仲津漫，丁健科，鄧 蕾，向 穎，劉朵朵，楊全新

（1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，陜西西安 710004；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科，陜西西安 710032）

前列腺癌是嚴(yán)重威脅男性健康的泌尿生殖系惡性腫瘤[1]。早期多數(shù)前列腺癌患者對雄激素剝奪治療有效，但在歷經(jīng)3~5年的緩解期后，約20%的患者會由激素依賴性前列腺癌（androgen-dependent prostate cancer,ADPC）發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌（castra?tion-resistant prostate cancer,CRPC）[2]。CRPC患 者極易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，生存率較低。在前列腺癌發(fā)展為CRPC早期，如能在分子水平及早發(fā)現(xiàn)并給予有效治療方案，可延緩腫瘤進(jìn)展速度，延長患者生存期，提高患者終末期生活質(zhì)量。

適配體是一段由短鏈RNA或單鏈DNA（singlestranded DNA,ssDNA）折疊形成的具有特定二維或三維結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸[3]。與抗體類似，適配體能以高親和力、高特異性結(jié)合相應(yīng)靶標(biāo)，此外，適配體還具有分子量小、低免疫原性、高組織滲透性、高穩(wěn)定性等獨(dú)特優(yōu)勢。適配體通過指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（system?atic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）篩選[4]。細(xì)胞SELEX（Cell-SELEX）是以完整活細(xì)胞為靶標(biāo)篩選適配體，Cell-SELEX無需預(yù)先確定分子靶標(biāo)就可篩選出靶向該種細(xì)胞的特異性適配體。本研究利用Cell-SELEX技術(shù)篩選特異性靶向CRPC細(xì)胞的適配體，并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)等一系列實(shí)驗，研究所篩選的適配體對CRPC組織細(xì)胞的靶向性和親和性，以期為CRPC的早期診斷和靶向治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑人前列腺癌細(xì)胞系LNCap（ADPC細(xì)胞系）、C4-2（CRPC細(xì)胞系）購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞庫，鏈霉親和素磁珠購自蘇州海貍納米科技有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基均購自Gibco公司，進(jìn)口胎牛血清購自ZETA LIFE公 司，DNA Marker（DL 2000）購 自TaKaRa公司，其他試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純試劑。

PCR儀（Bio-Rad美國），磁性分離器（西安金磁納米生物技術(shù)有限公司），流式細(xì)胞儀（BD美國），激光共聚焦熒光顯微鏡（Nikon日本），熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympus日本）。1.2 CRPC適配體篩選設(shè)計隨機(jī)單鏈DNA文庫及上、下游引物，其序列分別如下：DNA文庫TGCG?GCAGTTGAAGCAAGGC(N40)ACGGCAGCACCAGAGAACCA；上 游 引 物5’-TGCGGCAGTT?GAAGCAAGGC-3’；下游引物5’-TGGTTCTCTG?GTGCTGCCGT-3’；上游引物的5’端用FITC標(biāo)記，下游引物的5’端用生物素標(biāo)記；DNA文庫和引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，采用固相亞磷酸酰胺合成法，經(jīng)HPLC純化。

分別制備ADPC細(xì)胞系LNCap和CRPC細(xì)胞系C4-2的細(xì)胞懸液，置于超聲破碎儀作用60 min，所得產(chǎn)物作為PCR模板，行PCR擴(kuò)增。以C4-2細(xì)胞基因組作為正篩選的PCR模板，以LNCap細(xì)胞基因組作為負(fù)篩選的PCR模板，將每一輪次篩選得到的DNA產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化。用生物素-鏈霉親和素磁珠分離法將PCR產(chǎn)物分離后所獲得的產(chǎn)物用于下一輪次的篩選，共擴(kuò)增14個循環(huán)。用流式細(xì)胞儀監(jiān)測Cell-SELEX篩選進(jìn)程。

