潘怡霞，林亞云，劉 妍，郭凡凡，張文濤，白桂芹

（1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710061；2.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院生殖遺傳科，云南昆明 650032；3.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心，臨床研究管理中心，北京 100039；4.西安市第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710016）

中國是乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）感染的高發(fā)地帶，人群HBV攜帶率為9.9%，HBV感染與慢性肝炎、肝硬化和肝癌密切相關[1-3]。HBV母嬰傳播包括宮內(nèi)感染、分娩過程中的感染和分娩后的感染[4]。從母親到嬰兒的后兩種傳播途徑可通過在嬰兒出生后立即使用HBV疫苗和HBV免疫球蛋白（hepatitis B immunoglobulin,HBIG）治療而阻斷[5]。但仍然有5%~10%的嬰兒未能阻斷HBV感染，這主要是發(fā)生宮內(nèi)感染所致[6-9]。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)HBV可通過母體血液接觸胎盤并感染胎盤滋養(yǎng)細胞，產(chǎn)生乙肝X蛋白（hepatitis B X protein,HBx），與胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）、絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶（protein ki?nase B,Akt）抑制滋養(yǎng)細胞凋亡的信號通路有關[10-11]。本研究將進一步明確HBx蛋白通過內(nèi)皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）/PI3K/Akt信號通路抑制胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡的具體機制。

1 材料與方法

1.1 材料人絨毛膜癌細胞株JEG-3（中科院上海生命科學研究院細胞庫），人滋養(yǎng)細胞HTR-8（第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科實驗室），DMEM高糖培養(yǎng)、RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；優(yōu)質(zhì)胎牛血清（美國Gibco公司），胰蛋白酶（Amresco公司）。EGFR過表達慢病毒顆粒（復能基因），EGFR shRNA（維真生物），pGL3-EGFR啟動子熒光素酶表達質(zhì)粒（上海宇玫博生物），pGL3-basic、pGL3-control、pRLTK質(zhì)粒（Promega公司），pGFP-HBx表達質(zhì)粒（Add?gene）；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒（上海生工生物工程有限公司、德國QIAGEN公司）；0.22 μm濾器（Millpore公司）；轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE HD（德國Roche公司）。兔抗人HBx多克隆抗體、兔抗人EGFR多克隆抗體（Abcam公司），兔抗人PI3K單克隆抗體、兔抗人p-Akt單克隆抗體、兔抗人Akt單克隆抗體（Cell Signaling公司）；化學發(fā)光底物（Thermo公司）；辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗鼠IgG、辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔IgG、兔抗β-actin多克隆抗體、鼠抗β-actin多克隆抗體（北京康為世紀生物公司）；羊抗兔IgG-Cy3（康維世紀）。8孔腔室載玻片（ibidi），細胞凋亡試劑盒（凱基生物）。pGFP-HBx質(zhì)粒、野生型pTriEx-1.1 HBV質(zhì)粒和HBx缺失突變型pTriEx-1.1 HBV質(zhì)粒為本課題組前期構建提取儲存。

1.2 細胞培養(yǎng)將JEG-3及HTR-8細胞從液氮中取出復蘇后，JEG-3細胞培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，HTR-8細胞培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于含50 mL/L CO2、37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中孵育。將復蘇成功的細胞培養(yǎng)傳2代后進行后續(xù)實驗。

1.3 雙熒光素酶檢測HBx與EGFR啟動子的關系分別將正常培養(yǎng)的JEG-3、HTR-8細胞以3×105/孔接 種 至24孔板，16~18 h時將pGL3-EGFR啟動子熒光素酶表達載體與內(nèi)參pRL-TK載體按30∶1的比例分別共轉(zhuǎn)染2種細胞。每種細胞各分為3組。實驗組（HBx+E組）共轉(zhuǎn)染pGFP-HBx表達質(zhì)粒和pGL3-EGFR啟動子熒光素酶表達載體；空載體對照組（Control組）共轉(zhuǎn)染pGFP空載體和pGL3-EGFR啟動子熒光素酶表達載體；陰性對照組（NC組）共轉(zhuǎn)染pGFP-HBx表達質(zhì)粒和pGL3-Basic熒光素酶表達載體。設置pGL3-Basic熒光素酶報告載體為陰性對照，pGL3-Control熒光素酶報告載體為陽性對照。48 h時進行各組細胞熒光素酶活性檢測，分析HBx對EGFR啟動子活性的影響。

