吳昌學，董艷軍，黃 赟，肖子宇，李 毅，齊曉嵐，官志忠，肖 雁

（1.地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室，貴州醫(yī)科大學分子生物學重點實驗室，貴州貴陽 550004；2.貴州省人民醫(yī)院，貴州貴陽 550004）

血管性癡呆(vascular dementia,VaD)是目前最常見的老年癡呆病之一，為缺血性、低灌注、出血性腦損傷等一系列心腦血管疾病導致的智能及認知功能障礙綜合征，相較于阿爾茨海默病發(fā)病機制的復雜性及臨床特點的不可逆性，其具有可逆性，故被稱為“可逆性癡呆”[1]。主要表現(xiàn)為認知功能的缺失或損傷，同時伴有語言、運動、空間及人格等方面的問題。硫化氫（hydrogen sulfide,H2S）作為新型氣體信號分子，其在體內主要以HS—形式存在。有學者的研究結果提示，H2S與神經系統(tǒng)及心腦血管疾病相關，H2S能增強中樞神經系統(tǒng)中海馬的長時程記憶及調控大腦細胞內的Ca2+濃度及pH水平[2-3]。雖然H2S對神經系統(tǒng)的生理功能的研究倍受關注，但是其對腦缺血的作用機制尚不明確。人神經母細胞瘤細胞（SH-SY5Y）是一種低分化的腫瘤細胞，顯示中等水平的多巴胺-β-羥基酶活性，細胞形態(tài)、生理及生化功能與正常神經細胞相似，有明顯的軸突。因其具有分化程度低、增殖快及形態(tài)穩(wěn)定等特點，常被用于神經系統(tǒng)疾病的相關研究[4-5]。因此，本研究以氧糖剝奪再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)后的SH-SY5Y細胞作為神經細胞的體外缺血再灌注損傷模型，探討H2S對神經細胞缺血再灌注損傷的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器NaHS購自Sigma公司（美國），牛血清、DMEM培養(yǎng)基、2.5 mL/L胰蛋白酶液及10×PBS均購自HyClone公司，二甲亞砜(DMSO)購自Gibco公司。Tris堿、甘氨酸PMSF、SDS、Tween-20、RIPA裂解液（強）購自碧云天生物有限公司。5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購自北京鼎國生物技術有限公司，顯影膠片購自Amersham公司（美國），蛋白Marker購自GeneTex公司，PVDF膜和ECL試劑購自美國Millipore公司。細胞凋亡檢測試劑盒（Annexin V-FITC/PI）購自上海貝博生物公司，anti-β-actin、GRP78、CHOP一抗購自Abcam公司（美國），anti-NFκBp65、COX一抗購自CST公司（美國），通用二抗購自Abmart公司。流式細 胞儀(美國BD公司)，ELX 800 UV酶 標儀(美國Bio-Tec公 司)，Western blotting跑 膠裝置(北京百晶生物技術有限公司)。實驗細胞采用SH-SY5Y細胞株，為本課題組穩(wěn)定保存。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)SH-SY5Y細胞培養(yǎng)方法參考文獻[6]，常規(guī)培養(yǎng)方法復蘇細胞，用DMEM高糖培養(yǎng)基（含100 mL/L胎牛血清）稀釋細胞后置37℃、50 mL/L CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2~3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞進行研究。

1.2.2OGD/R模型的制備使用課題組的常用方法[6]建立OGD/R模型：根據(jù)前期課題組氧糖剝奪各個時間的細胞毒性實驗結果，最終選取氧糖剝奪12 h再恢復正常培養(yǎng)24 h來進行實驗。取對數(shù)生長期細胞，消化分離，計數(shù)細胞后制成密度為1×108/L的細胞懸液，按接種于96孔板（100 μL/孔），37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。OGD/R組細胞用37℃預熱的PBS清洗2次（去含血清的高糖DMEM培養(yǎng)基）后加入不含血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于三氣培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)，氣體條件為37℃、930 mL/L N2、20 mL/L、50 mL/L CO2。培養(yǎng)12 h后換正常培養(yǎng)液，置于37℃50 mL/L培養(yǎng)箱內再培養(yǎng)24 h。

1.2.3NaHS對SH-SY5Y細胞的毒性作用NaHS組缺氧處理與OGD/R組相同，只是在恢復正常培養(yǎng)的同時分別給予終濃度為0.1、0.2、0.4、0.5、1.0、2.5、4.0 mmol/L的NaHS溶液 處理細 胞；對照（Control）組僅在37℃50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，不作OGD處理。各組細胞在進行相應處理后，均置于37℃50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)12 h，隨后在各孔內加入CCK-8試劑10 μL，再置 于37℃50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2 h，檢測各孔吸光度(OD)值，計算細胞存活率[6]。每組均設置6個復孔，實驗重復3次。根據(jù)活性檢測結果最終選取0.2、0.4、4.0 mmol/L 3個濃度為后續(xù)NaHS處理組。

