王榮華，單長(zhǎng)鋒，王建英，趙子建，李芳紅

1.廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州510006；2.溫州醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，浙江溫州325035

肝纖維化是肝臟對(duì)反復(fù)損傷后的一種修復(fù)反應(yīng)，也是各種慢性肝病進(jìn)展中由于細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）合成與降解失衡導(dǎo)致ECM 在肝臟內(nèi)過度沉積的動(dòng)態(tài)過程［1-2］。肝纖維化具有漸進(jìn)性及一定的可逆性，在適當(dāng)階段加以治療及干預(yù)，可有效阻止甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程［3］。

Omega-3 多不飽和脂肪酸（Omega-3 polyunsaturated fatty acid）主要由二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）組成，自1978 年DYERBERG 等發(fā)現(xiàn)生活在格陵蘭島的因紐特人因在食物中大量攝入Omega-3多不飽和脂肪酸，使冠心病、血栓等疾病的發(fā)病率及死亡率顯著低于其他人群以來，Omega-3 多不飽和脂肪酸對(duì)人體的許多重要生理作用逐漸被發(fā)現(xiàn)，特別是其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及炎癥的生物學(xué)作用，目前已成為許多慢性疾病飲食治療及干預(yù)的研究熱點(diǎn)［4-10］。mTOR 信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控中的作用目前已被人們所認(rèn)識(shí)，其與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［11-14］。

本研究以mTOR 信號(hào)通路為切入點(diǎn)，在四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型的基礎(chǔ)上，探討mTOR 信號(hào)通路在Omega-3 多不飽和脂肪酸飲食干預(yù)小鼠肝纖維化進(jìn)程也中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 食品級(jí)DHA ／ EPA 油為84.76%高純度魚油（含約26.49%DHA，約50.84%EPA），購(gòu)自上海賀普實(shí)業(yè)有限公司（批號(hào)：20190527-EPA50DHA-25EE）；CCl4溶液（批號(hào)：XW00562352）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；藥用級(jí)玉米油（批號(hào)：C116-025）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蘇木素伊紅染色試劑盒（批號(hào)：C0105）、內(nèi)源性過氧化物酶強(qiáng)力封閉液（批號(hào)：P0100B）、RIPA 裂解液（批號(hào)：P0013B）、苯甲基磺酰氟（PMSF，批號(hào)：ST506）、SDSPAGE 蛋白上樣緩沖液（批號(hào)：P0015L）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Masson 染色套裝（批號(hào)：G1006）及天狼星紅染液（批號(hào)：G1018）購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；驢血清（批號(hào)：abs935）購(gòu)自愛必信（上海）生物科技有限公司；免疫組化抗原修復(fù)緩沖液（批號(hào)：ZLI-9067）、SP 試劑盒（批號(hào)：SP-9001）及 DAB 顯色試劑盒（批號(hào)：ZLI-9017）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；PierceTMBCA Protein Assay Ki（t批號(hào)：23225）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；Affinity ECL ki（t批號(hào)：KF003）購(gòu)自美國(guó)Affinity Biosciences 公司；異氟烷（批號(hào)：R510-22-16）購(gòu)自瑞沃德生命科技有限公司；兔抗小鼠α-SMA 單抗（批號(hào)：CST19245S）、兔抗小鼠 COL1A1 多抗（批號(hào)：CST84336S）、兔抗小鼠 mTOR 單抗(批號(hào)：CST2983S）、兔抗小鼠S6 單抗（批號(hào)：CST2217S）、兔抗小鼠p-mTOR單抗（批號(hào)：CST5536S）、兔抗小鼠 p-S6 多抗（批號(hào)：CST2211S）、兔抗小鼠GAPDH 單抗（批號(hào)：CST5174S）、兔抗小鼠 Bcl-xL 單抗（批號(hào)：CST2764S）、兔抗小鼠PCNA 單抗（批號(hào)：CST13110S）、HRP 羊抗兔抗體（批號(hào)：CST7074P2）及HRP 馬抗鼠抗體（批號(hào)：CST7076P2）均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling 公司；兔抗小鼠Bcl-2 單抗（批號(hào)：ab182858）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；鼠抗小鼠β-actin 單抗（批號(hào)：A2228）購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；鼠抗小鼠Fibronectin 單抗（批號(hào)：sc-271098）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí) C57BL ／ 6 小鼠 20 只，雄性，7 ～ 8 周齡，體重（23.297 ± 0.878）g，由華南理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK（粵）2017-0178。

