陳瑞芳 岳薈然 李文質(zhì) 鹿 欣 李 俊

（復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科 上海 200011）

卵巢癌是婦科致死性最高的惡性腫瘤，多數(shù)患者就診時已處于發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的晚期階段。經(jīng)過初始的瘤體減滅術(shù)聯(lián)合鉑類為基礎(chǔ)的化療，大多數(shù)得到臨床緩解的患者仍面臨著較高的復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險，其5 年生存率始終徘徊在20%~30%。盡管化療方案在不斷更新和改進(jìn)，但是患者生存預(yù)后的改善卻十分有限［1］。因此，尋找新的卵巢癌預(yù)后標(biāo)記物，從分子水平闡明影響卵巢癌患者預(yù)后的機(jī)制，進(jìn)而開發(fā)新的靶向治療藥物以提高卵巢癌患者的預(yù)后顯得尤為重要。

髓樣鋅指蛋白 1（myeloid zinc finger 1，MZF1）屬于掃描鋅指蛋白（scan-zinc finger，SCAN-ZF）家族。MZF1 最初被發(fā)現(xiàn)是參與造血發(fā)育過程的轉(zhuǎn)錄因子［2］，可以調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的分化和增殖［3］，上調(diào)MZF1 的表達(dá)可誘發(fā)白血病。近年來，越來越多的研究證實MZF1 參與了腫瘤惡性進(jìn)展的多個過程，包括侵襲轉(zhuǎn)移、化療耐藥、炎癥反應(yīng)等，其異常表達(dá)與多種實體惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如神經(jīng)母細(xì)胞瘤［4］、膠質(zhì)瘤［5］、胃癌［6］、乳腺癌［7］和前列腺癌［8］等。但是，MZF1 在卵巢癌中的表達(dá)及其與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。

本研究利用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（gene expression ominus，GEO）和癌癥基因組數(shù)據(jù)庫（The Cancer Genome Altas，TCGA），分析MZF1 在正常輸卵管上皮、低度惡性潛能的卵巢腫瘤（卵巢交界性腫瘤）和卵巢癌中的表達(dá)差異，并探討其表達(dá)高低與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系。同時，采用基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），探究 MZF1 高表達(dá)和 MZF1 低表達(dá)的卵巢癌患者相關(guān)信號通路的差異。旨在探索MZF1是否可以作為預(yù)測卵巢癌預(yù)后的標(biāo)記物。

資料和方法

差異表達(dá)分析GSE10971 數(shù)據(jù)集用于分析輸卵管上皮和卵巢癌組織中MZF1 的表達(dá)差異；GSE12172 數(shù)據(jù)集用于分析低度惡性潛能卵巢腫瘤（卵巢交界性腫瘤）和卵巢癌組織中MZF1 的表達(dá)差異 ；GSE10971 和 GSE12172 數(shù) 據(jù) 均 可 在 Pubmed 的GEO 數(shù)據(jù)庫公開免費獲取。

生存分析Kaplan Meier Plotter（http：//kmplot.com/analysis/）包含了1 656例卵巢癌患者的生存數(shù)據(jù)。我們利用Kaplan Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫分析了MZF1 表達(dá)高低與卵巢癌無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）和總生存期（overall survival，OS）的關(guān)系。Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫可免費公開獲取。

MZF1 相關(guān)信號通路分析我們選取了GSE26712 數(shù)據(jù)集中達(dá)到滿意瘤體減滅術(shù)的卵巢癌患者的芯片數(shù)據(jù)，并根據(jù)MZF1 的表達(dá)值，分別選取了MZF1 表達(dá)最低的10 例樣本和MZF1 表達(dá)最高的10 例樣本，采用GSEA 分析了MZF1 相關(guān)的潛在信號通路。

統(tǒng)計學(xué)分析差異表達(dá)分析采用兩獨立樣本t檢驗，生存分析采用 Kaplan-Meier 分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。GSEA 分析中FDR-q<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

MZF1 在輸卵管上皮和卵巢癌中的表達(dá)差異既往文獻(xiàn)已經(jīng)證實，卵巢癌起源于惡變的輸卵管上皮。所以，我們首先對比了MZF1 在輸卵管上皮和卵巢癌中的表達(dá)差異。GSE10971 數(shù)據(jù)集包含了24例輸卵管上皮和13 例卵巢癌的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。我們提取MZF1 的表達(dá)值分析發(fā)現(xiàn)，MZF1 在卵巢癌中的表達(dá)明顯低于輸卵管上皮（圖1）。

圖1 MZF1 在輸卵管上皮和卵巢癌中的表達(dá)差異Fig 1 The differential expression of MZF1 between fallopian tubes epithelium and ovarian cancer tissues

