郭 鏡，陳 丹

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院康復(fù)科，遼寧錦州 121001）

宮頸癌是婦女中發(fā)病率較高的一種癌癥，嚴(yán)重影響婦女的身心健康[1]。Arm重復(fù)蛋白1（ARMCX1）是Arm蛋白家族的成員之一。文獻(xiàn)報(bào)道其在宮頸癌組織中呈高表達(dá)，但在正常宮頸組織中卻低表達(dá)，沉默ARMCX1能抑制siha細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮癌基因的作用[2-4]。miRNA是一類短鏈非編碼RNA，其長(zhǎng)度為18~22個(gè)堿基，通過(guò)對(duì)其靶mRNAs的降解或抑制蛋白翻譯而調(diào)控目的基因的表達(dá)。在宮頸癌中已發(fā)現(xiàn)許多miRNA參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[5-6]。文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-223在宮頸癌中具有抑癌基因作用，過(guò)表達(dá)miR-223能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[7-8]。然而，miR-223與ARMCX1在宮頸癌中是否存在靶向調(diào)控關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究明確miR-223對(duì)宮頸癌siha細(xì)胞增殖與侵襲影響以及對(duì)ARMCX1的調(diào)控作用，期望為宮頸癌的治療尋求新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象收集錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院2017年1月至2019年12月經(jīng)病理組織學(xué)確診的30例宮頸癌患者的癌組織和其對(duì)應(yīng)的癌旁組織（距相應(yīng)癌緣＞5 cm）。年齡25~74歲，平均55歲。按照2011年宮頸癌診斷行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[9]和宮頸癌FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)[10]進(jìn)行分 級(jí) 分 期。病 理 分級(jí)：1級(jí)11例，2級(jí)13例，3級(jí)6例。臨床分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期12例，Ⅲ期10例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：納入病例均為宮頸鱗癌患者；術(shù)前未接受放療或者化療；沒(méi)有其他基礎(chǔ)代謝病。排除標(biāo)準(zhǔn)：有基礎(chǔ)代謝病；病例為非宮頸鱗癌患者；術(shù)前接受放化療或影響標(biāo)本病理改變的藥物治療等。本研究通過(guò)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器人宮頸癌細(xì)胞siha購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于Invitrogen公司。鼠抗人ARMCX1抗體、鼠抗人β-actin抗體購(gòu)于Santa Cruz公司。CCK8檢測(cè)試劑盒、熒光素酶報(bào)告基因載體、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Promega公司，Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)于BD Biosciences；Transwell小 室 購(gòu) 于Millipore。miR-223模擬物、陰性對(duì)照NC mimic和真核表達(dá)質(zhì)粒GV230-ARMCX1（不含3'-UTR）、對(duì)照空載體GV230由上海吉瑪公司合成；miRNA提取、miRNA cDNA合成試劑盒和miRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒由上海吉瑪公司提供。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的siha細(xì)胞于100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在含50 mL/L二氧化碳、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合至70%~80%，按Lipofectamine 2000試劑說(shuō)明書操作，按后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別轉(zhuǎn)染siha細(xì)胞。將ARM?CX1-WT和ARMCX1-MUT熒光素酶報(bào)告基因與NC mimic或miR-223 mimic共轉(zhuǎn)染siha細(xì)胞48 h(NC mimic+WT組、miR-223 mimics+WT組、NC mimic+MUT組 和miR-223 mimics+MUT組)檢 測(cè)熒光素酶活性。將miR-223 mimic或NC mimic轉(zhuǎn)染至siha細(xì) 胞 中(NC mimic組和miR-223 mimics組)，轉(zhuǎn)染24 h進(jìn)行CCK8和Transwell實(shí)驗(yàn)。另將miR-223 mimic分 別 與GV230-ARMCX1或GV230-NC共 轉(zhuǎn)染siha細(xì)胞(miR-223+GV230-ARMCX組和miR-223+GV230-NC組)中，轉(zhuǎn) 染24 h進(jìn) 行CCK8和Transwell實(shí)驗(yàn)。

1.4 Real-time PCR檢測(cè)miR-223及ARMCX1的表達(dá)取1.1項(xiàng)中各組30 mg宮頸組織標(biāo)本，按照操作說(shuō)明書提取總RNA并測(cè)定RNA濃度。取RNA樣品1 μL，12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。miRNA逆轉(zhuǎn)錄和定量分析（37℃反應(yīng)60 min，85℃滅活5 min）。Real-time PCR檢測(cè)miR-223的表達(dá)，40個(gè)循環(huán)（95℃10 s，60℃20 s，72℃10 s）。同時(shí)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，以1 μL cDNA為模板，Real-time PCR檢測(cè)ARMCX1 mRNA的表達(dá)，40個(gè)循環(huán)（95℃10 s,95℃5 s，60℃15 s，72℃15 s）。用U6 RNA和GAPDH作內(nèi)參，計(jì)算2－ΔΔCt法觀察miR-223及ARM?CX1 mRNA的相對(duì)表達(dá)。