1.3 小鼠肝纖維化模型的建立及分組處理 將20只C57BL ／ 6 小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、4 周模型組、8 周模型組及治療組，每組5 只。模型組及治療組小鼠經(jīng)腹腔注射含 20% CCl4的玉米油溶液，5 mL ／ kg，每周2 次，誘導(dǎo)建立肝纖維化模型；對(duì)照組小鼠經(jīng)腹腔注射等劑量玉米油，除4 周模型組注射4 周外，其余3 組持續(xù)注射8 周；治療組在造模的同時(shí)從第4 周開始給予小鼠灌胃 EPA ／ DHA，4 g ／ kg，每日 1 次，對(duì)照組及8 周模型組給予等劑量生理鹽水灌胃。在造模完成后24 h 內(nèi)觀察記錄小鼠體重及毛發(fā)色澤；使用過量異氟烷麻醉，迅速剖開腹腔記錄肝臟大體形態(tài)并摘取小鼠肝臟，用冰生理鹽水快速?zèng)_洗，以濾紙吸干水分后稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)（肝臟重量占總體重的百分比），取肝右葉制成石蠟切片；其余肝組織放入液氮迅速冷凍后于-80 ℃凍存。

1.4 肝組織病理學(xué)檢查 小鼠肝組織用10%中性甲醛固定24 h 脫水后，按常規(guī)包埋切片步驟制成4 ～5 μm 石蠟切片，分別進(jìn)行 HE 染色、Masson 三色染色及天狼星紅染色，以中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 肝組織中肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）活化標(biāo)志蛋白（α-SMA）、抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xL）及細(xì)胞增殖核抗原蛋白（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表達(dá)水平的檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)染色。各組小鼠肝組織石蠟切片經(jīng)梯度濃度乙醇脫蠟后水化，用檸檬酸鈉抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min；PBS 洗滌3次，加入 5%驢血清（1 ∶20 稀釋），室溫封閉 1 h；加入抗 α-SMA 抗體（1 ∶650 稀釋）、抗 Bcl-2 抗體（1 ∶500 稀釋）、抗Bcl-xL 抗體（1 ∶1 000 稀釋）、抗 PCNA抗體（1 ∶1 000 稀釋），4 ℃孵育過夜；PBS 洗滌 3 次，滴加生物素標(biāo)記IgG，室溫孵育1 h；PBS 洗滌3 次，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min；PBS 洗滌 3 次，DAB 及蘇木素染色。

1.6 肝組織總蛋白的提取 取各組適量肝組織，加入用 RIPA 裂解液（500 μL）和 1% PMSF 配制成的裂解液混合物，置研磨儀進(jìn)行研磨。4 ℃，7 317 × g 離心20 min；取上清，用PierceTMBCA Protein Assay Kit進(jìn)行定量分析，用SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液將各組蛋白樣品均稀釋為 2 μg ／ μL，金屬浴煮沸 5 min，使蛋白變性，分裝為 20 μL ／管，于-80 ℃凍存。

