李雪潔 周年偉 孫敏敏 李 偉 汪詠蒔 謝惠琳 舒先紅

（1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心超室，2心內(nèi)科 上海 200032；3上海市影像醫(yī)學(xué)研究所 上海 200032；4上海市心血管病研究所 上海 200032）

FLNC編碼的細(xì)絲蛋白C（filamin C，F(xiàn)LNC）是一種廣泛存在于心肌及骨骼肌中的蛋白質(zhì)，以同源二聚體的形式表達(dá)，主要通過(guò)與肌動(dòng)蛋白交聯(lián)維持肌節(jié)的機(jī)械穩(wěn)定性。最初，F(xiàn)LNC基因突變?cè)诩≡w維肌病中被發(fā)現(xiàn)，近年來(lái)在肥厚型心肌?。╤ypertrophic cardiomyopathy，HCM）、擴(kuò)張型心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM）、限制型心肌?。╮estrictive cardiomyopathy，RCM）和致心律失常性心肌病（arrhythmogenic ventricular cardiomyopathy，ACM）中也被陸續(xù)報(bào)道。隨著基因篩查在臨床中的應(yīng)用，F(xiàn)LNC已經(jīng)成為遺傳性心臟病的常見(jiàn)致病基因之一，在HCM 和RCM 患者中發(fā)現(xiàn)了許多FLNC的錯(cuò)義突變，DCM 及ACM 患者中發(fā)現(xiàn)的則多為截?cái)嗤蛔?，這表明不同類型的FLNC突變可能存在不同的致病機(jī)制。然而中國(guó)漢族人群心肌病患者攜帶FLNC突變的變異譜仍不明確，其基因型-表型的關(guān)聯(lián)性也值得進(jìn)一步探究和討論。

資料和方法

入組人群2018 年至2020 年就診于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院的150 名無(wú)血緣關(guān)系的漢族HCM 患者和50 名DCM 患者被納入研究。成年人HCM 的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)與以往文獻(xiàn)一致：一個(gè)或多個(gè)左室心肌節(jié)段的最大室壁厚度≥15 mm，或有明確家族史者最大室壁厚度≥13 mm（排除后負(fù)荷增加），通常不伴有左室擴(kuò)大；家族性HCM 定義為在同一家系中有兩名以上的HCM 患者。DCM 的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)為具有心室擴(kuò)大和心肌收縮功能降低的客觀證據(jù)：左室舒張末內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDd）>5.0 cm（女性）和 LVEDd>5.5 cm（男性）（或>年齡和體表面積預(yù)測(cè)值的117%，即預(yù)測(cè)值的2 倍SD+5%）；左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fractions，LVEF）<45% 和左室短軸縮短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）<25%，除外冠心病、高血壓病、心臟瓣膜病、先天性心臟病、系統(tǒng)性疾病等；家族性DCM 定義為同一家系中有2 名或2 名以上的DCM 患者。收集患者的臨床信息，包括發(fā)病年齡、確診年齡、性別、癥狀、是否植入起搏器，并常規(guī)進(jìn)行心電圖（electrocardiogram，ECG）和 經(jīng) 胸 超 聲 心 動(dòng) 圖（transthoracic echocardiography，TTE）檢查。該實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過(guò)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院人類倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［B2016-016（2）R］，所有納入本研究的患者均已簽署知情同意書。

全外顯子組測(cè)序及變異解釋提取入組患者的外周血基因組DNA，在HiSeq XTEN 測(cè)序平臺(tái)（美國(guó)Illumina 公司）上進(jìn)行全外顯子組測(cè)序。具體測(cè)序方法詳見(jiàn)本課題之前的研究［1-2］。測(cè)序后使用GATK（Genome Analysis Tool kit）進(jìn)行變異檢測(cè)及初步分析，其中使用到多種人類基因突變和疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，包括OMIM、1000G 和dbsnp 等。根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）的序列變異解釋標(biāo)準(zhǔn)和指南［3］，變異的致病性分為5 級(jí)：致病的（pathogenic，P），可能致病的（likely pathogenic，LP），意義不明確的（variant of uncertain significance，VUS），可能良性的（likely benign，LB）和良性的（benign，B）。一般情況下FLNC截?cái)嘧儺惐粴w類為致病的（P）；除非有來(lái)自共分離或功能性實(shí)驗(yàn)的額外證據(jù)，錯(cuò)義變體被歸類為意義不明確的（VUS）。使 用 Polyphen-2、SIFT、PROVEAN 和 Mutation Taster 預(yù)測(cè)錯(cuò)義變異，使用PROVEAN 和Mutation Taster 預(yù)測(cè)無(wú)義變異、插入和缺失（Insertion and Deletion，InDel），篩選出被解讀為致病的（P）和可能致病的（LP）變異，進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證及臨床研究。

