蒙湄方 蘇延旭 馬興菊 何 陽 黃仁彬 李映新

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧市 530021，電子郵箱:1628936259@qq.com；2 廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，南寧市 530007；3 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院藥劑科，南寧市 530011)

玉郎傘為蝶形花科植物疏葉崖豆的干燥塊根，廣西壯族居民常將其用于治療原發(fā)性高血壓、跌打損傷、老年癡呆及產(chǎn)后體虛等[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，玉郎傘的主要有效成分為黃酮及多糖，其功效主要包括保肝、降糖、抗腫瘤、抗心肌缺血、提高免疫力等[2]。目前，中藥單體的藥理藥效是研究的熱點領(lǐng)域，研究表明，從玉郎傘的總黃酮中提取的17-甲氧基-7-羥基-苯駢呋喃查爾酮[簡稱玉郎傘查耳酮(Yulangsanchalcone,YLSC)]可以通過抗氧化應(yīng)激以及抑制細(xì)胞凋亡和過度自噬，發(fā)揮保護(hù)心肌缺血再灌注損傷的作用[4-6]。

目前認(rèn)為，再灌注后氧化應(yīng)激所致的心肌細(xì)胞鈣超載是造成心肌損傷不可逆轉(zhuǎn)的重要因素，因此減輕鈣超載保護(hù)心肌缺血再灌注損傷成為以鈣轉(zhuǎn)運和鈣依賴蛋白為干預(yù)靶點的藥物研究的新思路。本研究主要分析YLSC對過氧化氫引起的心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子增加的干預(yù)作用，并通過測定鈣離子通道Cav1.2和雷諾定受體2(ryanodine receptor 2,RyR2)的mRNA表達(dá)，初步探討YLSC抗心肌缺血再灌注的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD乳鼠10只，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供[動物生產(chǎn)許可證：SYKG(桂)2009-0003；動物使用許可證：SYKG(桂)2009-0005]， 1～3日齡。

1.2 藥品和試劑 玉郎傘采自廣西靈山縣，經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)生藥教研室鑒定為蝶形花科植物疏葉崖豆的干燥塊根，參照相關(guān)文獻(xiàn)[3]中的方法提取YLSC(高效液相色譜法檢測，含量≥98%)。杜氏改良伊戈爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)-F12、牛血清白蛋白均購自Gibico公司，胎牛血清購自HyClone公司，鈣離子熒光探針Fluo-3AM、Pluronic F-127、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)均購自Sigma公司，0.25%胰蛋白酶購自索萊寶公司，總RNA 提取試劑 RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑和SYBR Green Mix 購自大連TaKaRa 公司，瓊脂糖購自西班牙Biowest 公司，上下游引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3 主要儀器 YJ-875型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)；250型CO2培養(yǎng)箱(美國SHEL-LAB公司)；FV1000型激光掃描共聚焦系統(tǒng)(日本Olympus公司)；7300型實時熒光定量PCR 儀(美國Applied Biosystems公司)；PowerPac Basic基礎(chǔ)電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.4 心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[7]改進(jìn)培養(yǎng)方法。無菌條件下取乳鼠心尖組織于HEPES緩沖液中剪碎，加入37 ℃胰酶(0.1%)約10 mL，輕柔吹打消化6～7次(8 min/次)，除第1次消化液棄去外，收集其余消化液并加入含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液終止消化；將所收集消化液用200目篩過濾，4℃下800 r/min 離心5 min，取下層沉淀細(xì)胞重懸于培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱(5% CO2、95% O2)中37℃下培養(yǎng)1 h后，采用差速貼壁培養(yǎng)法純化心肌細(xì)胞；培養(yǎng)液中加入終濃度為0.1 mmol/L 的BrdU繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d，待細(xì)胞融合成片，90%以上細(xì)胞有節(jié)律同步搏動時用于后續(xù)實驗。

1.5 氧化損傷模型的建立及細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的測定 將心肌細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、模型組、100 μmol/L YLSC預(yù)處理組和200 μmol/L YLSC預(yù)處理組。對照組和模型組加入無血清培養(yǎng)基，YLSC預(yù)處理組于無血清培養(yǎng)基中分別加入終濃度為100 μmol/L、200 μmol/L的YLSC，每組設(shè)3個平行。各組于培養(yǎng)箱中孵育24 h后棄去培養(yǎng)液，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌細(xì)胞3次，加入含5 μmol/L的Fluo-3AM和0.1% Pluronic F-127的磷酸緩沖鹽溶負(fù)載液，37℃避光溫育45 min，用磷酸緩沖鹽溶漂洗2～3次，棄去液體，加入無血清低糖DMEM培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱中孵育15 min。除對照組外，各組加入30%的過氧化氫溶液60 μL使其終濃度為0.3 mmol/L誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷，加入過氧化氫后即刻上機(jī)測定。用共聚焦激光掃描系統(tǒng)(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長526 nm)每隔15 s 掃描1 次，選定細(xì)胞，記錄并采集圖像，每組選取3個視野動態(tài)檢測15 min。以平均熒光強度變化反映細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的相對水平。實驗重復(fù)3次。