1.7 肝組織中HSC α-SMA 蛋白、促纖維化蛋白（Collagen1A1、Fibronectin）表達(dá)水平及 mTOR 信號(hào)通路中mTOR、S6 蛋白磷酸化水平的檢測(cè) 采用Western blot。取等量（30 μg）蛋白，經(jīng) 5% ～ 12% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，加入5%脫脂奶粉，室溫封閉 1 h；加入抗 α-SMA 抗體（1 ∶1 000 稀釋）、抗COL1A1 抗體（1 ∶1 000 稀釋）、抗 Fibronectin 抗體（1 ∶320 稀釋）、抗 mTOR 抗體及抗 p-mTOR 抗體（均1 ∶1 000 稀釋）、抗 S6 抗體及抗 p-S6 抗體（均 1 ∶1 000稀釋）、抗 GAPDH 抗體（1 ∶1 000 稀釋）、抗 β-actin抗體（1 ∶2 000 稀釋），4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌 3次，加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔抗體、HRP 標(biāo)記的馬抗鼠抗體（均 1 ∶2 000 稀釋），室溫孵育 1 h；TBST 洗滌 3次，以 GAPDH 或 β-actin 為內(nèi)參，用 ECL 試劑盒顯影成像，凝膠成像儀進(jìn)行曝光，統(tǒng)計(jì)條帶灰度值后計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Graphpad Prism 7.00 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)及肝臟大體形態(tài) 對(duì)照組小鼠8周內(nèi)食欲及體重增長(zhǎng)正常，反應(yīng)靈敏，毛發(fā)光滑有光澤；肝臟表面光滑鮮艷，邊緣銳利，為正常肝臟形態(tài)。4 周模型組4 周內(nèi)食欲及體重增長(zhǎng)速度下降，反應(yīng)較靈敏，毛發(fā)出現(xiàn)分叉并變暗；肝臟外觀色澤變暗，邊緣鈍化，但表面顆粒狀病變不明顯。8 周模型組的生存狀態(tài)與4 周模型組小鼠較為一致，但從第4周后，其反應(yīng)明顯遲鈍，精神萎靡且毛發(fā)蓬亂無光澤；肝臟外觀色澤暗淡，邊緣圓鈍，表面和切面呈彌漫性的細(xì)小顆粒狀。治療組食欲及體重較8 周模型組有所改善，反應(yīng)較為靈敏，毛發(fā)色澤與4 周模型組基本一致；肝臟形態(tài)與8 周模型組相比明顯改善，但肝組織表面仍有細(xì)小顆粒。與對(duì)照組比較，8 周模型組及治療組小鼠肝臟指數(shù)顯著升高（T分別為5.496、3.022，P均 ＜ 0.05）。見圖 1 和圖 2。表明 Omega-3多不飽和脂肪酸飲食干預(yù)對(duì)纖維化小鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)及肝臟形態(tài)有改善作用。造模開始時(shí)，各組小鼠平均體重均為23 g，在造模期間體重增長(zhǎng)速度不同，但總體均呈上升的趨勢(shì)，由于8 周模型組小鼠試驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)于4 周模型組，該組平均體重高于4 周模型組。見表1。

圖1 各組小鼠毛色狀態(tài)及肝臟形態(tài)Fig.1 Hair colors and liver morphologies of mice in various groups

圖2 各組小鼠肝臟指數(shù)Fig.2 Liver indexes of mice in various groups

表1 各組小鼠造模期間體重（g，，n = 5）Tab.1 Body weights of mice in various groups during modeling（g，，n = 5）

表1 各組小鼠造模期間體重（g，，n = 5）Tab.1 Body weights of mice in various groups during modeling（g，，n = 5）

組別 第4 周 第8 周對(duì)照組 27.744 ± 1.014 28.746 ± 0.884 4 周模型組 26.838 ± 0.514 -8 周模型組 26.830 ± 0.111 27.368 ± 0.731治療組 26.848 ± 0.360 28.502 ± 0.322

2.2 小鼠肝組織的病理變化 結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞排列規(guī)則有序，以中央靜脈為中心呈放射狀，肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，未發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞壞死、脂肪變性及纖維組織增生現(xiàn)象，在匯管區(qū)出現(xiàn)少量膠原沉積，為正常肝臟病理形態(tài)；4 周模型組肝組織有少量肝細(xì)胞壞死及炎癥細(xì)胞聚集，匯管區(qū)的膠原沉積增加，纖維組織出現(xiàn)少量增生，但其肝索、肝小葉及匯管區(qū)結(jié)構(gòu)基本完整，為肝纖維化初始階段；8 周模型組肝組織有廣泛的肝細(xì)胞壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝索排列紊亂無序，肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)明顯的纖維組織增生，并已形成假小葉，同時(shí)有大量的膠原沉積；與8 周模型組比較，治療組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)損傷改善明顯，匯管區(qū)或中央靜脈間纖維間隔明顯變薄，纖維組織增生及膠原沉積明顯減少。與對(duì)照組比較，4 周模型組、8 周模型組及治療組Masson 三色及天狼星紅染色的肝組織陽性膠原面積百分比均顯著增加（4 周模型組T分別為19.555 和44.424，8 周模型組T分別為 21.48 和 19.739，治療組T分別為 44.598 和 21.712，P均 ＜ 0.01）；與 8 周模型組比較，治療組Masson 三色及天狼星紅染色陽性膠原面積百分比均顯著降低（T分別為22.943 和22.885，P均 ＜ 0.01）。見圖 3 和圖 4。表明 Omega-3多不飽和脂肪酸飲食干預(yù)對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠有保護(hù)作用。

