李濟民，朱 輝，徐 可，王 飛，楊 璐，葉澤康，談楚楚，顧 倩，王 靜，李春堅*

1南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心臟科，江蘇 南京 210029；2阜陽市第五人民醫(yī)院心血管內科二病區(qū)，安徽 阜陽 236000；3南京醫(yī)科大學附屬常州第二人民醫(yī)院老年病科，江蘇 常州 213000

抗血小板治療是冠心?。╟oronary artery dis?ease，CAD）藥物治療的基石。作為二磷酸腺苷（ade?nosine diphosphate，ADP）受體拮抗劑，氯吡格雷被廣泛應用于急性冠脈綜合征（acute coronary syn?drome，ACS）或冠狀動脈支架植入后的CAD患者［1-2］。但研究發(fā)現，氯吡格雷的抗血小板療效存在顯著的個體差異，20%以上的患者在服用常規(guī)劑量的氯吡格雷時血小板聚集功能未被有效抑制［3］，稱為氯吡格雷低反應性（clopidogrel low response，CLR）或氯吡格雷抵抗（clopidogrel resistance，CR）［4］。研究顯示，CLR 患者的支架內血栓、心肌梗死和全因死亡的風險顯著增加［5］。

microRNA（miRNA）是一類長18～22 nt 的非編碼RNA，其可通過與靶信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）特異性結合，在轉錄后水平調控靶基因的表達。Nagalla等［6］發(fā)現健康志愿者中血小板高反應組與正常反應組間血小板miRNA 存在表達差異，miRNA可以通過與mRNA結合來調控血小板蛋白的表達，從而影響血小板活性。本研究旨在通過篩查CLR患者血小板miRNA表達的差異，探尋對血小板聚集關鍵蛋白（P2Y12受體、Gi2α蛋白、血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受體）可能有調控作用的miRNA，為個體化抗血小板治療提供新的靶標。

1 對象和方法

1.1 對象

連續(xù)入選2015年4月—8月在南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心血管內科經常規(guī)氯吡格雷治療（負荷劑量300 mg，維持劑量75 mg/d）至少5 d 的CAD 患者78 例。入選標準：①年齡18～80 歲；②入院診斷為急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）、不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina pectoris，UA）或穩(wěn)定型心絞痛（stable angina pectoris，SA）；③簽署知情同意書。排除標準：①氯吡格雷過敏或不耐受者；②高出血風險患者（如血小板計數<80×109/L、活動性消化性潰瘍、近期腦外傷史等）；③計劃服用華法林或可能干擾氯吡格雷［如細胞色素P450 3A（cyto?chrome P450 3A，CYP3A）抑制劑或CYP3A 誘導劑等］抗血小板療效的藥物。本研究已在clinicaltrials.gov 網站注冊，ID號：NCT02447809。

光學血小板聚集儀（light transmittance ag?gregometry，LTA；540VS，Chronolog公司，美國），全自動血液分析儀（XS?500i，Sysmex公司，日本），高速離心機（Centrifuge 5810 R）、移液槍（Eppendorf 公司，德國），反應杯、攪拌磁棒（Chronolog 公司，美國），漩渦震蕩儀（上海青浦瀘西儀器廠），pH 計（上海儀電科學儀器股份有限公司），去離子水制水設備（Mer?ck Millipore 公司，德國），電泳儀（Bio?Rad 公司，美國），凝膠成像系統（上海天能科技有限公司），Agi?lent 2200TapeStation（Agilent Technologies 公司，美國），Qubit 2.0（Life Technologies 公司，美國），Hiseq 2500（Illumina 公司，美國），臺式低溫高速離心機、分光光度計、水浴鍋（Thermo Fisher Scientific 公司，美國），磁珠分選磁鐵架（Miltenyi Biotec 公司，德國），電子天平（Mettler Toledo公司，瑞士），凈化工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），制冰機（SANYO公司，日本），Illumina Hiseq 2500測序儀（Illumina公司，美國）。

