鄒鳳梅，吳玲，李可可，劉剛，魏勤，李軍春，王欣，楊永清，王曉寧

(甘肅省人民醫(yī)院檢驗中心，蘭州 730000)

革蘭陰性桿菌是醫(yī)院內(nèi)感染常見的病原菌，也是臨床標(biāo)本中分離率較高的細(xì)菌之一。碳青霉烯類抗菌藥物是一類抗菌譜廣、抗菌活性強的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，是臨床治療多重耐藥革蘭陰性桿菌的首選藥物。近年來，隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用，甚至不合理使用或濫用，耐碳青霉烯類抗菌藥物的革蘭陰性桿菌(carbapenem resistant organism, CRO)逐年增多，給抗感染治療和院內(nèi)感染控制帶來極大的挑戰(zhàn)。細(xì)菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機制有：外膜孔蛋白減少或丟失伴高水平β-內(nèi)酰胺酶的持續(xù)產(chǎn)生、碳青霉烯酶的產(chǎn)生、藥物作用靶位的改變以及青霉素結(jié)合蛋白的改變。碳青霉烯酶按照Ambler分子分類方法，碳青霉烯酶可分為A、B和D三類。A類為絲氨酸碳青霉烯酶，以KPC型為主；B類為金屬β-內(nèi)酰胺酶，以 NDM、IMP和VIM型為主；D類為OXA-48型絲氨酸碳青霉烯酶[1]。本研究收集2018—2020年臨床標(biāo)本中分離的60株CRO，對其臨床分布、耐藥機制以及檢測方法進(jìn)行調(diào)查，為CRO抗感染治療合理選藥以及院內(nèi)感染控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2018年7月—2020年12月臨床送檢標(biāo)本中對亞胺培南、美羅培南或厄他培南任一或均耐藥的CRO菌株60株，剔除重復(fù)菌株。其中，肺炎克雷伯菌20株、陰溝腸桿菌13株、大腸埃希菌11株、雷極普羅威登菌5株、弗勞地枸櫞酸桿菌2株和銅綠假單胞菌9株。質(zhì)控菌株為ATCC 25922大腸埃希菌和ATCC 27853銅綠假單胞菌，購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.2儀器與試劑 飛行質(zhì)譜儀(布魯克公司)，PhoenixTM-100全自動細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)(BD公司)，GeneXpert全自動熒光定量PCR檢測儀(美國賽沛公司)；亞胺培南、美羅培南和厄他培南等藥敏紙片(英國Oxoid公司)；血瓊脂平板、M-H平板(鄭州安圖生物公司)；頭孢他啶/阿維巴坦藥敏紙片、3-氨基苯硼酸(APB)和EDTA試劑(上?？股匮芯克佡?；碳青霉烯酶耐藥基因檢測(實時熒光PCR法)試劑盒(美國賽沛公司)。

1.3細(xì)菌鑒定及藥敏試驗 用飛行質(zhì)譜儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定。60株CRO菌株中，2株用K-B紙片擴散法、58株用PhoenixTM-100革蘭陰性桿菌藥敏板進(jìn)行藥敏試驗。參照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)2020年版文件判斷結(jié)果[2]，用儀器專家系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果判定和分析修正。

1.4碳青霉烯酶表型篩選

1.4.1改良碳青霉烯滅活試驗(mCIM)聯(lián)合EDTA改良碳青霉烯滅活試驗(eCIM) CLSI推薦mCIM聯(lián)合eCIM用于腸桿菌目細(xì)菌和銅綠假單胞菌中碳青霉烯酶的檢測。mCIM和eCIM試驗按照2020年CLSI M100文件要求進(jìn)行操作。

1.4.2碳青霉烯酶抑制劑增強試驗 碳青霉烯酶抑制劑增強試驗是根據(jù)A類絲氨酸碳青霉烯酶的活性可被3-氨基苯硼酸(APB)抑制[3]，而金屬β-內(nèi)酰胺酶的活性可被EDTA抑制的特點[4-5]，APB聯(lián)合EDTA可對單產(chǎn)A類絲氨酸碳青霉烯酶、單產(chǎn)B類金屬β-內(nèi)酰胺酶以及同時產(chǎn)生A類絲氨酸碳青霉烯酶和B類金屬β-內(nèi)酰胺酶的腸桿菌目細(xì)菌進(jìn)行檢測并區(qū)分[6]。實驗步驟：將待測菌調(diào)制成0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏木鷳乙?，均勻涂布于M-H瓊脂平板上，隨后貼4張亞胺培南紙片于瓊脂表面。1張紙片不加任何液體，1張紙片滴加APB溶液(濃度為30 mg/L)10 μL，1張紙片滴加EDTA溶液(濃度0.1 mol/L)10 μL，最后1張同時滴加APB溶液和EDTA溶液。過夜溫育后量取紙片抑菌圈直徑。結(jié)果判讀如下：(1)添加APB溶液的亞胺培南紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差≥5 mm，即可判斷該受試菌株產(chǎn)A類碳青霉烯酶；(2)添加EDTA溶液的亞胺培南紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差≥5 mm，即可判斷該受試菌株產(chǎn)生B類金屬β-內(nèi)酰胺酶；(3)如僅同時添加APB和EDTA的亞胺培南紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差≥5 mm，可判斷該受試菌株同時產(chǎn)A類碳青霉烯酶和B類金屬β-內(nèi)酰胺酶。