圖3 各組小鼠肝組織HE、Masson 三色及天狼星紅染色的顯微鏡觀察（× 100）Fig.3 Microscopy of liver tissues of mice in various groups by HE，Masson trichrome and Sirius red staining（× 100）

圖4 各組小鼠肝組織Masson 三色（A）及天狼星紅染色（B）的陽性膠原面積百分比Fig.4 Percentage of collagen areas positive in Masson trichrome（A）and Sirius red（B）staining in mice of various groups

2.3 小鼠肝組織中α-SMA 蛋白的表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，8 周模型組小鼠肝組織中α-SMA 蛋白表達(dá)水平顯著升高（T= 41.924，P＜ 0.01）；與 8 周模型組比較，治療組肝組織中α-SMA 蛋白表達(dá)水平顯著下降（T= 36.278，P＜ 0.01）。見圖 5 和圖 6。表明Omega-3 多不飽和脂肪酸飲食干預(yù)對(duì)HSC 的活化有抑制作用。

圖5 各組小鼠肝組織中α-SMA 蛋白免疫組化染色的顯微鏡觀察（× 200）Fig.5 Microscopy of α-SMA in liver tissue of mice in various groups by immunohistochemical staining（× 200）

圖6 各組小鼠肝組織α-SMA 蛋白免疫組化染色的平均光密度值Fig.6 Mean optical density of immunohistochemical staining of α-SMA in liver tissues of mice in various groups

2.4 小鼠肝組織中 Bcl-2、Bcl-xL 及 PCNA 蛋白的表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，8 周模型組小鼠肝組織中Bcl-2、Bcl-xL 及PCNA 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（T分別為 14.757、16.212 和 16.773，P均 ＜0.01）；與8 周模型組比較，治療組肝組織中Bcl-2、Bcl-xL 及PCNA 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（T分別為 7.598、4.646 和 16.593，P均 ＜ 0.01）。見圖 7 和圖8。表明Omega-3 多不飽和脂肪酸飲食干預(yù)可通過抑制肝細(xì)胞凋亡及促進(jìn)肝細(xì)胞再生來發(fā)揮抗纖維化作用。

圖7 各組小鼠肝組織中Bcl-2、Bcl-xL、PCNA 蛋白免疫組化染色的顯微鏡觀察（× 200）Fig.7 Microscopy of Bcl-2，Bcl-xL and PCNA in liver tissues of mice in various groups by immunohistochemical staining（× 200）

圖8 各組小鼠肝組織中 Bcl-2（A）、Bcl-xL（B）免疫組化染色的平均光密度值和PCNA（C）免疫組化染色的陽性細(xì)胞百分比Fig.8 Mean optical density of immunohistochemical staining of Bcl-2（A）and Bcl-xL（B）and percentage of PCNA positive cells（C）in liver tissue of mice in various groups

2.5 小鼠肝組織中Fibronectin、Collagen1A1 及α-SMA 蛋白的表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，8 周模型組小鼠肝組織中 Fibronectin、Collagen1A1 及 α-SMA 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（T分別為18.216、41.173和 57.212，P均 ＜ 0.01）；與 8 周模型組比較，治療組肝組織中 Fibronectin、Collagen1A1 及 α-SMA 蛋白表達(dá)水平均顯著下降（T分別為12.317、28.991 和40.112，P均 ＜ 0.01）。見圖 9 和圖 10。提示 Omega-3 多不飽和脂肪酸飲食干預(yù)可能通過抑制HSC 的活化進(jìn)而減少促纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)。

圖9 各組小鼠肝組織中 Fibronectin、Collagen1A1 及 α-SMA 蛋白表達(dá)水平的Western blot 檢測(cè)Fig.9 Determination of expression levels of Fibronectin，Collagen1A1 and α-SMA in liver tissues of mice in various groups by Western blot