致病性預(yù)測(cè)變異篩選及驗(yàn)證流程見(jiàn)圖1。滿足下列條件的變異認(rèn)為是可能致病的（P）：（1）在dbSNP 等人群數(shù)據(jù)庫(kù)中未報(bào)道；（2）變異位于進(jìn)化上高度保守位點(diǎn)；（3）在人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)中已有記錄的心肌病及離子通道病相關(guān)基因上的特殊變異類型，如移碼變異、終止獲得/缺失變異、剪接位點(diǎn)變異；（4）在家系中該變異與疾病表型共分離；如果家系資料不適用于共分離，則致病性判斷通過(guò)預(yù)測(cè)軟件判斷均為有害或可能有害的。

圖1 患者全外顯子測(cè)序及基因變異篩選流程圖Fig 1 Flow chart of whole exome sequencing and variants screening

結(jié) 果

本研究共發(fā)現(xiàn)6 個(gè)FLNC變異（編號(hào)為1~6），均未見(jiàn)報(bào)道，包括HCM 患者的3 個(gè)錯(cuò)義變異，DCM 患者的1 個(gè)無(wú)義變異（截?cái)嘧儺悾┖? 個(gè)InDel變異，RCM 患者的 1 個(gè)錯(cuò)義變異，其中 1 例 DCM 為家族性，其余均為散發(fā)性病例。6 名患者均為男性，先證者及攜帶相同變異的家屬詳細(xì)臨床資料見(jiàn)表1，各變異的位點(diǎn)、類型、致病性預(yù)測(cè)等數(shù)據(jù)見(jiàn)表2 及圖 2。

表1 攜帶FLNC 變異的心肌病患者的臨床信息Tab 1 Clinical information of cardiomyopathy patients with FLNC variation

表2 患者攜帶的FLNC 變異信息Tab 2 Information of the FLNC variants detected in this study

1 號(hào) RCM 患者，男性，44 歲，20 年前情緒激動(dòng)后暈厥，在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院診斷為心肌肥厚，但未進(jìn)一步隨訪和診療，直至4 年前頻繁出現(xiàn)心悸、活動(dòng)后氣促，呈進(jìn)行性加重，平地行走50 m 以上不能耐受，遂至當(dāng)?shù)蒯t(yī)院檢查，ECG 示心房撲動(dòng)和心房顫動(dòng)伴快速心室率。2017 年12 月患者就診于我院，TTE 示：左室壁厚度13~22 mm，左室及右室收縮活動(dòng)減弱，LVEF49%，雙房明顯增大伴輕度二尖瓣及三尖瓣反流；診斷為非梗阻性HCM，予抗凝、控制心室率等治療，癥狀有所緩解。1 年前因頻發(fā)心悸再次就診，2019 年 7 月 ECG 示心房撲 動(dòng)，2：1 房室傳導(dǎo)；TTE 示：左右室壁增厚伴左右室壁整體收縮活動(dòng)減弱（LVEF 50%），雙房增大伴輕度二尖瓣及三尖瓣反流；心臟MRI 示：符合限制性心肌病改變，心肌淀粉樣變待排；進(jìn)一步行免疫固定電泳，結(jié)果呈陰性，最終確診為RCM。

2 號(hào)DCM 先證者攜帶FLNC的截?cái)嘧儺惣癕YBPC3的錯(cuò)義變異（測(cè)序峰圖及臨床資料見(jiàn)圖2），因患者母親沒(méi)有出現(xiàn)心肌病相關(guān)表型，未進(jìn)行基因檢測(cè)，無(wú)法證實(shí)是否為FLNC的新發(fā)變異；MYBPC3錯(cuò)義變異為罕見(jiàn)變異（GnomAD 中頻率為0.000016），預(yù)測(cè)為可能致病或有害的。15 年前出現(xiàn)勞累后胸悶，診斷為DCM，予卡維地洛、培哚普利等藥物治療，病情平穩(wěn)，2011 年5 月隨訪TTE示：左室顯著增大，左室心尖部見(jiàn)豐富海綿狀心肌成蜂窩狀伴左室壁整體收縮活動(dòng)減弱，LVEF33%，繼續(xù)藥物治療，2012 年至2017 年多次隨訪TTE，LVEF 波動(dòng)于30%~47%，ECG 提示Ⅱ度二型房室傳導(dǎo)阻滯，2017 年11 月因上呼吸道感染后出現(xiàn)急性左心衰伴呼吸性代謝性堿中毒，經(jīng)過(guò)抗感染、強(qiáng)心、利尿等治療，病情仍進(jìn)一步惡化，2018 年1 月因心衰、肝性腦病死亡。其父親攜帶了相同的MYBPC3變異，11 年前因反復(fù)胸悶氣促診斷為DCM，Ⅱ度二型房室傳導(dǎo)阻滯（最長(zhǎng)R-R 間期3.2 s）并行起搏器植入術(shù)。2012 年TTE 示：左房室擴(kuò)大伴左室整體收縮活動(dòng)減弱，LVEF31%，右房增大，中度三尖瓣反流；后多次隨訪TTE 心功能無(wú)明顯惡化，病情平穩(wěn)。

