì)流感疫苗的生產(chǎn)工藝。

在MTY6 和MDCK 細胞中分別以最適條件接種4 型流感病毒后，在MTY6 細胞中培養(yǎng)時4 型流感病毒更易達到較高的血凝滴度，且具有更高的血凝滴度以及病毒滴度，在獲得更大產(chǎn)量的同時，疫苗株的病毒活力更高，有利于解決H1N1 和H3N2 在MDCK 細胞或雞胚中培養(yǎng)時病毒活力欠佳的問題。在MTY6 和MDCK 細胞對于不同型別流感病毒所引起的 CPE 中，H1N1、H3N2 和 BY 型流感病毒對MTY6細胞的病變更具敏感性，提示對于測定低病毒滴度或不易引起MDCK CPE 的流感病毒株，建立基于MTY6細胞CPE 的病毒滴度檢測方法更具有敏感性。

本研究在穩(wěn)定表達牛胰蛋白酶原的MTY6 細胞上探討了4 型流感病毒疫苗株的最適增殖條件，為后續(xù)MTY6 細胞基質(zhì)流感疫苗在生物反應(yīng)器中擴大培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。但本研究局限于小規(guī)模試驗，需配合更多細胞培養(yǎng)監(jiān)測指標，如細胞上清中葡萄糖和乳酸含量、pH 和溶氧等。同時，該細胞可作為研究流感病毒感染機制、檢測流感病毒增殖狀況和快速診斷的工具進行更深入的探索。