TRIzol（Invitrogen 公司，美國），mirVanaTMmiR?NA Isolation Kit（Life Technologies 公司，美國），CD45 MicroBeads，human（Miltenyi Biotec 公司，德國），Small RNA Sample Prep Kit（Illumina 公司，美國），終濃度為5 μmol/L 的ADP（Chronolog 公司，美國），氫氧化鈉、鹽酸、冰醋酸（上海凌峰化學試劑有限公司），乙二胺四乙酸、瓊脂糖、MOPS、PBS 粉劑（合肥Biosharp公司），枸櫞酸鈉（西隴化工股份有限公司），無水乙醇、甲醛（上海國藥集團化學試劑有限公司），DEPC 水（Invitrogen 公司，美國），甲酰胺（上海麥克林生化科技有限公司），5 mL枸櫞酸鈉1∶9 抗凝的采血管（BD 公司，美國），CD45 抗體、LD 磁珠分選柱（Miltenyi Biotec 公司，德國），0.22 μm無菌濾器（Merck Millipore公司，德國）。

1.2 方法

1.2.1 血小板聚集率測定

在患者服用氯吡格雷后2.5 h，用含3.2%枸櫞酸鈉抗凝管采集肘靜脈血樣8 mL，并于標本采集后2 h內完成LTA 法血小板聚集功能檢測，具體方法如下：在常溫下將采集的血標本以200g離心8 min，用移液槍緩慢抽取離心后血標本的上清液以獲取富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）；用全自動血液分析儀檢測PRP中的血小板計數；將吸取PRP后剩余的血樣常溫下以2 460g離心10 min，用移液槍緩慢抽取血標本的上清液以獲取貧血小板血漿（platelet poor plasma，PPP）；用PPP 作為稀釋液將PRP中的血小板濃度稀釋至250×109/L（如PRP中的血小板濃度在250×109/L以下，則無需稀釋）；向PRP中加入2.5 μL終濃度為5 μmol/L的ADP，測定8 min最大血小板聚集率。

參照CREST研究，將ADP誘導的血小板聚集率（platelet aggregation induced by adenosine diphos?phate，PLADP）大于上四分位數定義為氯吡格雷低反應性［7］，小于下四分位數者設為對照組。

1.2.2 血小板純化與RNA提取及變性電泳

在患者進行冠狀動脈造影時，經鞘管采集15 mL動脈血于枸櫞酸鈉抗凝管，以200g離心10 min，移取上層PRP，用免疫磁珠法分選白細胞與血小板比例低于1∶5 000 000 的純化血小板（具體操作參考CD45 MicroBeads LD 磁珠分選柱的說明書）。用TRIzol 裂解上述純化血小板，再用mirVanaTMmiR?NA Isolation Kit 提取裂解后血小板中的總RNA（具體操作參考TRIzol 及mirVanaTMmiRNA Isolation Kit說明書），最終將每份樣本的總RNA 溶解于20 μL無RNase 的的DEPC 水中置-80 ℃冰箱儲存。通過Nanodrop 分光光度計檢測每個樣本總RNA 的濃度及260 nm/280 nm 的吸光度（OD）比值，確認每個總RNA 樣本的OD 比值均在1.8～2.0 之間。按上述分組結果，將氯吡格雷低反應組和對照組患者的總RNA 分別混為2 個RNA 池。分別從2 組RNA 池中取RNA樣本1.5 μg，按照相應配比加入10×MOPS、甲醛、甲酰胺并混勻，用1%瓊脂糖凝膠進行變性電泳。

1.2.3 測序文庫的構建及測序

每例樣本取1.5 μg 總RNA 行15%尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后對18～32 nt片段進行切割、洗脫、純化回收。采用Small RNA Sample Prep Kit（Il?lumina，美國）構建小RNA文庫。純化后的小RNA序列采用T4 RNA連接酶將接頭引物分別連接至2個文庫的序列5′端和3′端，逆轉錄合成cDNA 第一鏈，PCR建立小RNA文庫。利用Illumina HiSeq 2500測序平臺對該文庫進行高通量測序。

1.2.4 小RNA數據處理和信息分析

測序所得長度為51 nt 的小RNA 序列通過去接頭、去除低質量和污染序列，最終獲得18～32 nt的高質量小RNA 序列。統計小RNA 的種類、數量及長度分布，初步判斷小RNA質量。采用mirdeep2軟件將所得小RNA序列與參考基因組進行比對分析，再將匹配序列分別與GenBank 和Rfam 10.0 數據庫進行對比，篩選出miRNA 序列并分類注釋，分析其表達情況。

1.2.5 miRNA差異表達分析

將樣本中的miRNA 表達量標準化為TPM（tags per million），應用EdgeR 軟件對2 對樣本已知miR?NA表達差異分析統計。將“差異倍數”絕對值≥2且P<0.05的miRNA定義為差異表達的miRNA。差異倍數=Log2（氯吡格雷低反應組miRNA 標準化的表達量/對照組miRNA標準化的表達量）。