圖2 2 號(hào)DCM 患者及其父親的家系圖、測(cè)序峰圖及臨床資料Fig 2 The family tree，chromatogram and clinical data of DCM 2 and his father

5 號(hào)DCM 患者20年前體檢時(shí)發(fā)現(xiàn)二葉式主動(dòng)脈瓣，18 年前出現(xiàn)活動(dòng)后胸悶，于當(dāng)?shù)卦\斷為陣發(fā)性房顫，左房增大，未系統(tǒng)治療。10 年前胸悶癥狀明顯加重，就診于我院，診斷為DCM。2010 年7 月，TTE示：先天性二葉縱裂式主動(dòng)脈瓣畸形，輕度主動(dòng)脈瓣反流，左室增大伴左室壁收縮活動(dòng)減弱，LVEF35%，雙房增大伴輕度二尖瓣及中度三尖瓣反流；ECG 示：持續(xù)性房顫；于我院行 CRT-D 術(shù)。2018 年 3 月，隨訪心超示：CRT 術(shù)后雙房及左室擴(kuò)大，左右室整體收縮活動(dòng)減弱，LVEF28%，病情平穩(wěn)。

剩余3 例HCM 患者發(fā)病年齡分別為32、62 和25歲，室間隔和左室最大厚度分別為17、14、14 mm 和22、17、19 mm，3 名患者均表現(xiàn)出典型的勞力性呼吸困難和胸痛，就醫(yī)后診斷為HCM，3 人均無(wú)左室流出道梗阻，LVEF 正常。予美托洛爾治療，病情均穩(wěn)定。

討 論

Z 盤對(duì)于心臟的重要性眾所周知，其維持著心臟正常的機(jī)械活動(dòng)，也參與多種生化途徑相關(guān)信號(hào)的接收和傳輸，F(xiàn)LNC 通過(guò)與多個(gè)Z 盤蛋白相互作用，可以承受肌節(jié)上的強(qiáng)收縮力［4］。FLNC 蛋白由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成（圖3），位于氨基端的肌動(dòng)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域由2 個(gè)鈣調(diào)蛋白同源結(jié)構(gòu)域組成，連接24 個(gè)重復(fù)串聯(lián)的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域又由ROD1 和ROD2 兩個(gè)鉸鏈區(qū)及羧基端的二聚化結(jié)構(gòu)域組成，F(xiàn)LNC 蛋白形成二聚體后才能與肌動(dòng)蛋白結(jié)合。FLNC 蛋白不同結(jié)構(gòu)域及不同類型的致病變異會(huì)導(dǎo)致不同的臨床表型。ROD2 域是絲蛋白C 與Z 盤蛋白之間相互作用的重要區(qū)域，此結(jié)構(gòu)域的錯(cuò)義突變會(huì)通過(guò)顯性負(fù)性作用產(chǎn)生異常的蛋白聚體（包含無(wú)法正常二聚的FLNC 和一些Z 盤相關(guān)蛋白），蛋白聚體在細(xì)胞質(zhì)中積累導(dǎo)致肌節(jié)的排列及功能紊亂，產(chǎn)生 HCM 和 RCM［5-6］；位于肌動(dòng)蛋白結(jié)合域的錯(cuò)義突變會(huì)產(chǎn)生毒性的功能獲得，增強(qiáng)肌動(dòng)蛋白結(jié)合活性導(dǎo)致肌病；而整個(gè)基因上的截?cái)嗤蛔兣cDCM 和ACM 有密切關(guān)聯(lián)，其通過(guò)無(wú)義介導(dǎo)的mRNA 降解機(jī)制產(chǎn)生基因單倍體不足，導(dǎo)致Z盤增厚紊亂，細(xì)胞間黏附減弱，影響橫紋肌的機(jī)械傳導(dǎo)［7-11］。攜帶FLNC錯(cuò)義突變的骨骼肌病患者有一小部分存在心臟表型［12］，而FLNC相關(guān)心肌病患者罕有骨骼肌受累［7］。本研究中所有患者均無(wú)骨骼肌受累的表型，為什么FLNC錯(cuò)義突變相關(guān)HCM、RCM 患者骨骼肌中無(wú)蛋白聚體，現(xiàn)在還難以解釋。修飾基因?qū)LNC表現(xiàn)度的影響、表觀遺傳學(xué)因素等可能共同作用于FLNC突變表型的復(fù)雜性，如果能夠發(fā)現(xiàn)相同突變激活的不同通路，對(duì)于尋找潛在的治療靶點(diǎn)可能存在重要的意義。