1.2.4OGD/R 12 h后細胞的凋亡水平采用流式細胞儀檢測。取OGD處理后的各組細胞，用預冷的PBS洗滌 細 胞2次，用1×Binding Buffer懸浮 并 稀 釋細胞濃度為1×109個/L，加入Annexin V-FITC 3 μL，輕懸后4℃避光孵育15 min。加入PI 10 μL，4℃避光孵育5 min[6]。

1.2.5內質網應激相關蛋白葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78)、CCAAT/增 強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer binding proteins homologous protein,CHOP)及NF-κBP65、COX-2的蛋白表達采用Western blotting法檢測。用蛋白裂解液裂解細胞，4℃溫度下12 000 r/min離心30 min，取上清液測定總蛋白質濃度，并調整各組蛋白濃度到同一水平并上樣，然后電泳、轉PVDF膜、一抗4℃孵育過夜、二抗后孵育、ECL1顯色劑、曝光，掃描各免疫印記條帶后，采用Image J軟件對圖像進行分析。

1.3 統(tǒng)計學處理本研究所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件分析，如數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的計量資料，則采用(±s)表示，多組間的比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 OGD/R 12 h/24 h后各組細胞的存活率SHSY5Y細胞氧糖剝奪12 h后正常培養(yǎng)24 h，OGD/R模型組細胞活性Control組顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與OGD/R模型組比較，NaHS濃度為0~1.0 mol/L時，細胞增殖活性升高，NaHS濃度大于2.5mmol/L時，細胞活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 NaHS處理對OGD/R介導的細胞存活的影響Fig.1 The effect of NaHS on OGD/R-mediated SH-SY5Y viability

2.2 OGD/R 12 h/24 h后各組細胞的凋亡水平SH-SY5Y細胞氧糖剝奪12 h后正常培養(yǎng)24 h，圖2的流式細胞圖顯示，Control組細胞主要分布在左下象限為活細胞，而OGD/R模型組細胞在右上象限（為晚期凋亡細胞）和右下象限（為早期凋亡細胞）均有明顯增加，提示OGD/R模型組早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞增加。統(tǒng)計結果顯示，各組細胞處理12 h時，OGD/R模型組細胞的凋亡水平顯著高于Control組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與OGD/R模型組比較，0.4 mmol/L濃度的NaHS處理組細胞的凋亡水平顯著降低，而4 mmol/L NaHS濃度處理組細胞的凋亡水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2 NaHS處理對OGD/R后細胞凋亡水平的影響Fig.2 The effect of NaHS on OGD/R-mediated cellular apoptosis in SH-SY5Y

2.3 各組OGD/R 12 h復氧24 h后細胞的內質網應激相關蛋白GRP78及CHOP的蛋白表達SH-SY5Y細胞氧糖剝奪12 h后正常培養(yǎng)24 h，由OGD/R后細胞的GRP78及CHOP蛋白表達均顯著高于Control組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；用0.2、0.4、4 mmol/L濃度NaHS處 理 后，與OGD/R模 型 組比較，GRP78及CHOP蛋白表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；但不同劑量組間差異無統(tǒng)計學意義（圖3）。

圖3 NaHS處理對SH-SY5Y細胞OGD/R后GRP78及CHOP的蛋白表達Fig.3 The effect of NaHS on OGD/R-mediated expression levels of GRP78 and CHOP in SH-SY5Y

2.4 各組細胞OGD/R 12 h復氧24 h后細胞的NF-κBp65及COX-2的蛋白表達各組細胞處理12 h時，OGD/R模 型組細胞 的NF-κBp65表達水 平均顯著高于Control組、COX-2蛋白表達水平均顯著高于Control組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與OGD/R模型組比較，0.2、0.4、4 mmol/L濃度NaHS處理組細胞的NF-κBp65表達水平顯著降低，差異有統(tǒng) 計 學 意 義（P＜0.05）；0.2、0.4 mmol/L細 胞 的COX-2的蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖4)。

圖4 NaHS處理對SH-SY5Y細胞OGD/R后NF-κBp65及COX-2的蛋白表達Fig.4 The effect of NaHS on OGD/R-mediated expression levels of NF-κBp65and COX-2 in SH-SY5Y

3 討 論

隨著人口老齡化的加劇，VaD發(fā)病率也呈逐年上升趨勢[7]。腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)是目前臨床上高致殘率、高致死率的主要疾病之一[8]，也是引起VaD的主要因素之一。新型氣體信號分子H2S具有重要的生物學功能，其對神經系統(tǒng)的生理功能研究受到廣泛關注。WANG等[9]發(fā)現(xiàn)，在局灶腦缺血-再灌注后，H2S能保護血腦屏障的完整性。外源性H2S能通過多種機制防止大鼠全腦的缺血-再灌注損傷[10]。本研究對SH-SY5Y模擬體外腦缺血OGD/R后，流式細胞術檢測細胞存活率檢測結果顯示，OGD/R模型組細胞的存活率明顯低于對照組，當OGD/R發(fā)生時，早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞數(shù)明顯增多，提示SH-SY5Y細胞凋亡率明顯增高，說明對細胞進行OGD/R處理后可明顯誘發(fā)SH-SY5Y細胞的凋亡，而H2S能減輕OGD/R引起的細胞凋亡。