MZF1 在低度惡性潛能的卵巢交界性腫瘤和卵巢癌中的表達(dá)差異我們對比了MZF1 在低度惡性潛能的卵巢交界性腫瘤和卵巢癌中的表達(dá)差異。GSE12172 數(shù)據(jù)集包含了30 例低度惡性潛能的卵巢交界性腫瘤和60 例卵巢癌的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。我們提取了MZF1 的表達(dá)值分析發(fā)現(xiàn)，MZF1 在卵巢癌中的表達(dá)明顯低于卵巢交界性腫瘤中的表達(dá)（圖2）。

圖2 MZF1 在低度惡性潛能的卵巢交界性腫瘤和卵巢癌中的表達(dá)差異Fig 2 The differential expression of MZF1 between borderline ovarian tumors（BOT）and ovarian cancer tissues

MZF1 表達(dá)與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系我們分析了MZF1 表達(dá)與卵巢癌無進(jìn)展生存期及總生存期的關(guān)系。Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫收集了GEO 數(shù)據(jù)庫和TCGA 數(shù)據(jù)中1 000 多例卵巢癌組織的芯片表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床預(yù)后數(shù)據(jù)。由于卵巢癌患者術(shù)后殘留病灶大小與卵巢癌的預(yù)后密切相關(guān)，所以我們將上述數(shù)據(jù)庫的病例分成了兩組：達(dá)到滿意瘤體減滅術(shù)組（殘留病灶小于等于1 cm）和未達(dá)到滿意瘤體減滅術(shù)組（殘留病灶大于1 cm）。我們發(fā)現(xiàn)：在達(dá)到滿意瘤體減滅術(shù)的卵巢癌患者中，MZF1 高表達(dá)患者其 PFS（圖 3A，HR=0.80；95%CI：0.66-0.97；P=0.020；n=696）和 OS（圖3B，HR=0.71；95%CI：0.57-0.88；P<0.01；n=801）均明顯高于 MZF1 低表達(dá)患者；在未達(dá)到滿意瘤體減滅術(shù)的卵巢癌患者中，MZF1 表達(dá)高低與卵巢癌患者的PFS（圖3C，HR=1.16；95%CI：0.93-1.47；P=0.190；n=459）和 OS（圖3D，HR=0.81；95%CI：0.65-1.01；P=0.064；n=536）無明顯相關(guān)性。

圖3 MZF1 表達(dá)高低與卵巢癌患者PFS 和OS 的關(guān)系Fig 3 The association of MZF1 expression with the survival of patients with ovarian cancer

MZF1 相關(guān)信號通路分析由于在達(dá)到滿意瘤體減滅術(shù)的卵巢癌患者中，MZF1 高表達(dá)的卵巢癌患者其OS 明顯高于MZF1 低表達(dá)的卵巢癌患者。因此，我們進(jìn)一步用GSEA 分析了在達(dá)到滿意瘤體減滅術(shù)的卵巢癌患者中，MZF1 低表達(dá)和MZF1 高表達(dá)卵巢癌組織中基因富集的差異，以便找到MZF1 相關(guān)的信號通路。我們提取了GSE26712 數(shù)據(jù)庫中達(dá)到滿意瘤體減滅術(shù)的卵巢癌患者的芯片數(shù)據(jù)，并根據(jù)MZF1 的表達(dá)值，分別選取了MZF1 表達(dá)最低的10 例樣本和MZF1 表達(dá)最高的10 例樣本進(jìn)行GSEA 富集分析。結(jié)果提示，MZF1 低表達(dá)組和MZF1 高表達(dá)組基因富集呈顯著差異。在MZF1低表達(dá)的患者中，炎癥反應(yīng)相關(guān)基因（圖4A，F(xiàn)DR-q<0.01） 、上 皮 間 充 質(zhì) 轉(zhuǎn) 化 （epithelial-tomesenchymal transition，EMT）相關(guān)基因（圖 4B，F(xiàn)DR-q<0.01）、血管生成相關(guān)基因（圖4C，F(xiàn)DR-q<0.05）和脂肪形成相關(guān)基因（圖4D，F(xiàn)DR-q<0.05）均顯著富集。

圖4 GSEA 分析MZF1 低表達(dá)和MZF1 高表達(dá)的卵巢癌組織間基因富集差異Fig 4 GSEA between tumors with high MZF1 expression and tumors with low MZF1 expression

討 論

本研究利用GEO 數(shù)據(jù)庫和TCGA 數(shù)據(jù)庫，并結(jié)合 GSEA 分析發(fā)現(xiàn)：（1）MZF1 在卵巢癌中的表達(dá)明顯低于正常輸卵管上皮和卵巢交界性腫瘤中的表達(dá)；（2）在達(dá)到滿意瘤體減滅術(shù)的卵巢癌患者中，MZF1 高表 達(dá)的卵 巢癌患 者 PFS 和 OS 長；（3）在MZF1 低表達(dá)的患者中，炎癥反應(yīng)相關(guān)基因、EMT相關(guān)基因、血管生成相關(guān)基因和脂肪形成相關(guān)基因均顯著富集。