圖10 各組小鼠肝組織中 Fibronectin（A）、Collagen1A1（B）及α-SMA（C）蛋白的表達(dá)水平Fig.10 Expression levels of Fibronectin（A），Collagen1A1（B）and α-SMA（C）in liver tissues of mice in various groups

2.6 小鼠肝組織中mTOR 及S6 蛋白的磷酸化水平與對(duì)照組比較，8 周模型組小鼠肝組織中mTOR 及S6蛋白的磷酸化水平均顯著升高（T分別為11.141和18.464，P均 ＜ 0.01）；與 8 周模型組比較，治療組肝組織中mTOR 及S6 蛋白的磷酸化水平均顯著下降（T分別為 5.228 和 9.660，P均 ＜ 0.01），而 mTOR及S6 總蛋白的表達(dá)水平無變化（T分別為0.595和 0.589，P均 ＞ 0.05）。見圖 11 和圖 12。表明Omega-3 多不飽和脂肪酸飲食干預(yù)對(duì)誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠的保護(hù)作用與mTOR 信號(hào)通路有關(guān)。

圖11 各組小鼠肝組織中 mTOR ／ p-mTOR 及 S6 ／ p-S6蛋白表達(dá)水平的Western blot 檢測(cè)Fig.11 Determination of expression levels of mTOR ／ pmTOR and S6 ／ p-S6 protein in liver tissues of mice in various groups by Western blot

圖12 各組小鼠肝組織中mTOR 及S6 蛋白的磷酸化水平Fig.12 Phosphorylation levels of mTOR and S6 protein in liver tissues of mice in various groups

3 討 論

肝纖維化是機(jī)體對(duì)各種慢性肝損傷炎癥刺激所引起的一種自我修復(fù)反應(yīng)，是一切慢性肝病的共同病理學(xué)基礎(chǔ)，阻止或減緩肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展是預(yù)防肝硬化和肝癌發(fā)生的關(guān)鍵。目前臨床主要采用類固醇物質(zhì)、膽烷酸、內(nèi)源性大麻素等化學(xué)藥物進(jìn)行肝纖維化治療，這種治療方式雖療效確切，但存在副作用大及易耐藥等問題，因此，迫切需要尋找一種作用溫和、無毒性及無耐藥性的新型抗纖維化療法［15-18］。

Omega-3 多不飽和脂肪酸來源于深海魚類，為一種安全和無耐藥性的海洋生物活性化合物［19］，近年來，其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及炎癥的生物學(xué)作用已引起人們的重視。有研究表明，每日飲食補(bǔ)充4 g Omega-3多不飽和脂肪酸可有效降低重癥創(chuàng)傷患者的全身炎癥反應(yīng)綜合征發(fā)生率［20］。另一項(xiàng)對(duì)膿血癥兒童的前瞻性、隨機(jī)、雙盲及對(duì)照試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飲食補(bǔ)充Omega-3 多不飽和脂肪酸能顯著降低患者C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、血沉（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、IL-6 及白蛋白等炎癥指標(biāo)的含量［21］。前期研究發(fā)現(xiàn)，Omega-3 多不飽和脂肪酸通過p38 MAP 激酶激活及周期蛋白D1 ／ CDK4 下調(diào)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖［22］。因此，Omega-3 多不飽和脂肪酸飲食干預(yù)相比傳統(tǒng)抗纖維化藥物治療具有明顯優(yōu)勢(shì)。本研究通過建立CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型，以mTOR 信號(hào)通路為切入點(diǎn)，在致病因素未去除，CCl4持續(xù)作用的條件下，探討Omega-3 多不飽和脂肪酸飲食干預(yù)的保肝作用及對(duì)mTOR 信號(hào)通路的影響。