1.5實時熒光PCR法檢測碳青霉烯酶基因型 用GeneXpert全自動熒光定量PCR檢測儀，按照碳青霉烯酶耐藥基因檢測試劑盒說明書檢測5種基因型(KPC、IMP1、NDM、VIM和OXA-48)。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用WHONET 5.6軟件。

2 結(jié)果

2.1菌種分布 60株CRO菌株包括碳青霉烯類耐藥的腸桿菌目細(xì)菌(CRE)51株(85.0%)和銅綠假單胞菌9株(15.0%)。其中，CRE包括肺炎克雷伯菌20株(39.22%)、陰溝腸桿菌13株(25.49%)、大腸埃希菌11株(21.57%)、雷極普羅威登菌5株(9.80%)、弗勞地枸櫞酸桿菌2株(3.92%)。

2.2科室分布 60株CRO菌株中，59株(98.33%)分離自住院患者，1株(1.67%)分離自骨科門診患者。住院患者分離菌株來自ICU 20株(33.33%)、神經(jīng)外科9株(15.00%)、泌尿科9株(15.00%)、燒傷科8株(13.33%)、普外科4株(6.67%)、腦血管外科3株(5.00%)、骨科2株(3.33%)和其他科室3株(5.00%)。

2.3標(biāo)本來源 60株CRO菌株分離自痰液20株(33.33%)、尿液14株(23.33%)、傷口分泌物11株(18.33%)、血液7株(11.67%)、穿刺液3株(5.00%)、靜脈導(dǎo)管2株(3.33%)和引流液2株(3.33%)。

2.4碳青霉烯酶表型篩選結(jié)果

2.4.1mCIM聯(lián)合eCIM檢測結(jié)果 產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶17株(肺炎克雷伯菌16株、弗勞地枸櫞酸桿菌1株)，產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶39株(陰溝腸桿菌12株、大腸埃希菌11株、雷極普羅威登菌5株、銅綠假單胞菌6株、肺炎克雷伯菌4株和弗勞地枸櫞酸桿菌1株)，4株(銅綠假單胞菌3株和陰溝腸桿菌1株)為陰性。

2.4.2碳青霉烯酶抑制劑增強試驗結(jié)果 產(chǎn)A類絲氨酸碳青霉烯酶17株(肺炎克雷伯菌16株、弗勞地枸櫞酸桿菌1株)；產(chǎn)B類金屬β-內(nèi)酰胺酶38株(陰溝腸桿菌12株、大腸埃希菌11株、雷極普羅威登菌5株、銅綠假單胞菌6株和肺炎克雷伯菌4株)；混合型(產(chǎn)A+B類酶)1株(弗勞地枸櫞酸桿菌)；4株(銅綠假單胞菌3株和陰溝腸桿菌1株)為陰性。

2.5碳青霉烯酶基因型檢測結(jié)果 NDM型32株(陰溝腸桿菌12株、大腸埃希菌11株、雷極普羅威登菌5株、肺炎克雷伯菌4株)；KPC型17株(肺炎克雷伯菌16株、弗勞地枸櫞酸桿菌1株)；IMP1型6株，均為銅綠假單胞菌；KPC+NDM混合型1株，為弗勞地枸櫞酸桿菌；4株(銅綠假單胞菌3株和陰溝腸桿菌1株)未檢出碳青霉烯酶。肺炎克雷伯菌以產(chǎn)A類絲氨酸碳青霉烯酶，攜帶KPC型基因為主，占80%(16/20)；產(chǎn)B類金屬酶,攜帶NDM基因占20%(4/20)；陰溝腸桿菌、大腸埃希菌和雷極普羅威登菌均為產(chǎn)B類金屬β-內(nèi)酰胺酶,攜帶NDM基因為主，占92.31%(12/13)和100%(11/11，5/5)。