1.4 EGFR過表達或敲低的JEG-3、HTR-8細胞系的構建及實驗分組通過慢病毒顆粒感染細胞構建EGFR穩(wěn)定表達細胞系：培養(yǎng)JEG-3、HTR-8細胞至對數(shù)生長期，每孔9.5×104個細胞于500 μL相應細胞培養(yǎng)液至24孔板，過夜培養(yǎng)后更換完全培養(yǎng)液，分別加入相應的慢病毒顆粒液，即慢病毒量（mL）=接觸慢病毒的細胞數(shù)×MOI/慢病毒滴度（TU/mL）。感染12~16 h后，吸棄含慢病毒顆粒的培養(yǎng)液，加完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72~96 h，觀察熒光表達。于感染72 h時加入嘌呤霉素2 μg/mL藥物篩選。將穩(wěn)定過表達EGFR的JEG-3、HTR-8細胞系定義為EGFR過表達組。

通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細胞構建敲低EGFR表達細胞系：穩(wěn)定過表達EGFR的JEG-3、HTR-8細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按每孔約1.0×106個細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至50%~60%匯合時采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染EGFR shRNA。將2 μg質(zhì)粒 和4 μL轉(zhuǎn) 染試劑X-tremeGENE HP混勻后室溫孵育30 min，加入細胞培養(yǎng)孔，搖勻后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。將干擾EGFR表達的JEG-3、HTR-8細胞系定義為EGFR敲低組。本研究另設空白對照組，細胞未進行處理。

1.5 Western blotting檢測EGFR/PI3K/p-Akt的表達分別收集1.4項各組細胞，加入RIPA裂解液于冰上裂解30 min。4℃12 500 r/min離心25 min，離心后保留上清，用BCA法測定蛋白濃度，計算蛋白上樣量。用SDS-PAGE電泳法進行蛋白電泳后通過轉(zhuǎn)膜儀移至硝酸纖維素膜上；將膜置于含50 g/L脫脂奶粉的TBST中進行抗體封閉2 h，隨后分別于一抗（兔抗人EGFR多克隆抗體1∶1 000，兔抗人PI3K單克隆抗體、兔抗人p-Akt單克隆抗體1∶500，兔抗人Akt單克隆抗體1∶800，鼠抗β-actin多克隆抗體1∶1 000）及HRP標記的二抗（辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗鼠IgG、辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔IgG均為1∶2 000）孵育后，ECL發(fā)光液顯色，壓片保存。

1.6 激光共聚焦成像分析EGFR/PI3K/p-Akt蛋白定位表達分別收集1.4項各組細胞，按每孔4.5×104個細胞接種到8孔腔室載玻片。48 h后細胞生長至約90%，棄上清，用1×PBS清洗細胞，40 g/L多聚甲醛 固 定，1 mL/L Triton X-100破 膜，30 g/L BSA室溫封閉2 h。一抗（兔抗人EGFR多克隆抗體1∶500，兔抗人PI3K單克隆抗體、兔抗人p-Akt單克隆抗體1∶250）4℃孵育過夜，二抗（羊抗兔IgG-Cy3 1∶500）37℃避光孵育40 min，加細胞核染液DAPI染核10 min，PBS再次清洗 后，在Olympus FV1000共聚焦顯微鏡下觀察并分析結(jié)果。

1.7 Western blotting檢測HBx、PI3K/p-Akt的表達在6孔板內(nèi)培養(yǎng)JEG-3、HTR-8細胞，每種細胞分為4組，分別轉(zhuǎn)染pGFP-HBx質(zhì)粒、野生型pTriEx-1.1 HBV質(zhì) 粒、HBx缺 失 突 變 型pTriEx-1.1 HBV質(zhì)粒和pGFP空載體。培養(yǎng)72 h，收集各組細胞進行Western blotting檢測，具體步驟同1.6項（兔抗人HBx多克隆抗體1∶500）。

1.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡收集1.4項各組細胞接種于12孔板培養(yǎng)72 h，分別用不含EDTA的胰酶消化，PBS洗滌細胞2次（2 000 r/min離心5 min）收集（1~5）×105細胞；加入500 μL的Binding Buffer懸浮 細 胞；加 入5 μL Annexin V-FITC混 勻 后，加 入5 μL PI（propidium iodide），混勻；室溫、避光反應5~15 min；在1 h內(nèi)使用流式細胞儀檢測。將1.7項中的各組轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)48 h，分別用不含EDTA的胰酶消化收集，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.9 統(tǒng)計學處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對資料進行統(tǒng)計學分析；實驗數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標準差”表示，2組樣本比較采用獨立樣本t檢驗，多組樣本比較采用單因素或雙因素方差分析，組間多重比較采用Bonferroni多重比較法分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 雙熒光素酶報告基因檢測HBx與EGFR啟動子的關系結(jié)果顯示，同時轉(zhuǎn)染HBx質(zhì)粒和pGL3-EGFR啟動子熒光素酶表達載體的實驗組（HBx+E組）JEG-3和HTR-8細胞中，pGL3-EGFR啟動子熒光素酶表達較空載體對照組（Control）及陰性對照組（NC組）均顯著增高（均為P＜0.01，圖1）。