1.5 CCK8實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖和侵襲能力按1.3項(xiàng)分組轉(zhuǎn)染24 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。CCK8實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染24 h的siha細(xì)胞，加入96孔板（500個(gè)/孔），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁，每孔加10 μL CCK8試劑，37℃培養(yǎng)箱孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)A值(波長(zhǎng)450 nm)。分別檢測(cè)0、24、48、72 h的A值。Transwell實(shí)驗(yàn)：將無(wú)FBS的DMEM培 養(yǎng) 液和matrigel按8∶1混 合，取60 μL加入Transwell小室，培養(yǎng)箱中過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)前取無(wú)FBS的DMEM培養(yǎng)基100 μL加 到小室中，培 養(yǎng)30 min后，將 轉(zhuǎn) 染24 h的siha細(xì) 胞 懸 液200 μL加 到Millicell小室中，下室加入600 μL條件培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出小室，PBS漂洗2次，用棉簽擦去未穿膜細(xì)胞，甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下觀察拍照并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞的數(shù)目。

1.6 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-223和ARMCX1的關(guān)系根據(jù)TargetScan生物信息學(xué)軟件，預(yù)測(cè)miR-223與ARMCX1 3’UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，提示ARM?CX1可能是miR-223的直接靶基因。為證實(shí)該推測(cè)，按1.3項(xiàng)分組構(gòu)建了ARMCX1-WT和ARMCX1-MUT熒光素酶報(bào)告基因重組載體質(zhì)粒。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的各組siha細(xì)胞調(diào)節(jié)密度至1×105/mL接種24孔板，培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)48 h按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)螢火蟲熒光值和海腎熒光值。相對(duì)熒光素酶活性=螢火蟲熒光值/海腎熒光值。

1.7 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)將NC mimic組和miR-223 mimics組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，收集siha細(xì)胞并裂解提取總蛋白，測(cè)定濃度。用80 g/L SDSPAGE膠進(jìn)行電泳后將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在室溫條件下以50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，然后加入ARMCX1抗體（1∶1 000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。TBST緩沖液進(jìn)行5次洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h。ECL曝光。以β-actin作為內(nèi)參，目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。數(shù)據(jù)以（±s）表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布及方差齊性，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組之間差異的比較；多組之間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t方法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 宮頸組織中miR-223及ARMCX1的mRNA相對(duì)表達(dá)情況Real-time PCR結(jié)果顯示，miR-223在宮頸癌組織中的相對(duì)表達(dá)明顯低于癌旁組織（0.620±0.157vs.1.670±0.527），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=?10.614，P＜0.001）；而 宮 頸 癌 組 織 中ARMCX1的mRNA相對(duì)表達(dá)明顯高于癌旁組織（1.870±0.691vs.0.750±0.375），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.712，P＜0.001，圖1）。

圖1 宮頸癌組織中miR-223和ARMCX1的表達(dá)比較Fig.1 The relative expression of miR-223 and ARMCX1 in cervical cancer tissues

2.2 Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-223時(shí)的表達(dá)情況結(jié)果顯示，miR-223 mimics組miR-223的相對(duì)表達(dá)明顯高于NC mimic組(4.290±1.307vs.1.020±0.042)，差 異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義(t=4.337，P=0.049，圖2)。

圖2 Real-time PCR檢測(cè)siha細(xì)胞miR-223的相對(duì)表達(dá)Fig.2 The relative expression level of miR-223 in siha cells by Real-time PCR

2.3 miR-223靶向調(diào)控ARMCX1用TargetScan生物信息學(xué)軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示，miR-223與ARMCX1 3’UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，提示ARMCX1是miR-223的靶基因（圖3A）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與NC mimic+WT組相比，miR-223 mimics+WT組的熒光素酶活性(1.01±0.04vs.0.460±0.142)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=?6.457，P=0.016)，而NC mimic＋MUT組 與miR-223 mimics+MUT組的熒光素酶活性(1.03±0.67vs.0.720±0.489)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.100，P=0.382，圖3B）。提示miR-223可靶向作用于ARMCX1。

過(guò) 表 達(dá)miR-223時(shí)，Real-time PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-223 mimics組細(xì)胞中ARMCX1 mRNA及其蛋白表達(dá)為（0.440±0.067）、（0.300±0.086），均低于NC mimic組的（1.00±0.04）、（0.680±0.105），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=?12.824，P=0.001；t=?4.792，P=0.010，圖3C、3D）。說(shuō)明miR-223能直接靶向調(diào)控ARMCX1的表達(dá)。

圖3 miR-223靶向調(diào)控ARMCX1Fig.3 miR-223 targeted ARMCX1

2.4 轉(zhuǎn)染miR-223對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響CCK8結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，miR-223 mimics組細(xì)胞在48、72 h增殖能力受到明顯抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=?5.353，P=0.006；t=?3.754，P=0.020，圖4）。

圖4 CCK8檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-223的siha細(xì)胞增殖能力Fig.4 The proliferation ability of miR-223 overexpressed in siha cells detected by CCK8