2.6表型篩選和GeneXpert熒光PCR方法結(jié)果的比較 碳青霉烯酶抑制劑增強試驗檢測結(jié)果與PCR方法的檢測結(jié)果完全相符，陽性和陰性的符合率均為100%。mCIM聯(lián)合eCIM檢測結(jié)果與碳青霉烯酶抑制劑增強試驗、PCR方法的陰性符合率為100%，僅將1株產(chǎn)2種碳青霉烯酶的弗勞地枸櫞酸桿菌檢測為單產(chǎn)金屬酶。

2.7抗菌藥物耐藥性 CRO菌株對臨床常用抗菌藥物中青霉素類、頭孢菌素類和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合藥(阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦和頭孢哌酮/舒巴坦)呈現(xiàn)100%耐藥，對氨基糖苷類、喹諾酮類和復(fù)方磺胺甲噁唑抗菌藥物呈現(xiàn)較低敏感性，對替加環(huán)素和新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合藥即頭孢他啶/阿維巴坦抗菌藥物呈現(xiàn)較高的敏感性。見表1。

表1 CRO菌株對臨床常用抗菌藥物的耐藥率(%)

3 討論

本研究結(jié)果提示，ICU、神經(jīng)外科、泌尿科和燒傷科的患者是CRO感染的高危人群，對這些科室的患者要做好隔離與防護(hù),醫(yī)務(wù)人員要做好手衛(wèi)生以及環(huán)境的清潔與消毒，嚴(yán)防此類菌株在醫(yī)院和患者之間傳播。

采用表型篩選和GeneXpert熒光PCR方法對60株CRO菌株檢測結(jié)果的比較，mCIM聯(lián)合eCIM檢測結(jié)果將1株產(chǎn)2種碳青霉烯酶的弗勞地枸櫞酸桿菌檢測為僅產(chǎn)金屬酶。碳青霉烯酶抑制劑增強試驗檢測結(jié)果與PCR方法的檢測結(jié)果完全相符，陽性和陰性的符合率均為100%。由此可見，mCIM聯(lián)合eCIM試驗和碳青霉烯酶抑制劑增強試驗雖然需時較長(要溫育24～28 h)，但操作簡便、成本低、無需特殊設(shè)備，敏感性和特異性較高，是各級臨床微生物實驗室常規(guī)開展碳青霉烯酶檢測的有效表型檢測方法。但mCIM聯(lián)合eCIM試驗只能準(zhǔn)確檢測單一酶，不能準(zhǔn)確檢測混合酶。而GeneXpert全自動熒光定量PCR檢測方法雖操作簡單、需時較短(約1 h出結(jié)果)、能準(zhǔn)確檢出CRO攜帶碳青霉烯酶的基因型，但需要特殊儀器與試劑，成本高，臨床微生物實驗室常規(guī)開展還不現(xiàn)實。

我院CRO菌株的產(chǎn)碳青霉烯酶情況分析顯示，其中肺炎克雷伯菌是以產(chǎn)A類絲氨酸碳青霉烯酶、攜帶KPC型基因為主，產(chǎn)B類金屬酶、攜帶NDM基因為輔，陰溝腸桿菌、大腸埃希菌和雷極普羅威登菌均為產(chǎn)B類金屬β-內(nèi)酰胺酶、攜帶NDM基因為主，與Zhang等[7]研究結(jié)果一致。銅綠假單胞菌主要產(chǎn)B類金屬酶,攜帶IMP1基因為主，占62.5%，與國內(nèi)多家醫(yī)院報道的結(jié)果基本一致[8-10]。另有4株(銅綠假單胞菌3株和陰溝腸桿菌1株)為陰性結(jié)果，很有可能是細(xì)菌外膜蛋白的缺失或數(shù)量減少并伴有高表達(dá)的AmpC酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生，有待進(jìn)一步研究。

結(jié)果顯示，我院CRO菌株對臨床常用抗菌藥物中青霉素類、頭孢菌素類和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合藥呈現(xiàn)100%耐藥，對氨基糖苷類、喹諾酮類和復(fù)方磺胺甲噁唑抗菌藥物敏感性較小，對替加環(huán)素和新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合藥即頭孢他啶/阿維巴坦抗菌藥物呈現(xiàn)較高的敏感性。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)A類絲氨酸碳青霉烯酶攜帶KPC型基因的細(xì)菌對頭孢他啶/阿維巴坦這種新型加酶抑制復(fù)合藥均敏感；產(chǎn)B類金屬酶的細(xì)菌對頭孢他啶/阿維巴坦這種新型加酶抑制復(fù)合藥均耐藥，與文獻(xiàn)報道內(nèi)容完全一致[1]。故實驗室及時開展CR0耐藥機制的檢測，并在微生物檢驗結(jié)果的報告單中提示CR0的耐藥機制，對臨床合理使用抗菌藥物十分重要。