孫雷濤，杜德勇，李 勐，李澤福，張文生

（濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，山東濱州 256603）

早期準(zhǔn)確評(píng)估腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain micro?vascular endothelial cells,BMECs)的損傷程度對(duì)研究蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷機(jī)制至關(guān)重要[1]。外泌體是細(xì)胞外膜囊泡，大小為40~100 nm，可由多種細(xì)胞類型分泌，如T淋巴細(xì)胞、神經(jīng)元和BMECs[2-3]。外泌體中包含多種遺傳相關(guān)分子及蛋白，影響細(xì)胞增殖、凋亡和功能。外泌體同樣存在于腦脊液(cerebro?spinal fluid,CSF)循環(huán)中。由于CSF布滿中樞神經(jīng)系統(tǒng)并與受損組織廣泛接觸，被認(rèn)為是研究與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷相關(guān)的miRNAs的重要途徑[4]。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)人BMECs購(gòu)自美國(guó)Kirkland公司。BMECs培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，并置于37℃50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中。

1.2 建立BMECs損傷模型根據(jù)FINDLAY等[5]的方法制作人工血性腦脊液(BCSF)。在無(wú)菌條件下將正常血液與人工腦脊液按1∶1混合。于37℃水浴箱孵育7 d后取樣離心(10 000 g，20 min)。收集BMECs并儲(chǔ)存于4℃。將BMECs加入培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶培養(yǎng)24 h后加入無(wú)血清培養(yǎng)基同步，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和BCSF刺激組(BCSF 1、3、7、12 d組)。正常對(duì)照組加入正常腦脊液，BCSF各刺激組加入BCSF，共培養(yǎng)3 d后將這兩組細(xì)胞分別接種于96孔板（細(xì)胞密度為1×104/孔）。將空孔設(shè)置為空白對(duì)照；僅加相應(yīng)腦脊液而無(wú)細(xì)胞孔為陰性對(duì)照。均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.3 MTT法測(cè)定BCSF對(duì)BMECs增殖的影響各組完成相應(yīng)干預(yù)培養(yǎng)后，加入5 mg/mL MTT(20 μL/孔)。于37℃孵育4 h，加150 μL DMSO孵育15 min。于490 nm酶標(biāo)儀(Bio-Rad Laboratories,Inc)測(cè)定吸光度后，繪制細(xì)胞存活曲線。

1.4 細(xì)胞周期分析將密度為5×104/孔的BMECs于2 mL DMEM接種于6孔板，24 h達(dá)到70%融合，在無(wú)血清培養(yǎng)基中同步24 h，分為正常對(duì)照組和BCSF刺激組。孵育48 h，用細(xì)胞周期試劑盒(KeyGen Biotech Co,Ltd)檢測(cè)各組1×104個(gè)細(xì)胞的DNA含量。用ModFit LT 3.2軟件分析細(xì)胞周期分布，用BD FACS Calibur(BD Bioscience USA)對(duì)樣品進(jìn)行分析。

1.5 BCSF對(duì)BMECs中NO的影響采用還 原 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)依賴性硝酸還原酶結(jié)合酸性無(wú)色試劑檢測(cè)NOx、亞硝酸和硝酸的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物。50 μL血清樣本/亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)加入各組（正常對(duì)照組和BCSF刺激組）96孔微量滴定板中，于40 μL轉(zhuǎn)換緩沖與硝酸還原酶及10 μL NADPH搖勻，室溫孵育45 min，使硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽。樣品中總亞硝酸鹽由Griess分析測(cè)定。于540 nm測(cè)定吸光度，并從亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中亞硝酸鹽的總濃度[6]。