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，miR-223 mimics組細(xì)胞穿膜數(shù)量（57.330±10.408vs.25.670±4.041）明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=?4.912，P=0.008，圖5）。

圖5 Transwell檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-223 siha細(xì)胞侵襲能力Fig.5 The invasion ability of miR-223 overexpressed in siha cells by Transwell

2.5 轉(zhuǎn)染GV230-ARMCX1及miR-223 mimics對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-223+GV230-ARMCX組細(xì)胞增殖能力在24、48、72 h較miR-223+GV230-NC組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.379，P=0.028；t=?3.895，P=0.018；t=3.153，P=0.034，圖6）。

圖6 CCK8檢測(cè)轉(zhuǎn)染GV230-ARMCX1及miR-223 mimics組siha細(xì)胞的增殖能力Fig.6 The proliferation ability of GV230-ARMCX1 and miR-223 mimics in siha cells detected by CCK8

Transwell實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 顯 示，miR-223＋GV230-ARMCX組 細(xì) 胞 穿 膜 數(shù) 為(64.00±7.937)，較miR-223+GV230-NC組的(41.67±7.638)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=?3.512，P=0.025，圖7）。

3 討 論

miRNA作為一類短鏈非編碼RNA，在人類多種惡性腫瘤中發(fā)揮癌基因/抑癌基因的作用，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的各種生物學(xué)過(guò)程[11-12]。文獻(xiàn)報(bào)道，miR-223在胃癌、肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤中低表達(dá)[13-15]，但在結(jié)直腸癌卻高表達(dá)[16]。因此，miR-223在不同的腫瘤中發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用。在本研究中，miR-223在宮頸癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織，推測(cè)miR-223在宮頸癌中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。進(jìn)一步在宮頸癌siha細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-223 mimic，結(jié)果發(fā)現(xiàn)宮頸癌siha細(xì)胞中miR-223的表達(dá)明顯升高，且細(xì)胞增殖和侵襲能力受到抑制，說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-223能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，在宮頸癌中作為抑癌基因發(fā)揮作用。

miRNA在人類腫瘤中主要通過(guò)與靶基因mRNA結(jié)合，以轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的方式抑制靶基因的表達(dá)或使靶基因降解，在細(xì)胞的分化、增殖、侵襲和凋亡等生物過(guò)程中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-223在胃癌中通過(guò)靶向調(diào)控Sp1基因表達(dá)來(lái)抑制胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)化的發(fā)生[13]。在乳腺癌中miR-223能夠靶向調(diào)控FOXO-1的表達(dá)來(lái)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖[15]。miR-223也可以靶向作用PDS5B來(lái)影響胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力[17]。說(shuō)明miR-223能夠通過(guò)調(diào)控多種靶基因參與多種腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。因此，我們猜測(cè)miR-223是否也能通過(guò)調(diào)控特定靶基因抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖與侵襲能力。Targetscan等多種生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，ARMCX1為miR-223的靶基因，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-223的siha細(xì)胞中ARMCX1 mRNA和蛋白表達(dá)均呈低表達(dá)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-223能夠有效抑制熒光素酶的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)miR-223能夠特異性地結(jié)合ARMCX1，ARMCX1為miR-223的靶基因。

ARMCX1位于Xq21.33-q22.2，是由一個(gè)外顯子編碼，具有兩個(gè)arm repeat結(jié)構(gòu)的Arm蛋白家族的成員之一[18]。文獻(xiàn)報(bào)道，ARMCX1在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，而在宮頸癌組織中呈高表達(dá)水平[19-20,3]。我們前期研究顯示，在宮頸癌siha細(xì)胞中沉默ARM?CX1后引起細(xì)胞周期S期阻滯，抑制siha細(xì)胞增殖。究其原因是沉默ARMCX1引起細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin E和cdc25A表達(dá)量下調(diào)[4]。本研究Real-time PCR結(jié)果顯示，ARMCX1 mRNA在宮頸癌組織中表達(dá)量明顯高于癌旁組織。而miR-223在宮頸癌組織中的表達(dá)水平低于癌旁組織。過(guò)表達(dá)miR-223的siha細(xì)胞中ARMCX1mRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。miR-223可以直接與ARMCX1 3'-UTR結(jié)合。另外，在過(guò)表達(dá)miR-223的siha細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GV230-ARMCX1，結(jié)果顯示，其可逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-223導(dǎo)致的對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的抑制。以上結(jié)果均表明，miR-223通過(guò)負(fù)調(diào)控ARMCX1影響宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

綜上分析，miR-223在宮頸癌細(xì)胞中低表達(dá)，扮演抑癌基因的角色。miR-223通過(guò)靶向調(diào)控ARM?CX1抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。本研究為進(jìn)一步探討miR-223在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。但本研究也存在不足，收集的臨床標(biāo)本數(shù)量相對(duì)較少，可能對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生偏倚。在后續(xù)研究中需要收集更多臨床樣本，以完善實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。