圖3 FLNC 的結(jié)構(gòu)域及本研究發(fā)現(xiàn)的變異分布Fig 3 Structure domains and variations distribution of FLNC in our research

以往研究證明FLNC變異在HCM 患者中較常見(jiàn)，其與肌節(jié)蛋白突變導(dǎo)致的HCM 在臨床表型及預(yù)后方面沒(méi)有明顯差異［13］，本研究中 3 個(gè) HCM 患者攜帶的FLNC錯(cuò)義變異預(yù)測(cè)為可能致病，但是臨床意義未知，因此FLNC變異對(duì)于HCM 患者的表型影響可能需要謹(jǐn)慎解釋。在以往報(bào)道的病例中，F(xiàn)LNC相關(guān)DCM 的惡性程度更高，表現(xiàn)出與心室擴(kuò)張程度不符的室性心律失常、心源性猝死高風(fēng)險(xiǎn)等特點(diǎn)［14］。本研究中 2 例 DCM 患者表現(xiàn)為發(fā)病年齡早，心功能惡化速度快，未觀察到惡性室性心律失常；對(duì)于多種心肌病、多個(gè)基因突變或復(fù)合突變的攜帶者終末期進(jìn)展、心律失常和預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加［15-17］，2 號(hào) DCM 患者同時(shí)攜帶雙基因雜合變異，且均預(yù)測(cè)為可能致病的變異，與僅攜帶單基因變異的患者父親相比，臨床表現(xiàn)為發(fā)病年齡早，心功能惡化速度快伴隨傳導(dǎo)系統(tǒng)受累，這也符合之前的研究結(jié)果。有不同的研究者在HCM 及RCM患者中發(fā)現(xiàn)了相同的錯(cuò)義突變（p.Ser1624Leu），提出攜帶該突變的家系可能存在HCM 和RCM 混合的表型［12，18］；本研究中，RCM 患者在發(fā)病初期僅表現(xiàn)為心肌肥厚，早期診斷為HCM，隨著病程進(jìn)展出現(xiàn)雙房擴(kuò)大，舒張功能明顯受限，最終確診為RCM，3 號(hào)HCM 患者與RCM 患者攜帶的變異堿基位點(diǎn)相鄰，導(dǎo)致相同的氨基酸替換，隨著年齡增加是否會(huì)進(jìn)展成為RCM 尚不明確，我們將對(duì)此患者進(jìn)行定期隨訪。

本研究對(duì)200 名漢族不同亞型心肌病患者進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，討論了在200 例漢族心肌病患者中FLNC基因的變異特點(diǎn)，擴(kuò)大了心肌病中FLNC基因的變異譜，并進(jìn)一步探討了在不同心肌病中FLNC變異的基因型和表型相關(guān)性。我們觀察到變異類型對(duì)于臨床特點(diǎn)有決定性作用，錯(cuò)義突變干擾了蛋白質(zhì)的二聚和折疊會(huì)導(dǎo)致HCM、RCM，截?cái)嗤蛔儠?huì)通過(guò)單倍體不足導(dǎo)致細(xì)胞間黏附減弱，產(chǎn)生發(fā)病年齡早、進(jìn)展快速的DCM。本研究不足之處在于作為單中心研究納入的人數(shù)較少，且未納入ACM 患者，這種心肌病中FLNC的突變譜及機(jī)制需要進(jìn)一步的挖掘，另外本研究發(fā)現(xiàn)的變異需要在更大樣本的心肌病患者中進(jìn)行對(duì)比和驗(yàn)證，同時(shí)獲得更多功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的證據(jù)，以進(jìn)一步確定其致病性。

作者貢獻(xiàn)聲明李雪潔 數(shù)據(jù)采集，論文撰寫。周年偉，孫敏敏，李偉，汪詠蒔，謝惠琳 數(shù)據(jù)采集。舒先紅 論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。