1.6 qRT-PCR及免疫熒光檢測(cè)BMECs功能蛋白表達(dá)正常對(duì)照組和BCSF刺激組細(xì)胞培養(yǎng)24 h。按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR，引物序列由SangonBiotech Co.Ltd設(shè)計(jì)并提 供：ZO-1(forward:5’-AGTGCC?GCCTCCTGAGTTTG-3’，reverse:5’-CCATCCT?CATCTTCATCATCTTCTACAG-3’)，VCAM-1(forward:5’-GAGGATGGAAGATTCTGGAATT?TACG-3’，reverse:5’-ATCACTAGAGCAGGT?CATGTTCAC-3’)，ICAM-1(forward:5’-GCCAC?TAACAATCACGCATAATG-3’，reverse:5’-TG?CTCACTGTAGTCCCTTCTG-3’)，β-actin(forward:5’-CCTGGCACCCAGCACAAT-3’，reverse:5’-GGGCCGGACTCGTCATAC-3’)。

用免疫熒光法分析各功能蛋白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和定位。正常對(duì)照組和BCSF刺激組孵育72 h，用DMEM培養(yǎng)基換洗后，40 g/L多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗滌；30 mL/L牛血清白蛋白孵育30 min，滴加一抗ICAM-1(1∶250)、VCAM-1(1∶100)和ZO-1(1∶400)，4℃過(guò)夜后，加二抗Alexa 488(1∶400,2 mg/mL；Proteintech Group,CHI,USA)孵育。熒光顯微鏡下觀察并捕捉圖像。

1.7 各組外泌體檢測(cè)及鑒定根據(jù)Total Exosome Isolation Kit分 離 試 劑 盒(Life Technologies,Carls?bad,CA)從正常對(duì)照組和BCSF刺激組的培養(yǎng)液中分離外泌體。將FBS液在80 000 r/min于4℃超速離心16 h，取上清液經(jīng)0.22 μm濾網(wǎng)無(wú)菌過(guò)濾。加入相應(yīng)各組，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至70%，收獲外泌體。將各組培養(yǎng)基于2 000 g離心20 min去除細(xì)胞/碎片，收集上清液，加入0.2倍上清液體積的分離試劑，將混合液于4℃孵化30 min，4 000 r/min離心10 min后，PBS洗。用透射電鏡對(duì)外泌體進(jìn)行陰性染色分析。取10 μL上清液加在銅網(wǎng)格上1 min，65℃烘干，在加速電壓80 kV的HT7700透射電子顯微鏡(HITA?CHI,Japan)下觀察。圖片使用了Gatan CCD(Gatan,Inc,US)軟件分析。在稀釋10倍后，用納米-zs90分析儀(Malvern,Worcestershire,UK)檢測(cè)到尺寸分布。

1.8 qRT-PCR檢測(cè)各組外泌體中miR-630的表達(dá)用SeraMir?外泌體RNA試劑盒(System Biosci?ences)從正常對(duì)照組和BCSF刺激組細(xì)胞培養(yǎng)液中分離總micoRNA。用Taqman MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher Scientific)合成cDNA后，用Taq?Man Fast Advanced Master Mix進(jìn) 行qRT-PCR檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。應(yīng)用生物系統(tǒng)SDS軟件(Applied Biosystems,Waltham,MA)對(duì)結(jié)果分析，以2-ΔΔCt為相對(duì)表達(dá)。U6為內(nèi)參。

1.9 miR-630 mimics體外干預(yù)對(duì)BMECs功能的影響使用Exo-Fect?外泌體轉(zhuǎn)染試劑盒(Cat#EXFT20A-1;System Biosciences,Inc.SBI,Mountain View,CA,USA)。轉(zhuǎn)染的外泌體重懸于300 μL PBS，應(yīng)用ECIS系統(tǒng)(75 μL加入細(xì)胞密度約為5×105/孔的12孔培養(yǎng)板，生長(zhǎng)于exosome-depleted的FBS)，達(dá)到滿意的外泌體濃度條件[7]。miR-630 mimics購(gòu)自Life Technologies公司(Grand Island,NY,USA)。qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染干預(yù)后miR-630的表達(dá)。