圖1雙熒光素酶報告基因檢測HBx與EGFR啟動子的關系Fig.1 Relationship between HBx and EGFR promoters de?tected by luciferase reporter assay

2.2 EGFR過表達時EGFR/PI3K/p-Akt蛋白的表達情況

2.2.1各組EGFR/PI3K/p-Akt蛋白的表達West?ern blotting結(jié)果顯示，EGFR過表達組的2種細胞中EGFR蛋白表達高于空白對照組（JEG-3細胞，HTR-8細胞，均為P＜0.05）；EGFR敲低組的2種細胞內(nèi)EGFR表達顯著低于EGFR過表達組（均為P＜0.01），說明EGFR過表達組及EGFR敲低組細胞構建成功。EGFR過表達組的2種細胞內(nèi)PI3K及p-Akt的蛋白表達顯著高于空白對照組和EGFR敲低組（均為P＜0.01）；各組之間Akt表達差異無統(tǒng)計學意義（圖2）。

圖2 Western blotting檢測細胞內(nèi)EGFR/PI3K/p-Akt蛋白表達Fig.2 Expression of EGFR/PI3K/p-Akt protein detected by Western blotting

2.2.2各組細胞內(nèi)EGFR/PI3K/p-Akt蛋白表達定位激光共聚焦成像結(jié)果顯示（圖3）：EGFR過表達組的EGFR蛋白表達高于空白對照組與EGFR敲低組（均為P＜0.05）；當EGFR過表達組細胞轉(zhuǎn)染shRNA而敲低表達后，EGFR敲低組的兩組細胞內(nèi)EGFR表達較EGFR過表達組降低（均為P＜0.05）。當EGFR過表達時，兩組細胞內(nèi)PI3K/p-Akt表達高于空白對照組和EGFR敲低組（均為P＜0.05），表達變化與Western blotting結(jié)果一致。

圖3激光共聚焦成像分析EGFR/PI3K/p-Akt蛋白表達定位Fig.3 Localization and expression of EGFR/PI3K/P-Akt protein by laser confocal imaging(×400)

2.3 EGFR/PI3K/p-Akt信號通路抑制細胞凋亡流式細胞術結(jié)果顯示：EGFR過表達組2種細胞的凋亡比例較空白對照組顯著降低（JEG-3P＜0.05；HTR-8P＜0.01）；EGFR敲低組2種細胞的凋亡比例顯著高于EGFR過表達組（JEG-3P＜0.05；HTR-8P＜0.01，圖4）。這說明胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡比例與EGFR/PI3K/p-Akt表達呈負相關。

圖4 流式細胞術檢測EGFR/PI3K/p-Akt信號通路抑制細胞凋亡Fig.4 The inhibitory effect of EGFR/PI3K/p-Akt signaling pathway on apoptosis detected by flow cytometry

2.4 HBx蛋白促進PI3K/p-Akt信號通路蛋白表達當JEG-3、HTR-8兩種細胞轉(zhuǎn)染pGFP-HBx質(zhì)粒及pTriEx-1.1 HBV野生型質(zhì)粒時，可檢測到HBx蛋白表達；轉(zhuǎn)染HBx缺失突變型pTriEx-1.1 HBV質(zhì)粒組和空載體對照組無HBx蛋白表達；當存在HBx蛋白表達時，即轉(zhuǎn)染pGFP-HBx質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染pTriEx-1.1 HBV野生型質(zhì)粒組中PI3K及p-Akt蛋白表達顯著高于HBx缺失組和空載體對照組（均為P＜0.05）；各組之間Akt表達差異無統(tǒng)計學意義（圖5）。

圖5 Western blotting檢測HBx及PI3K/p-Akt蛋白表達情況Fig.5 Expressions of HBx and PI3K/p-Akt protein detected by Western blotting

2.5 HBx蛋白抑制細胞凋亡流式細胞術結(jié)果顯示，JEG-3和HTR-8兩種細胞轉(zhuǎn) 染pGFP-HBx組 及轉(zhuǎn)染pTriEx-1.1 HBV組細胞凋亡率均較轉(zhuǎn)染HBx缺失突變pTriEx-1.1 HBV組及空載體對照組顯著降低（均為P＜0.05，圖6）。這提示絨毛膜癌滋養(yǎng)細胞凋亡比例與HBx/PI3K/p-Akt表達呈負相關。

3 討 論

HBx可整合入EGFR等調(diào)控細胞生長基因，影響細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導[12]。研究表明，HBx可影響EGFR和EGFR家族其他成員的激活[13-14]，將不同的信號刺激傳入細胞內(nèi)，從而啟動了信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)而產(chǎn)生多種生化反應。而HBx激活EGFR的作用位點及機制還有待進一步研究。