1.3 CRPC適配體的鑒定將最后一輪次篩選所得的DNA產(chǎn)物行PCR擴(kuò)增純化，PCR產(chǎn)物與pTOPO載體連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5a中進(jìn)行擴(kuò)增。隨機(jī)挑取60個單克隆，分別置于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后行菌液PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸凝膠電泳鑒定。將出現(xiàn)明顯目的條帶的菌液樣品送北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行DNA測序。用mfold預(yù)測目的DNA及核酸適配體的二級結(jié)構(gòu)。

采用單點(diǎn)吸附測定法獲得適配體的平衡解離常數(shù)。以流式細(xì)胞術(shù)熒光幾何平均值為縱坐標(biāo)，以適配體濃度為橫坐標(biāo)，根據(jù)公式Y(jié)=Bmax×X/(Kd+X)方程模擬曲線，分別計算所篩選適配體CRPC-1和CRPC-2的平衡解離常數(shù)。

1.4 檢測篩選出的適配體特異性靶向CRPC細(xì)胞的能力

1.4.1流式細(xì)胞術(shù)常規(guī)培養(yǎng)人前列腺癌細(xì)胞系LNCap和C4-2。取對數(shù)生長期的前列腺癌細(xì)胞，用胰酶消化，800 r/min離心5 min，棄上清，加入流式洗液重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，胎牛血清封閉30 min，加入200 pmol FITC標(biāo)記的適配體CRPC-1/CRPC-2溶液，充分重懸細(xì)胞，置于冰上孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測各細(xì)胞系分別與所篩選適配體的特異性結(jié)合情況。

1.4.2細(xì)胞免疫熒光檢測同樣取對數(shù)生長期的前列腺癌細(xì)胞LNCap和C4-2，分別接種于20 mm激光共聚焦培養(yǎng)皿中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全伸展并生長至培養(yǎng)皿底面積約75%時，吸棄上清液，PBS洗滌，向培養(yǎng)皿中加入40 g/L多聚甲醛固定15 min，50 g/L BSA室溫封閉1 h，用PBS洗滌后加入200 pmol FITC標(biāo)記的適配體CRPC-1/CRPC-2溶液，置于4℃避光孵育6~8 h，加入DAPI（1∶1 000）孵育5 min襯染細(xì)胞核，封片后置于激光共聚焦熒光顯微鏡下，觀察各細(xì)胞的熒光顯示比例。

1.5 檢測適配體CRPC-1對CRPC組織特異性結(jié)合的能力收集臨床確診的良性前列腺增生、早期前列腺癌及CRPC患者各2例，取各組患者病理組織浸泡于40 g/L多聚甲醛固定后，石蠟包埋組織塊，制作4 μm厚切片。經(jīng)抗原修復(fù)后，滴加適量50 g/L BSA完全覆蓋切片組織，室溫封閉1 h，然后滴加標(biāo)記FITC熒光基團(tuán)的適配體CRPC-1溶液，4℃避光孵育過夜；加入適量DAPI（1∶1 000）室溫孵育5 min襯染細(xì)胞核，封片后置于激光共聚焦熒光顯微鏡下，觀察3種前列腺病理組織的熒光顯示比例。

2 結(jié) 果

2.1 CRPC適配體的篩選情況利用Cell-SELEX技術(shù)從隨機(jī)單鏈DNA文庫中篩選與C4-2細(xì)胞特異性結(jié)合，而不與LNCap細(xì)胞結(jié)合的DNA序列，共篩選14輪；對每一輪篩選得到的DNA產(chǎn)物行流式細(xì)胞術(shù)檢測，觀察DNA產(chǎn)物與靶細(xì)胞特異性結(jié)合的相對熒光強(qiáng)度與相對細(xì)胞計數(shù)的結(jié)果顯示，隨著篩選次數(shù)的增加，DNA產(chǎn)物與C4-2細(xì)胞結(jié)合的熒光強(qiáng)度呈逐漸增強(qiáng)趨勢，而與LNCap細(xì)胞結(jié)合的熒光強(qiáng)度始終較低；相對熒光強(qiáng)度量化結(jié)果顯示熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1）。