應(yīng)用Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染干預(yù)后各組ZO-1、ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)。BMECs生長(zhǎng)至50%時(shí)，暴露于轉(zhuǎn)染的外泌體中，應(yīng)用Mem-PER?Eukaryotic Membrane Protein Extraction Reagent(Thermo Fisher Scientific)共孵育12 h后，滴加一抗ICAM-1、VCAM-1、ZO-1（1∶2 000）和內(nèi)參β-actin（1∶5 000）(Proteintech Group,CHI,USA)，4℃過(guò)夜孵育進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用ECL增強(qiáng)系統(tǒng)(Millipore,America)進(jìn)行成像顯示。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對(duì)服從正態(tài)分布的多重比較采用Student’st檢驗(yàn)和nonparametric Mann-Whitney U檢驗(yàn)。所有其他數(shù)據(jù)分析都采用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism,ver?sion 7(GraphPad,LaJolla,CA)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BCSF對(duì)BMECs生存能力的影響MTT實(shí)驗(yàn)表明，隨著共孵育時(shí)間的延長(zhǎng)BCSF使細(xì)胞活力顯著降低，不同時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而培養(yǎng)12 d的生長(zhǎng)抑制率達(dá)到（78.34±9.22）%；流式細(xì)胞儀分析顯示，BCSF誘導(dǎo)BMECs細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期和G0/G1期的比例增加(14.32±4.28)%，G2/M期明顯下降(P=0.026，圖1)。

2.2 BCSF對(duì)BMECs功能的影響B(tài)CSF孵育24 h的BMECs中ICAM-1、VCAM-1和ZO-1的mRNA表達(dá)顯 著 降 低(P=0.01，P=0.01，P=0.03，圖2A)。免疫熒光染色結(jié)果顯示，BCSF組緊密連接蛋白ZO-1和黏附分子ICAM-1、VCAM-1在細(xì)胞膜表面的表達(dá)弱(圖2B)。放射免疫法檢測(cè)顯示，BCSF組BMECs產(chǎn)生NO從最初的（35.63±4.78）μmol/L到3 d時(shí)減低到（11.42±2.66）μmol/L；在3、7、12 d較對(duì)照組均顯著下降(P=0.01，P=0.01，P=0.02，圖2C)。

圖1血性腦脊液對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of BCSF on the viability of BMECs

圖2 BCSF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響Fig.2 The effect of BCSF on endothelial function

2.3 外泌體的形態(tài)學(xué)和生化特征改變透射電鏡分析顯示，從正常細(xì)胞培養(yǎng)基和BCSF處理的細(xì)胞培養(yǎng)基中分離出來(lái)的納米囊泡形態(tài)均勻，呈不典型的圓形或杯狀(圖3A)。利用納米zs90(Malvern)檢測(cè)到nano-AE PBS水溶液的粒徑分布顯示，對(duì)照組與BCSF組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.062)，＞85%所分離的外泌體粒徑為20~120 nm(圖3B)。

2.4 qRT-PCR檢測(cè)外泌體miR-630的表達(dá)BCSF處理組外泌體miR-630表達(dá)顯著降低，通過(guò)參數(shù)t檢驗(yàn)P＜0.05，經(jīng)Bonferroni校正后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.024，圖4A)。

2.5 補(bǔ)充外源性miR-630 mimics對(duì)BMECs功能的影響轉(zhuǎn)染的miR-630 mimics外泌體與BMECs共培養(yǎng)12 h，廣泛清洗細(xì)胞去除細(xì)胞外泌體后，使用熒光顯微鏡評(píng)估其攝取情況。結(jié)果顯示90%的BMECs含有綠色熒光外泌體，BMECs的胞內(nèi)定位主要在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中(圖4B)；與miR-630 mimics共培養(yǎng)的BMECs外泌體中miR-630表達(dá)顯著升高(P=0.01，圖4C)。Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-630 mimics的BMECs共培養(yǎng)的趨化 因 子ICAM-1、VCAM-1和ZO-1的 表 達(dá) 增 加(圖4D)。

圖3各組外泌體形態(tài)觀察（A）及粒徑比較（B）Fig.3 Morphological characterization(A)and analysis of particle size distribution(B)of the exosomes