為進一步探討OGD/R后神經元的損傷機制及H2S的保護機制，本研究對內質網應激和細胞凋亡的信號通路進行研究。在腦缺血后，低能量水平可以破壞內質網中正常蛋白質折疊，導致未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)和內質網應激(endo?plasmic reticulum stress,ERS)的激活[11]，GRP78作 為抗凋亡標志物在UPR發(fā)生后表達增加，促進內質網穩(wěn)態(tài)、細胞結構及功能的恢復，在缺血再灌注損傷過程中引起ERS的刺激持續(xù)存在，ERS過強，細胞結構及功能無法恢復，引起細胞凋亡[12]。CHOP作為促凋亡轉錄因子，是介導ERS導致的細胞凋亡中至關重要的蛋白之一，通過對GRP78和CHOP表達水平的分析可以判斷ERS的激活狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD/R后GRP78及CHOP表達均較對照組顯著增高，說明氧糖剝奪再復氧損傷進一步促進了ERS的激活。對氧糖剝奪再復氧神經細胞用不同濃度NaHS處理后，低劑量0.2 mmol/L處理組GRP78及CHOP的表達均較對照組顯著降低，說明低劑量NaHS抑制了ERS的激活。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，ERS與NF-κB高度相關，內質網應激后，內質網腔內大量未折疊和（或）錯誤折疊的蛋白質生成增加，可競爭結合GRP78，促進IRE1α活化，進一步激活IκB的上游激酶IKK，使IkB磷酸化后與NF-κB解離，游離NF-κB的亞基p65迅速移位到細胞核，在核內磷酸化為P-p65，與特異性κB序列結合，誘導炎癥相關基因的轉錄，促進炎癥介質的表達[13]。作為NF-κB下游靶基因，iNOS與COX-2在腦缺血狀態(tài)下迅速被誘導表達，損傷細胞的DNA和蛋白質[6,14]。COX-2為誘生型環(huán)氧化酶，在神經系統(tǒng)炎癥中起著重要作用[6,15]。靜息狀態(tài)下，COX-2表達較少，但是在腦缺血后，神經元表達COX-2和iNOS，作為炎癥因子參與炎癥反應同時激活小膠質細胞產生大量活性氧(active oxygen,ROS)，細胞受ROS刺激，啟動線粒體凋亡途徑，破壞線粒體膜的通透性，造成線粒體功能紊亂，導致細胞能量代謝障礙及鈣超載[19,16-17]，引起細胞凋亡，加重腦缺血損傷。本研究結果表明，SH-SY5Y細胞GOD/R后引起內質網應激激活NF-κB，進而激活了下游炎癥基因COX-2；課題組前期研究顯示，低劑量H2S可以下調VaD大鼠海馬組織COX-2、NF-κB的表達，改善VaD大鼠的學習記憶能力[18-19]。提示氧糖剝奪再灌注損傷可能是通過ERS激活誘導NF-κB/COX-2通路導致細胞凋亡。TAO等[20]通過大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)小鼠模型研究表明，在MCAO前24 h，用低濃度的NaHS預處理實驗小鼠后，可抑制NF-κB的激活，從而減少炎癥發(fā)生，改善小鼠行為，這與課題組前期動物實驗結果相同。

本研究還發(fā)現(xiàn)低劑量H2S對神經細胞具有明顯的保護作用，而高劑量H2S對細胞的保護作用不確定。REN等[21]用180 μmol/kg的 硫 氫 化 鈉(NaHS)預處理全腦缺血再灌注（global cerebral ischemia/reper?fusion,GCIR）模型大鼠后，加重了GCIR導致的神經元損傷，而25 μmol/kg的NaHS則減輕了神經元損傷。該研究提示，低濃度外源性的H2S可能對GCIR所致神經元損傷具有保護作用，與本研究的結果一致。以上均說明，低濃度的H2S在改善GCIR中起重要作用。由此可見，在GCIR中給予外源性H2S對腦組織具有雙向效應。這可能與給予的NaHS劑量在體內產生H2S的量和自身內源性H2S的表達調節(jié)能力有關[22]。

綜上所述，在OGD/R模型細胞模擬的體外缺血-再灌注損傷后，低濃度NaHS處理OGD/R模型細胞后，可以提高經OGD/R模型細胞的細胞活性，抑制缺氧-再灌注對神經元的損傷。這可能與其減輕ERS、降低NF-κBp65、COX-2的蛋白表達，減輕炎性反應以及下調細胞凋亡水平有關，進而達到保護神經元的目的。