潘 楊，王勝男，王臣慈，盛莉莉，谷生麗

(1.皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學院 a.生物化學與分子生物學教研室；b.醫(yī)學寄生蟲學教研室，安徽 蕪湖 241002)

結直腸癌(colorectal carcinoma，CRC)是常見的消化道惡性腫瘤之一，其病死率居世界第三位，已成為一種嚴重威脅健康的惡性疾病[1]。盡管目前針對結直腸癌的靶向治療使患者的總體生存率顯著提高，但仍有近半數(shù)患者死于復發(fā)或轉移[2]。因此，探究結直腸癌的潛在治療靶點具有重要的臨床意義。程序性死亡配體1(programmed death-ligand 1，PD-L1)又稱CD274或B7-H1，是免疫卡控點的重要成員，可與程序性死亡受體1(programmed death-1，PD-1)結合，傳導T細胞抑制性信號，介導腫瘤的免疫逃逸[3]。眾多研究表明，PD-L1可在腎細胞癌[4]、乳腺癌[5]、非小細胞肺癌[6]等多種惡性腫瘤中表達升高，并與患者的生存預后密切相關，但對結直腸癌的報道較少。因此，本研究旨在分析PD-L1在結直腸癌組織中的表達及與臨床預后的相關性，從而為腫瘤的免疫治療提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料 收集2013年12月～2015年12月入住弋磯山醫(yī)院腫瘤內(nèi)科并接受D2根治術的100例結直腸癌患者，所有患者術前均未行放化療，術后病理均證實為結直腸腺癌，病理和隨訪資料完整。100例患者中男性54例，女性46例；年齡34～80歲，中位年齡62歲；右半結腸癌19例，左半結腸癌24例，橫結腸癌9例，直腸癌48例；有淋巴結轉移者34例，無淋巴結轉移者66例；有脈管浸潤者38例，無脈管浸潤者62例；大體類型：潰瘍型70例，隆起型30例；分化程度：中分化87例，低分化13例；美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期57例，Ⅲ期34例。采用電話、門診等方式長期隨訪，時間截止于2020年10月，所有患者的腫瘤組織石蠟標本均取自病理科。隨機抽取20例患者的癌旁組織石蠟標本(距手術切緣>5 cm)作為對照組，其中男性11例，女性9例；年齡34～76歲，中位年齡66歲。

1.2 方法 石蠟標本均經(jīng)5 μm厚連續(xù)切片、40℃水溫攤片和60℃ 1 h 烤片制成切片后，再用PV-6000通用型免疫組化試劑盒檢測PD-L1的表達情況。其中PD-L1兔單克隆抗體的工作濃度為1∶100；陰性對照為PBS代替一抗，陽性對照為扁桃體陽性切片。

1.3 結果判讀 細胞膜和(或)細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為PD-L1陽性。根據(jù)陽性細胞所占腫瘤細胞總數(shù)的百分比(tumor proportion score，TPS)，將5%定義為腫瘤組織中PD-L1陽性[7]。以上結果均由2名高年資病理醫(yī)師獨立評估，不一致時由第3名病理醫(yī)師判決。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。χ2檢驗用于計數(shù)資料分析，Kaplan-Meier法用于生存分析，Cox風險回歸模型用于預后的單因素和多因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PD-L1在結直腸癌組織及癌旁組織中的表達情況 PD-L1主要定位于細胞膜，呈棕黃色顆粒，見圖1。結直腸癌組織的PD-L1陽性表達率高于癌旁組織[40.00%(40/100)vs.15.00%(3/20)]，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.530，P=0.033)。

A.PD-L1在結直腸癌旁組織陰性表達(×400)；B.PD-L1在結直腸癌組織陽性表達(×400)。

2.2 PD-L1與結直腸癌患者生存預后的相關性 100例結直腸癌患者的中位隨訪時間為65.5個月(0～82個月)。Kaplan-Meier生存分析顯示，PD-L1陽性者的平均總生存期(OS)較陰性者縮短[(52.15±4.61)月vs.(71.55±2.80)月]，且5年生存率也降低[45.00%(18/40)vs.80.00%(48/60)]，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。由于PD-L1陰性組的死亡患者未過半，我們無法比較兩組的中位OS。亞組分析顯示，以淋巴結轉移數(shù)目分組時，N0和N1亞組中PD-L1陽性者的OS縮短(P<0.05)；再以TNM分期分組時，Ⅱ期亞組中PD-L1陽性者的OS也縮短(P<0.05)，見圖3、4。由于Ⅰ期患者數(shù)量過少，我們僅作Ⅱ期和Ⅲ期的分析，此外，N2和Ⅲ期亞組中PD-L1陽性者的OS雖有下降，差異卻無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖2 PD-L1表達與結直腸癌患者OS的關系

A.兩組患者中N0亞組的生存曲線；B.兩組患者中N1亞組的生存曲線；C.兩組患者中N2亞組的生存曲線。

A.Ⅱ期亞組的生存曲線；B.Ⅲ期亞組的生存曲線。

2.3 結直腸癌預后危險因素的分析 單因素Cox回歸分析顯示，性別、有無淋巴結轉移以及PD-L1表達情況與結直腸癌的預后存在相關性(P<0.05)。根據(jù)單因素分析結果，我們以P<0.10的標準進行多因素Cox回歸分析。結果顯示，有淋巴結轉移或脈管轉移以及PD-L1表達陽性是結直腸癌預后的獨立危險因素(P<0.05)，見表1、2。