圖4補(bǔ)充外源性miR-630 mimics對(duì)內(nèi)皮功能的影響Fig.4 Effects of exosomal miR-630 mimics on the function of BMECs

3 討 論

動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血(aneurysmal subarach?noid hemorrhage,aSAH)是一種極具破壞性的腦卒中之一。血管痙攣被認(rèn)為是遲發(fā)性腦缺血最重要的原因，但至今針對(duì)大血管的抗血管痙攣藥物(如尼莫地平、ET-1拮抗劑等)仍未獲得令人滿意的治療效果。近來(lái)研究認(rèn)為，腦微循環(huán)破壞是嚴(yán)重的SAH繼發(fā)事件，其潛在主要機(jī)制包括炎癥、氧化應(yīng)激損傷、血小板活化、長(zhǎng)期血管收縮和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[8]。神經(jīng)血管單位在維持正常腦功能中有至關(guān)重要的作用。內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的整體性維持著血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)的功能，其隨腦卒中進(jìn)展而改變。受損的微血管內(nèi)皮細(xì)胞引發(fā)一系列腦血管損傷，進(jìn)而加重BMECs損傷。近期研究表明，蛛網(wǎng)膜下腔出血后出現(xiàn)了BMECs分泌舒張因子功能障礙、緊密連接發(fā)生降解、細(xì)胞因子分泌紊亂、電解質(zhì)平衡紊亂等一系列病理變化[9]。而B(niǎo)MECs與早期腦損傷的確切關(guān)系尚不清楚。早期準(zhǔn)確評(píng)估BMECs的損傷程度對(duì)研究蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的機(jī)制至關(guān)重要。

外泌體是細(xì)胞外膜囊泡，為大小40~100 nm的小泡，可由多種類型細(xì)胞分泌，如T淋巴細(xì)胞、神經(jīng)元和BMECs。外泌體中包含多種遺傳相關(guān)分子及蛋白，影響細(xì)胞增殖、凋亡及功能。近年來(lái)研究表明，外泌體參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展，特別是神經(jīng)功能疾病的病理機(jī)制。VIRGINTINO等[10]觀察到人類腦血管系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)的一種奇妙現(xiàn)象，首次報(bào)道了腦內(nèi)皮細(xì)胞外小泡(ECV)的研究結(jié)果，在免疫熒光和共聚焦顯微鏡下顯示發(fā)芽微囊的尖端ECs與幾個(gè)長(zhǎng)而蛛絲狀網(wǎng)(如絲狀偽足)融合。2013年，一種腦內(nèi)皮細(xì)胞外泌體的分離和表征方法對(duì)其特征有了更深入的了解[11]。研究認(rèn)為，血腦屏障來(lái)源的ECV有不同生物信息功能，可能包含血腦屏障特異性生物標(biāo)記，參與了神經(jīng)血管單元內(nèi)部或外部的信息交流[12]。由于腦脊液浸潤(rùn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)并與受損組織接觸，腦脊液被認(rèn)為是與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷相關(guān)的miRNAs表達(dá)變化的極好來(lái)源。有研究對(duì)原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤患者的腦脊液進(jìn)行了miRNAs譜分析，發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-7819b和miR-92a的下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[13]。有研究認(rèn)為，miRNAs參與了不同類型中風(fēng)的病理生理學(xué)機(jī)制[14]；而有關(guān)miRNAs在出血性腦卒中發(fā)病中的作用卻知之甚少。最近的一項(xiàng)研究表明，體外miR-630在潛在阻塞性睡眠呼吸暫停和/或肥胖兒童中是血管功能和心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并識(shí)別治療靶點(diǎn)[15]。最近，有報(bào)道m(xù)iR-630發(fā)揮多效作用，影響細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡，從而在不同的細(xì)胞環(huán)境中充當(dāng)癌基因或腫瘤抑制因子[16]。已被證實(shí)miR-630是一種抑制癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的腫瘤抑制基因，在肺癌、乳腺癌和胰腺癌中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和 死 亡[17]，通 過(guò) 靶 向 癌 基 因LMO3、metadhesiin、CDC7激酶、IGF-1R發(fā)揮作用。