1.6 Cav1.2和RyR2 mRNA表達(dá)情況的檢測 細(xì)胞分組及預(yù)處理同1.5。各組細(xì)胞孵育24 h后，除對照組外，各組加入終濃度為0.3 mmol/L的過氧化氫孵育15 min后，按照試劑盒說明書分別提取各組細(xì)胞總RNA，以A260 nm/A280 nm比值在1.8～2.0間的合格RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR操作按照試劑盒說明進(jìn)行：取總RNA 1 μg反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，取等量的 cDNA用相應(yīng)的引物以SYBR Green MIX熒光染料進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，各基因引物見表1，PCR反應(yīng)體系包括SYBR Green MIX 10 μL、cDNA 2 μL、上下游引物各1 μL、RNase Free H2O 6 μL。PCR反應(yīng)條件按 PCR擴(kuò)增和熔解曲線兩步法條件進(jìn)行反應(yīng)：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，95℃ 15 s，72℃延伸15 s，共40個循環(huán)；最后進(jìn)行產(chǎn)物熔解曲線測定，從60℃逐漸增溫到95℃，時間20 min，95℃ 15 s。以2%的瓊脂糖凝膠電泳測定PCR產(chǎn)物大小。所有PCR均重復(fù)3次，每次 3個平行樣本。采用2-ΔΔCt法分析各基因在細(xì)胞中的相對表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，經(jīng)方差齊性檢驗提示各組方差齊，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子 熒光強度的比較 加入過氧化氫即刻，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子熒光強度升高，與對照組比較，其他3組15min內(nèi)的游離鈣離子熒光強度均升高，模型組、YLSC低劑量預(yù)處理、高劑量預(yù)處理組的游離鈣離子熒光強度依次降低(均P<0.05)，見表2和圖1。

表2 4組心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子熒光強度的比較(x±s)

圖1 4組心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子熒光強度

2.2 各組心肌細(xì)胞 Cav1.2和RyR2的mRNA表達(dá)水平的比較 與對照組比較，模型組的Cav1.2和RyR2 mRNA表達(dá)水平均增加(P<0.05)；模型組、100 μmol/L YLSC預(yù)處理組、200 μmol/L YLSC預(yù)處理組的Cav1.2和RyR2 mRNA表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)。見表3。

表3 4組心肌細(xì)胞Cav1.2和RyR2 mRNA相對表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

鈣超載是缺血再灌注損傷的關(guān)鍵機(jī)制，鈣超載可引起線粒體膜電位降低、組織能量代謝障礙、胞質(zhì)內(nèi)磷脂酶和蛋白酶激活等一系列連鎖反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞不可逆性損傷，故鈣超載又稱為缺血細(xì)胞再灌注損傷致死的“最后通路”[8]。氧化應(yīng)激是引起鈣超載的常見因素，氧化性應(yīng)激使胞內(nèi)還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的比值下降，引起膜通道蛋白變構(gòu)，使鈣離子內(nèi)流增加，從而導(dǎo)致鈣超載[9]。過氧化氫可通過產(chǎn)生氧自由基引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷而導(dǎo)致鈣超載，故常用于模擬心肌缺血再灌注損傷及部分與氧自由基密切相關(guān)的心血管疾病病理模型[10]。

本研究采用過氧化氫誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，利用Fluo-3AM與細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子特異性結(jié)合后能夠被激發(fā)熒光，可用激光掃描顯微鏡進(jìn)行檢測的特點，對心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，過氧化氫處理后心肌細(xì)胞內(nèi)的游離鈣離子濃度明顯升高，表明過氧化氫可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激引起心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載， YLSC預(yù)處理組加入過氧化氫后，游離鈣離子熒光強度雖然仍較對照組有所增加，但較模型組降低，且有劑量依賴性，說明玉郎傘查爾酮能對抗氧化應(yīng)激引起的鈣超載。

心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度與外鈣的進(jìn)入和內(nèi)鈣的釋放有關(guān)，前者主要通過細(xì)胞膜上的L型鈣通道進(jìn)入，后者主要是由肌質(zhì)網(wǎng)上的RyR通道釋放，而心肌細(xì)胞上主要分布有RyR2。Cav1.2是心肌細(xì)胞L型鈣通道中構(gòu)成鈣離子進(jìn)入細(xì)胞的主要孔道結(jié)構(gòu)。Cav1.2的表達(dá)升高可增加心肌細(xì)胞內(nèi)的游離鈣離子濃度[11]，引發(fā)RyR2高親和位點與鈣離子結(jié)合，以“以鈣釋鈣”的方式促進(jìn)鈣離子通過RyR2通道從肌漿網(wǎng)釋放到胞質(zhì)中，且RyR2表達(dá)增加進(jìn)一步引起細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的增加[12]。本實驗結(jié)果提示，過氧化氫處理能顯著增加心肌細(xì)胞L型鈣通道Cav1.2和RyR2 通道的mRNA表達(dá)量，而玉郎傘查耳酮預(yù)處理可下調(diào)過氧化氫引起的心肌細(xì)胞Cav1.2、RyR2的mRNA表達(dá)增加。由此推測， YLSC對抗氧化應(yīng)激引起的鈣超載可能與下調(diào)過氧化氫引起的心肌細(xì)胞Cav1.2、RyR2的mRNA表達(dá)，從而減少外鈣的進(jìn)入和內(nèi)鈣的釋放有關(guān)。

綜上所述，YLSC預(yù)處理可抑制氧化應(yīng)激引起的心肌鈣超載，其可能通過下調(diào)Cav1.2、RyR2的基因表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度增加。然而基因的表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平存在不完全一致的現(xiàn)象，因此，下一步還應(yīng)對Cav1.2、RyR2的蛋白表達(dá)進(jìn)行研究；此外，心肌細(xì)胞內(nèi)的游離鈣離子濃度還受到鈉-鈣交換體、肌漿網(wǎng)鈣泵等功能的影響，今后也還需要進(jìn)行相關(guān)研究，才能更好闡明 YLSC的作用機(jī)制。