表1 單因素分析結直腸癌的預后危險因素

3 討論

人體免疫系統(tǒng)可識別、清除腫瘤細胞，發(fā)揮免疫監(jiān)控效應；但腫瘤細胞自身也可表達免疫卡控點分子誘導T細胞衰竭，發(fā)揮免疫逃逸效應[8]。PD-1是免疫球蛋白超家族成員，具有胞外IgV結構域、跨膜結構域以及免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)和轉換基序(ITSM)組成的細胞漿尾區(qū)，主要表達于T細胞、B細胞、NK細胞等免疫細胞表面[9]；而PD-L1是免疫卡控點重要成員，主要表達于活化的T細胞、B細胞、DC細胞或經(jīng)細胞因子(IFN、TNF等)刺激的上皮、間質(zhì)、免疫等細胞[10]。當PD-1與PD-L1結合時，可激活ITIM和ITSM基序使下游效應分子PI3K去磷酸化，從而抑制T細胞活化所需的基因和細胞因子的轉錄、翻譯過程[11]。

鑒于PD-1/PD-L1信號通路是腫瘤免疫逃逸的重要途經(jīng)，研究設計免疫卡控點的抑制劑成為免疫治療的新方向。目前已有多項研究表明，PD-L1在非小細胞肺癌、惡性黑色素瘤、腎癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達升高，發(fā)揮免疫負性調(diào)節(jié)作用，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。Qing等[13]用免疫組化法分析了107例胃癌組織中PD-L1和APE1表達及與生存預后的關系，發(fā)現(xiàn)PD-L1和APE1高表達是胃癌預后的危險因素；而Jung等[14]也用免疫組化法分析了85例肝癌組織中PD-Ls(PD-L1和PD-L2)表達及與生存預后的關系，發(fā)現(xiàn)PD-Ls高表達是肝癌預后的危險因素。由此推測，PD-L1可能是判斷癌癥預后的重要參考指標。

關于PD-1/PD-L1與結直腸癌預后的研究尚有爭議。復旦大學蔡三軍[15]團隊分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中356例結直腸癌標本，發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1高表達患者的預后更好；然后用免疫組化法檢測了276例結直腸癌標本中腫瘤細胞PD-L1(TCs-PD-L1)和腫瘤浸潤淋巴細胞PD-1(TILs-PD-1)的表達水平，發(fā)現(xiàn)TCs-PD-L1和TILs-PD-1均與患者OS呈正相關，且TILs-PD-1是結直腸癌的獨立預后因素。反之，Li等[16]對檢索的10項PD-L1與結直腸癌預后關系的研究進行了Meta分析，發(fā)現(xiàn)PD-L1表達升高可能提示結直腸癌預后不良。為了進一步探究PD-L1對不同亞型結直腸癌預后的影響，Droeser等[17]將1 491例結直腸癌患者根據(jù)有無錯配修復(MMR)缺陷進行分組，發(fā)現(xiàn)MMR陽性伴PD-L1高表達提示生存期延長；Koganemaru等[18]將235例結直腸癌患者根據(jù)PD-L1的表達細胞進行分組，發(fā)現(xiàn)TCs-PD-L1高表達提示生存期縮短，而TILs-PD-L1高表達則提示生存期延長。由此可見，國內(nèi)外針對PD-L1與結直腸癌預后關系的研究缺乏共識，我們有必要對中國地區(qū)結直腸癌患者PD-L1的表達及與臨床預后的相關性進行深入探討。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PD-L1在結直腸癌組織中的表達水平高于癌旁組織(40.00%vs.15.00%，P=0.033)，且陽性患者的平均OS(52.15月vs.71.55月，P=0.000)和5年生存率(45.00%vs.80.00%，P=0.000)均降低。根據(jù)淋巴結轉移數(shù)目和TNM分期進行分組時，發(fā)現(xiàn)N0、N1和Ⅱ期亞組中PD-L1陽性患者的OS均低于陰性患者(P<0.05)；而N2和Ⅲ期亞組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)?？紤]原因可能是樣本量過小導致結果不能反映總體，還需擴大樣本進一步分析。單因素分析顯示，女性結直腸癌患者的預后更差，這與Yang等[19]結論一致，即女性結直腸癌患者可能受內(nèi)源性激素作用存在較高的死亡風險；而多因素分析顯示，有淋巴結轉移或脈管轉移以及PD-L1表達陽性是結直腸癌預后的獨立危險因素(P<0.05)，至于分化程度和TNM分期不能影響結直腸癌預后的原因可能是病理醫(yī)師存在主觀評估的差異。鑒于PD-L1對抗腫瘤免疫反應的影響，我們推測高表達的PD-L1可能促進結直腸癌的淋巴結轉移，這與Kamiya等[20]結論一致，即TCs-PD-L1高表達是皮膚鱗狀細胞癌淋巴結轉移的危險因素。

綜上所述，我們認為PD-L1是判斷結直腸癌臨床預后的重要參考指標，并可能影響腫瘤的生長、侵襲、轉移等生物學行為，但其確切的作用機制還有待于進一步探索。