本研究采用FINDLAY等[5]的BCSF與微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)模型，此模型制作簡(jiǎn)單，易于成功。國(guó)內(nèi)陳志等[18]也應(yīng)用此方法成功建立實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血后內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。本研究選用內(nèi)皮舒張因子NO的釋放水平及反映血腦屏障作用的ZO-1、ICAM-1、VCAM-1為檢測(cè)指標(biāo)，結(jié)果顯示，BCSF使BMECs中ZO-1、ICAM-1、VCAM-1表達(dá)明顯降低，與以往研究相似；進(jìn)而成功分離了細(xì)胞培養(yǎng)基的外泌體，BCSF處理組所分泌的外泌體中，miR-630表達(dá)較對(duì)照組明顯降低；而應(yīng)用miR-630 mimics時(shí)，BMECs的功能出現(xiàn)一定的恢復(fù)。這提示蛛網(wǎng)膜下腔出血后BMECs外泌體中miR-630的低表達(dá)可能與內(nèi)皮功能下降有關(guān)。

近年來(lái)有對(duì)腦脊液的微小RNA的研究表明，出血組和正常組CSF中miR-1224-3-p和miR-1301表達(dá)明顯差異，而在血管痙攣組與非血管痙攣組的miR-27a-3p、miR-516a-5-p、miR-566、miR-1197的表達(dá)明顯差異[19]。而一項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈瘤破裂前后出現(xiàn)患者血清中miR-132-3p和324-3p的表達(dá)差異。但miRNA的具體功能尚不清楚，其細(xì)胞來(lái)源也無(wú)法確定。在SAH后的microRNA表達(dá)研究的許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所不同[20]。研究發(fā)現(xiàn)，阻塞性睡眠呼吸暫停兒童循環(huán)血漿細(xì)胞外微泡miR-630與內(nèi)皮功能障礙的關(guān)系。miR-630在血清外泌體中的表達(dá)可以直接反映內(nèi)皮細(xì)胞在肺動(dòng)脈中的功能[15]。我們前期對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血患者CSF中miR-630的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-630在CSF中的表達(dá)沒(méi)有明顯的差異。但CSF外泌體中miR-630的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測(cè)SAH后miR-630的表達(dá)是多源的，而miR-630在中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同細(xì)胞中的表達(dá)是不同的。miR-630在CSF外泌體中的表達(dá)更能反映BMECs功能的調(diào)控?？紤]到腦卒中過(guò)程極其復(fù)雜，治療目標(biāo)應(yīng)側(cè)重于預(yù)防保護(hù)BMECs結(jié)構(gòu)和功能的完整性。雖然尚需要更多的研究明確BMECs在腦卒中發(fā)病機(jī)制中的作用，但血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的外泌體干預(yù)措施可能為腦卒中提供一種有希望的治療方法。

本研究的不足之處：采取的BCSF與微血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)模型，在一定程度上反映了單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞的血管舒張及細(xì)胞間連接功能，在整體血管內(nèi)皮細(xì)胞功能上是有局限的；外泌體的分泌受外界影響因素較多，外泌體中miR-630的表達(dá)調(diào)節(jié)及下游調(diào)控靶點(diǎn)仍不清楚，仍需要臨床大樣本驗(yàn)證；研究中應(yīng)用miR-630 mimics作為干預(yù)，miRNA mimics是針對(duì)miRNA的成熟體設(shè)計(jì)并合成的小片段雙鏈miRNA，其作用與miRNA的成熟體相似。miRNA mimics通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)源miRNA的沉默作用，降低細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。但結(jié)構(gòu)略有不同，所以并不等同于miRNA或 成 熟 體miRNA。SAH后CSF外 泌 體 中miR-630的表達(dá)下降是內(nèi)皮細(xì)胞功能下降的結(jié)果還是原因仍需要進(jìn)一步佐證。但可以肯定的是，CSF的外泌體將成為蛛網(wǎng)膜下腔出血病理生理機(jī)制研究的一個(gè)很有前景的方向。