圖1 CRPC特異性適配體Cell-SELEX的篩選Fig.1 The selection process of CRPC aptamer generation by Cell-SELEX

2.2 CRPC適配體的鑒定結(jié)果將經(jīng)過14輪次篩選后所得的DNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、連接、轉(zhuǎn)化并隨機(jī)挑取60個單克隆行菌液PCR及電泳鑒定，將出現(xiàn)明顯目的條帶的樣本送公司測序，去除未檢出、非單克隆序列、同源性序列，余下序列送上海生工生物工程有限公司合成，最后經(jīng)非變性核酸凝膠電泳鑒定，選取兩條序列作為目的適配體，分別命名為CRPC-1和CRPC-2，其序列及預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示。計算所篩選適配體的解離常數(shù)，分別為CRPC-1的解離常數(shù)為（4.9±1.6）nmol/L，CRPC-2的解離常數(shù)為（33.26±4.1）nmol/L（圖3）。

圖2 Cell-SELEX篩選所獲得的核酸適配體CRPC-1（A）和CRPC-2（B）的序列及二級結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Sequence and secondary structure prediction of aptamer CRPC-1（A）and CRPC-2（B）selected by Cell-SELEX

圖3 Cell-SELEX篩選所獲得的核酸適配體CRPC-1（A）和CRPC-2（B）的的解離常數(shù)Fig.3 Dissociation constants of aptamer CRPC-1（A）and CRPC-2（B）selected by Cell-SELEX

2.3 檢測適配體對CRPC細(xì)胞特異性結(jié)合的能力

2.3.1流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)ITC標(biāo)記的適配體特異性靶向前列腺癌細(xì)胞的CRPC-1和CRPC-2均可以與C4-2細(xì)胞特異性結(jié)合，結(jié)合熒光強(qiáng)度較高，而不能結(jié)合LNCap細(xì)胞；作為對照的隨機(jī)DNA文庫，對2種細(xì)胞均不能結(jié)合；相對熒光強(qiáng)度量化結(jié)果顯示，熒光強(qiáng)度組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4）。這提示篩選出的兩條適配體對CRPC細(xì)胞具有良好的靶向親和性。

2.3.2細(xì)胞免疫熒光將FITC標(biāo)記的適配體CRPC-1和CRPC-2分別與LNCap和C4-2細(xì)胞共孵育的激光共聚焦熒光顯微鏡下的觀察結(jié)果顯示，C4-2細(xì)胞表面可見明顯的熒光標(biāo)記，而LNCap細(xì)胞表面未見特異性熒光顯示（圖5），表明篩選出的2個適配體均能特異性結(jié)合CRPC細(xì)胞。

圖4流式細(xì)胞術(shù)檢測核酸適配體CRPC-1、CRPC-2對CRPC細(xì)胞的靶向親和性Fig.4 Binding affinity of aptamer CRPC-1 and CRPC-2 to CRPC cell lines detected by flow cytometry

圖5細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗檢測核酸適配體CRPC-1、CRPC-2對CRPC細(xì)胞的靶向親和性Fig.5 Binding affinity of aptamer CRPC-1 and CRPC-2 to CRPC cell lines detected by immunofluorescence assay

2.4 檢測適配體CRPC-1對CRPC組織特異性結(jié)合的能力對3種前列腺病理組織的免疫熒光染色的分析發(fā)現(xiàn)適配體CRPC-1能使CRPC組織特異性染色，而對良性前列腺增生組織及早期前列腺癌組織染色不明顯（圖6）。提示篩選出的適配體CRPC-1能特異性識別并結(jié)合CRPC組織。

3 討 論

最新數(shù)據(jù)表明，前列腺癌居全球男性癌癥發(fā)病率第三位，死亡率第五位，嚴(yán)重影響了男性的生命健康[5]。雄激素剝奪治療是目前前列腺癌治療的標(biāo)準(zhǔn)方法，其對于減少腫瘤負(fù)荷、降低前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen,PSA）水平具有重要意義[6]。但雄激素剝奪治療不能治愈前列腺癌，多數(shù)進(jìn)展期前列腺癌最終都會發(fā)展為CRPC[7]。