肝纖維化發(fā)病機(jī)制可簡(jiǎn)單概括為4 步：致病因子、肝細(xì)胞損傷、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、HSC 活化。其中肝細(xì)胞損傷是肝纖維化起始階段，主要表現(xiàn)為細(xì)胞水腫，損傷后的肝細(xì)胞會(huì)釋放出大量刺激因子導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，最終激活HSC［23-25］。激活的HSC 特異性表達(dá)平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA），其活化后的結(jié)果導(dǎo)致ECM 的合成及降解失衡，以膠原纖維沉積最為直觀，同時(shí)大量分泌α-SMA、Ⅰ型膠原（Collagen1A1）及纖維連接蛋白（Fibronectin），最終導(dǎo)致肝纖維化的形成［26］。本研究發(fā)現(xiàn)，與8 周模型組比較，Omega-3多不飽和脂肪酸飲食干預(yù)能明顯減少肝細(xì)胞損傷及膠原纖維的沉積，其炎癥水平和纖維化程度與4周模型組接近，且肝組織中HSC 活化的數(shù)量及其分泌的 α-SMA、Collagen1A1 及 Fibronectin 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P均 ＜ 0.01），表明 Omega-3 多不飽和脂肪酸能通過抑制HSC 的激活、降低促纖維化蛋白的表達(dá)發(fā)揮抗纖維化作用。

肝細(xì)胞作為肝臟的實(shí)質(zhì)細(xì)胞，是肝纖維化發(fā)生時(shí)刺激因子的主要釋放者。目前研究表明，正常肝組織中肝細(xì)胞凋亡及增殖并不活躍［27］，在肝纖維化的早期，機(jī)體啟動(dòng)肝臟代償機(jī)制，可通過促進(jìn)肝細(xì)胞的代償性增殖進(jìn)行自我修復(fù)，但在持續(xù)性肝損傷的情況下，肝細(xì)胞凋亡增加及增殖能力下降會(huì)促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展［27-29］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，8周模型組小鼠肝組織中抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL 及細(xì)胞增殖蛋白PCNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P均 ＜0.01），表明肝臟發(fā)生了代償性抗凋亡進(jìn)行自我修復(fù)反應(yīng)。與8 周模型組比較，治療組小鼠肝組織中Bcl-2、BclxL 及PCNA 蛋白水平進(jìn)一步顯著升高（P均＜0.01），表明Omega-3 多不飽和脂肪酸飲食干預(yù)可有效增強(qiáng)肝臟的自我修復(fù)能力。

mTOR 信號(hào)通路作為細(xì)胞生長(zhǎng)中心協(xié)調(diào)器，可匯聚和整合來自營(yíng)養(yǎng)、能量、生長(zhǎng)因子及環(huán)境壓力對(duì)細(xì)胞的刺激信號(hào)，通過下游效應(yīng)器（4EBP1 及S6）調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化及凋亡，對(duì)于肝纖維化的治療具有重要意義［30-31］。有研究表明，mTOR 的過度激活是肝纖維化進(jìn)展的一個(gè)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制之一［32-33］，與本研究結(jié)果相符，體現(xiàn)在8 周模型組小鼠肝細(xì)胞中mTOR 的磷酸化顯著增加（P＜0.01），S6 蛋白的磷酸化水平大幅上調(diào)（P＜ 0.01），這些均為經(jīng)典的mTOR 信號(hào)通路過度激活的象征。而在Omega-3 多不飽和脂肪酸飲食干預(yù)的情況下，兩組結(jié)果均顯示對(duì)mTOR 通路的抑制。很多發(fā)表的文獻(xiàn)中也不再展示對(duì)4EBP1 磷酸化的影響，一是相關(guān)商業(yè)化抗體的特異性一般不是很強(qiáng)，另外也不是所有體系中均會(huì)展示出對(duì)4EBP1 的調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，Omega-3 多不飽和脂肪酸能顯著抑制肝臟組織中mTOR 及 S6 蛋白的磷酸化水平（P均 ＜ 0.01），提示Omega-3 多不飽和脂肪酸的抗纖維化作用與其對(duì)mTOR 信號(hào)通路的抑制有關(guān)。

綜上所述，Omega-3 多不飽和脂肪酸飲食干預(yù)對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠有顯著的保護(hù)作用，延緩了肝纖維化的發(fā)展，表明其可作為治療肝纖維化潛在的新型方式之一；同時(shí)，Omega-3 多不飽和脂肪酸對(duì)mTOR 信號(hào)通路具有抑制作用，提示Omega-3多不飽和脂肪酸抗肝纖維化的作用機(jī)制與mTOR 信號(hào)通路有關(guān)。