1.3 統計學方法

計量資料經正態(tài)檢驗符合正態(tài)分布者采用均數±標準差（）表示，兩組計量資料的比較采用獨立樣本的t檢驗；不符合正態(tài)性分布者用中位數與四分位數［M（P25，P75）］表示，組間比較采用非參數檢驗中的秩和檢驗；計數資料以百分率表示，計數資料比較采用χ2檢驗或Fisher’s精確檢驗。所有數據采用SPSS 20.0 統計學處理，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床基線資料及患者分組

根據入選患者的PLADP結果計算出四分位數P25=19.5%，P75=48.5%。選取PLADP＞48.5%的氯吡格雷低反應性患者19例為低反應組，為了更明顯地篩選出血小板miRNA 表達譜的差異，將PLADP<19.5%的19 例患者設為對照組。兩組患者的臨床基線特征包括年齡、性別、體重指數、臨床診斷、既往史及合并用藥等均無統計學差異（表1）。兩組患者住院期間的生化指標包括紅細胞計數、白細胞計數、尿素氮、丙氨酸氨基轉移酶、射血分數等亦無顯著的統計學差異（表2）。

表1 患者臨床基線特征Table 1 Baseline clinical characteristics of the patients

表2 患者住院期間的生化指標Table 2 Biochemical indexes of the patients during hospitalization

2.2 住院期間的血小板聚集率

氯吡格雷低反應組和對照組的PLADP分別為54.8%±5.3%vs.13.3%±4.4%，組間存在統計學差異（P<0.000 1，圖1）。

圖1 兩組患者血小板聚集率Figure 1 Platelet aggregation in the two groups

2.3 血小板總RNA的變性電泳

經Nanodrop分光光度計檢測，氯吡格雷低反應組的血小板總RNA 池OD值為2.0，濃度為30.3 ng/μL。對照組的血小板總RNA 池OD 比值為1.9，濃度為41.8 ng/μL。從RNA 變性電泳圖可以看出血小板總RNA 中miRNA 分布區(qū)的條帶清晰，無明顯降解（圖2）。

圖2 血小板總RNA的變性電泳圖Figure 2 Denaturation electrophoresis of platelet total RNA

2.4 兩組患者血小板miRNA表達譜差異

通過高通量測序發(fā)現兩組患者有95 種血小板miRNA 表達上存在顯著差異，其中顯著性下調的、差異倍數>2、拷貝數前20 位的miRNA 依次是hsa?miR?300、hsa?miR?151b、hsa?miR?1299、hsa?miR?16?1?3p、hsa?miR?3150b?3p、hsa?miR?548am?3p、hsa?miR?1260a、hsa?let?7f?2?3p、hsa?miR?4755?3p、hsa?miR?3144?3p、hsa?miR?5004?3p、hsa?miR?6862?5p、hsa?miR?1288?3p、hsa?miR?4661?5p、hsa?miR?4479、hsa?miR?4421、hsa?miR?6788?3p、hsa?miR?188?5p、hsa?miR?6874?3p、hsa?miR?218?5p（表3）。

表3 大于2倍拷貝數下調的miRNA（前20 位）Table 3 2?fold down?regulated miRNAs（top 20）

2.5 靶基因預測

通過靶基因預測軟件TargetScan、miRanda、PI?TA 和miRWalk 對上述顯著性下調的、差異倍數>2、拷貝數前20 位miRNA 的靶基因進行預測，并從中篩選出至少被2個靶基因預測軟件預測對血小板聚集關鍵蛋白（P2Y12 受體、Gi2α蛋白、血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受體）可能有調控作用的miRNA；結果發(fā)現血小板miRNAs中的hsa?miR?188?5p、hsa?miR?6874?3p對P2Y12受體基因的表達可能具有調控作用；hsa?miR?218?5p、hsa?miR?3150b?3p、hsa?miR?1288?3p、hsa?miR?1299、hsa?miR?6862?5p 對Gi2α蛋白基因的表達可能具有調控作用；hsa?miR?6862?5p、hsa?miR?188?5p、hsa?miR?4421對血小板糖蛋白Ⅲa受體基因的表達可能具有調控作用；對于血小板糖蛋白Ⅱb受體，結果未發(fā)現同時被至少被2 個靶基因預測軟件預測到的交集miRNA（表4）。