歐洲泌尿外科協(xié)會將CRPC定義為去勢后血清睪酮水平＜50 ng/dL并且合并三項之一的（生化進(jìn)展：1周內(nèi)連續(xù)3次PSA升高并且PSA＞2 ng/mL；或者影像學(xué)進(jìn)展出現(xiàn)新的轉(zhuǎn)移灶；或者患者癥狀進(jìn)展惡化[2]）。盡管體外細(xì)胞實(shí)驗可以明確鑒別激素依賴性與激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞，但在體內(nèi)難以實(shí)現(xiàn)CRPC的早期發(fā)現(xiàn)與診斷。多數(shù)CRPC患者在確診時已有明顯癥狀或出現(xiàn)生化進(jìn)展。由于發(fā)現(xiàn)時間晚，這類患者極易產(chǎn)生耐藥性，病情進(jìn)展快、死亡率高[8-9]。因此，從細(xì)胞分子水平早期診斷CRPC對于及時調(diào)整臨床用藥、改善前列腺癌患者預(yù)后、提高患者生存質(zhì)量至關(guān)重要。

圖6組織免疫熒光實(shí)驗檢測核酸適配體CRPC-1的CRPC組織特異性Fig.6 Binding affinity of aptamer CRPC-1 to CRPC tissues detected by immunohistofluorescence assay

腫瘤在進(jìn)展過程中伴隨的基因或蛋白的變異使得癌變細(xì)胞與正常細(xì)胞或其他腫瘤細(xì)胞之間存在分子水平上的差異，這些差異正是SELEX技術(shù)篩選適配體的分子基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的SELEX需要預(yù)先選定相應(yīng)靶標(biāo)才能進(jìn)一步行適配體篩選，而Cell-SELEX不需要準(zhǔn)確了解細(xì)胞表面的分子及其結(jié)構(gòu)信息，可以在未知標(biāo)志物的情況下用完整的活細(xì)胞作為靶標(biāo)獲取高特異性、高親和性的適配體[4,10]。因此，Cell-SELEX技術(shù)在疾病的早期診斷和靶向治療中極具應(yīng)用前景。目前，國內(nèi)外已有學(xué)者利用Cell-SELEX成功篩選出源于肝細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌以及結(jié)直腸癌細(xì)胞的適配體[11-15]，為后續(xù)相關(guān)腫瘤特異性診療方案的研究奠定了實(shí)驗基礎(chǔ)。

當(dāng)前，尚未見CRPC特異性分子靶點(diǎn)的報道，以CRPC特異性分子為靶點(diǎn)篩選CRPC適配體的方法難以實(shí)現(xiàn)。本課題利用Cell-SELEX技術(shù)，以激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞C4-2為靶細(xì)胞，以其同源激素依賴性前列腺癌細(xì)胞LNCap為負(fù)篩細(xì)胞，從隨機(jī)單鏈DNA文庫中篩選出可特異性結(jié)合CRPC細(xì)胞而不結(jié)合ADPC細(xì)胞的適配體，即特異性靶向CRPC細(xì)胞的適配體CRPC-1和CRPC-2，并經(jīng)一系列實(shí)驗研究證實(shí)CRPC-1和CRPC-2均能特異性結(jié)合CRPC組織細(xì)胞，而不與ADPC組織細(xì)胞結(jié)合。本研究證實(shí)這兩種適配體對CRPC組織細(xì)胞具有良好的靶向性和親和性，有望在分子細(xì)胞學(xué)水平將ADPC與CRPC相鑒別，進(jìn)而早期識別CRPC狀態(tài)，并為早期篩查CRPC提供了新思路和理論依據(jù)，為CRPC的早期診斷和靶向治療提供新方法，對及時調(diào)整前列腺癌治療方案、延緩腫瘤進(jìn)展速度、改善患者預(yù)后具有重要意義。