既往研究證實，MZF1 參與了腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、增殖、耐藥等多個過程，其異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及其預(yù)后密切相關(guān)［9］。但是，MZF1 在不同腫瘤中的作用并不一致，MZF1 既可以作為抑癌基因，也可以作為促癌基因。在T 細(xì)胞淋巴瘤中，MZF1 在腫瘤細(xì)胞株和原發(fā)腫瘤組織中的表達(dá)明顯低于正常對照T 淋巴細(xì)胞中的表達(dá)［10］。過表達(dá)MZF1 能顯著抑制T 細(xì)胞淋巴瘤的增殖、遷移和克隆形成能力。在前列腺癌中的研究結(jié)果與上述結(jié)果一致，抑制MZF1 的表達(dá)能顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖［11］。而在結(jié)直腸癌中，MZF1 則發(fā)揮相反的作用。過表達(dá)MZF1 能明顯增強結(jié)腸癌細(xì)胞的浸潤和遷移能力［12］。在乳腺癌中，MZF1 則可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)乳腺癌的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移［13］。即使在同一腫瘤中，MZF1 既可以發(fā)揮抑癌基因的作用，也可以發(fā)揮促癌基因的作用。如在宮頸癌SiHa細(xì)胞中，過表達(dá)MZF1 能顯著抑制其浸潤和遷移能力［14］。而在宮頸癌HeLa 細(xì)胞中，其作用則完全相反［12］。在胃癌中，觀察到了與宮頸癌類似的結(jié)果，即MZF1 既可以作為促癌基因，也可以作為抑癌基因發(fā)揮作用［15-16］。引起上述結(jié)果差異的原因可能與不同腫瘤間的異質(zhì)性以及同一腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性有關(guān)。我們的研究證實MZF1 在卵巢癌組織中呈低表達(dá)，高表達(dá)MZF1 的卵巢癌患者預(yù)后好，提示其可能在卵巢癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，并可能成為預(yù)測卵巢癌患者預(yù)后的潛在分子標(biāo)記物。

在上述研究基礎(chǔ)上，我們還探索了與MZF1 表達(dá)相關(guān)的潛在信號通路。發(fā)現(xiàn)MZF1 低表達(dá)的卵巢癌患者中，炎癥反應(yīng)相關(guān)基因、EMT 相關(guān)基因、血管生成相關(guān)基因和脂肪形成相關(guān)基因均顯著富集。而既往文獻(xiàn)已經(jīng)證實，卵巢癌的發(fā)生發(fā)展與炎癥［17］、EMT［18］、血管生成［19］及脂肪代謝［20］均密切相關(guān)。Zhang 等［17］發(fā)現(xiàn) UCHL3 通過穩(wěn)定 TRAF2，激活NF-kB 信號通路及炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌的惡性進(jìn)展。Taki 等［18］發(fā)現(xiàn) Snail 通過促進(jìn) CXCR2 表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌的惡性進(jìn)展。Chen 等［19］研究證實，miR-204-5p 通過調(diào)節(jié)THBS1 的表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌的血管生成；動物實驗進(jìn)一步表明抑制miR-204-5p 的表達(dá)，能顯著抑制卵巢癌的生長。Mukherjee 等［20］發(fā)現(xiàn)脂代謝相關(guān)蛋白FABP4 通過影響DNA 中5-羥甲基胞嘧啶的水平，上調(diào)侵襲轉(zhuǎn)移和細(xì)胞生長相關(guān)基因，促進(jìn)卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移和對鉑類藥物的耐藥，進(jìn)而影響卵巢癌的預(yù)后。既往研究也表明，MZF1 參與了炎癥反應(yīng)［6］、EMT［21］和血管生成［15］的調(diào)控過程。在胃癌中，MZF1 與 MT2A 相互形成復(fù)合體，調(diào)控NFKBIA 的表達(dá)，進(jìn)而影響NF-kB 信號通路，提示MZF1 可能參與炎癥反應(yīng)［6］。Ko 等［21］發(fā)現(xiàn)，MZF1可以上調(diào)EMT 相關(guān)基因N-cadherin 的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而影響患者預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn)［15］在胃癌中發(fā)現(xiàn)，miR-337-3p 下調(diào) MZF1 的表達(dá)，抑制血管生成，進(jìn)而抑制胃癌的惡性進(jìn)展。MZF1是否也可以通過影響上述通路調(diào)控卵巢癌的惡性進(jìn)展，有待分子生物學(xué)實驗進(jìn)一步證實。

本研究證實MZF1 是預(yù)測卵巢癌預(yù)后的一個潛在分子標(biāo)記物。未來可在細(xì)胞水平和動物實驗中進(jìn)一步探索MZF1 的卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的功能和潛在分子機(jī)制。

作者貢獻(xiàn)聲明陳瑞芳，李俊 數(shù)據(jù)采集和分析，論文構(gòu)思、撰寫和修訂。岳薈然，李文質(zhì) 數(shù)據(jù)采集和分析。鹿欣 統(tǒng)計分析。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。