本研究通過雙熒光素酶活性檢測，發(fā)現(xiàn)HBx質(zhì)粒與EGFR啟動子質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時，EGFR啟動子表達顯著高于空載體對照組及陰性對照組（P＜0.01）。本研究首次發(fā)現(xiàn)并證實HBx蛋白可作用于EGFR啟動子區(qū)域，激活EGFR啟動子表達。

圖6流式細胞術檢測HBx蛋白對細胞凋亡的抑制作用Fig.6 The inhibition of HBx protein on apoptosis detected by flow cytometry

EGFR在哺乳動物細胞表面廣泛分布，作為膜表面受體，具有酪氨酸激酶活性，可將不同的信號刺激傳入細胞內(nèi)，激活多種下游信號途徑如PI3K/p-Akt/Bad、Ras/Raf/MEK/ERK等多種信號轉(zhuǎn)導途徑，與刺激細胞增殖、細胞移動性增強及器官的修復有密切關系[15]。EGFR/PI3K/p-Akt在許多類型細胞的增殖調(diào)控和凋亡抑制中發(fā)揮關鍵作用[16-17]。

為探討在胎盤滋養(yǎng)細胞內(nèi)EGFR/PI3K/p-Akt信號通路的調(diào)控機制與HBV宮內(nèi)感染之間存在的內(nèi)在關系，本研究構建了EGFR過表達滋養(yǎng)細胞，使用shRNA敲低過表達組EGFR表達，通過Western blotting及激光共聚焦檢測EGFR/PI3K/p-Akt表達及定位。EGFR/PI3K/p-Akt均位于細胞質(zhì)中，當EGFR過表達時PI3K/p-Akt表達顯著升高（P＜0.01），Akt表達無統(tǒng)計學差異，細胞凋亡比例顯著降低（JEG-3P＜0.05；HTR-8P＜0.01）。EGFR過表達組被敲低后，PI3K/p-Akt表達顯著降低（P＜0.01），Akt表達無統(tǒng)計學差異，細胞凋亡比例顯著增加（JEG-3P＜0.05；HTR-8P＜0.01）。胎盤滋養(yǎng)細胞內(nèi)EGFR過表達時可以激活其下游信號通路PI3K/p-Akt，并通過PI3K/p-Akt信號通路抑制胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡，證實EGFR激活PI3K/p-Akt從而抑制胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡，使感染HBV的滋養(yǎng)細胞壽命延長，逃避機體免疫系統(tǒng)的清除。HBV DNA得以大量復制合成，增加HBV宮內(nèi)感染的危險性。

有研究表明，體外和體內(nèi)的高復制狀態(tài)下（HBV DNA＞1×103copies/mL），尤其是HBV DNA＞1×107copies/mL，滋養(yǎng)細胞內(nèi)有HBxAg的表達，滋養(yǎng)細胞凋亡明顯受到抑制，同時細胞內(nèi)PI3K及p-Akt的表達上調(diào)。在妊娠過程中,孕婦血液內(nèi)的HBV感染胎盤滋養(yǎng)細胞后，在其中復制繁殖，抑制滋養(yǎng)細胞凋亡，可能與產(chǎn)生的HBx蛋白及胞內(nèi)PI3K/p-Akt信號通路有關[10-11]。WANG等[18]的研究發(fā)現(xiàn),pEGFR蛋白在HBx感染的人胎盤組織和滋養(yǎng)細胞中明顯上調(diào)，HBx通過激活EGFR/Akt通路，減少細胞凋亡，促進胎盤滋養(yǎng)細胞分泌胎盤激素。本研究發(fā)現(xiàn)，當胎盤滋養(yǎng)細胞內(nèi)存在HBx蛋白表達時，PI3K/p-Akt表達顯著升高(P＜0.05)，細胞凋亡率則顯著降低(P＜0.05)。這證實了HBx蛋白通過促進EGFR/PI3K/p-Akt信號通路，抑制胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡，與已有研究報道的結(jié)果一致[19-20]。

綜上所述，在胎盤滋養(yǎng)細胞內(nèi)HBx蛋白作用于EGFR啟動子區(qū)域，通過調(diào)控EGFR啟動子區(qū)激活EGFR及其下游信號通路PI3K/p-Akt，抑制細胞凋亡，受HBV感染的胎盤滋養(yǎng)細胞生存期延長，有益于HBV DNA的復制，為病毒提供了潛伏場所，實現(xiàn)免疫逃逸。因此，探討HBx蛋白在HBV宮內(nèi)感染中的作用及機制是未來研究的重點。