表4 血小板miRNA靶基因預測Table 4 Target gene prediction of platelet miRNA

3 討 論

目前，阿司匹林與氯吡格雷雙聯抗血小板治療被廣泛應用于ACS患者［1，8-10］，較之新一代ADP受體拮抗劑替格瑞洛，氯吡格雷在年齡≥75 歲的老年患者、腎功能不全、血小板計數偏低等特殊ACS 患者中使用更為安全［11］。但研究發(fā)現在服用氯吡格雷常規(guī)劑量的患者中CLR發(fā)生率>20%［12］，且CLR患者血栓事件發(fā)生率顯著增高［5］。研究發(fā)現CLR與細胞色素P450 2C19（cytochrome P450 2C19，CYP2C19）基因多態(tài)性、糖尿病、吸煙、肥胖、腎功能不全、血清堿性磷酸酶、血尿酸等多種因素相關［13-18］，但基因變異等已知因素僅可解釋約12%的個體反應差異，探討CLR的未知相關因素一直是近年來的研究熱點。

Chen等［19］發(fā)現與健康對照相比，支架植入術后接受抗血小板治療（阿司匹林聯合氯吡格雷或替格瑞洛或西洛他唑）的患者中miR?365?3p表達水平與抗血小板治療的反應性相關；Chen S 等通過檢測血管舒張刺激磷蛋白計算血小板反應指數來評價健康對照與介入治療術后冠心病患者對氯吡格雷的反應性，發(fā)現miRNA?26a 與氯吡格雷低反應性相關［20］；Nagalla 等［6］發(fā)現在血小板高反應與正常反應的健康人中有74種血小板miRNA 存在表達水平的差異，并發(fā)現miR?200b、miR?495和miR?107可通過特異性識別各自的靶mRNA 來調控血小板相應蛋白的表達。因入選對象、血小板miRNA 提取方法、血小板功能檢測方法、miRNA 測序方法等存在差異，上述不同研究篩選出的與血小板反應性相關的血小板miRNA不盡相同。

本研究通過如下方面在一定程度上避免了相關偏倚對實驗結果造成的影響：①參考相關研究共入選38例CAD患者［6］，氯吡格雷低反應組與對照組患者的臨床基線特征與生化指標均無顯著的統計學差異。②采取了免疫磁珠法高效地純化血小板后，提取的血小板miRNA又經Nanodrop分光光度計及變性電泳質控。③采用的光比濁法血小板功能檢測可特異性地反映ADP通道被抑制的水平［21］，是目前血小板聚集功能檢測的“金標準”［22］，也是國際相關共識推薦的檢測方法之一［23］。POPULAR 研究比較了光比濁法、VerifyNow P2Y12、Plateletworks、IMPACT?R、PFA?100、改良PFA P2Y 共6 種血小板功能檢測方法，結果提示，光比濁法是對臨床終點有預測價值的3種血小板功能檢測方法之一［24］。④選取的Illumina HiSeq 2500 測序平臺是一個功能強大的高通量測序系統，可獲得高質量數據，是目前高通量測序領域主導的檢測方法之一［25］。

與對照組相比，CLR患者中有95種血小板miR?NA 表達上存在顯著差異；通過查詢靶基因預測軟件TargetScan、miRanda、PITA 和miRWalk，篩選出了至少被2個靶基因預測軟件預測對血小板聚集關鍵蛋白（P2Y12 受體、Gi2α蛋白、血小板糖蛋白IIb/IIIa受體）可能有調控作用的miRNA。在這些miRNA中，已有研究證實miR?218?5p 與凝血功能相關，但具體機制還有待進一步研究［26］。這些差異表達的miRNAs 有望成為血小板反應性特異性生物學標志物，也可能用于預測作用于相同位點的新型抗血小板藥物的反應性。

綜上所述，本研究通過高通量測序探討了CLR的CAD患者血小板miRNA的表達差異，并篩選出了8個對血小板聚集關鍵蛋白可能有調控作用的miR?NA。隨著血小板miRNA 對血小板和其他細胞（包括血管內皮細胞、心肌細胞等）以及l(fā)ncRNA（long non?coding RNA）、circRNA、miRNA、mRNA 之間的調控網絡的進一步完善，miRNA在抗栓治療中的調控作用可能會為個體化抗血小板治療提供新的干預手段，值得進一步深入研究。