李康，黃洋，石繼春，王春娥，徐瀟，陳瓊，趙丹，葉強

(中國食品藥品檢定研究院生物制品檢定所細菌多糖和結合疫苗室，中國醫(yī)學細菌保藏管理中心，北京 102629)

肺炎鏈球菌是引起兒童肺炎球菌性疾病的主要病原菌，其感染可引起急性中耳炎、鼻竇炎、肺炎、腦膜炎、菌血癥等[1]。根據(jù)莢膜多糖抗原的不同，肺炎鏈球菌可以分為90多個血清型[2]。肺炎鏈球菌標準菌株是研制肺炎鏈球菌疫苗及診斷試劑重要的原材料，因此肺炎鏈球菌的質量控制至關重要。傳統(tǒng)的肺炎鏈球菌質量控制方法如培養(yǎng)特性、染色鏡檢、生化反應、膽汁溶菌試驗、奧普托欣試驗、莢膜腫脹試驗等在肺炎鏈球菌的分離、鑒定和質量控制中發(fā)揮了重要的作用[3-4]，但部分菌株缺乏相關的分子生物學數(shù)據(jù)，無法準確分辨菌株之間的差異，質量標準有待進一步提升。因此，本研究主要針對中國醫(yī)學細菌保藏管理中心(National Center for Medical Culture Collections, CMCC)保藏的13株肺炎鏈球菌標準菌株，在傳統(tǒng)質量檢定的基礎上，進行16S rRNA基因分析和多位點序列分型(multilocus sequence type, MLST)，補充這些菌株分子生物學質控數(shù)據(jù)，為進一步完善肺炎鏈球菌的質量標準提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1菌種 13株肺炎鏈球菌標準菌株CMCC(B)31001、31439、31447、31456、31477、31495、31510、31547、31310、31228、31687、31761和31267來源于CMCC。

1.2主要儀器與試劑 NU-5810E型CO2培養(yǎng)箱(NUAIRE公司)，BX-51型生物顯微鏡(OLYMPUS公司)，microTyper MS飛行時間質譜系統(tǒng)(江蘇天瑞公司)，PTC-0200型基因擴增儀、powerpac型電泳儀電源、Gel Doc XR+型凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。哥倫比亞血瓊脂(BD公司)，肺炎鏈球菌分型血清或因子血清(丹麥血清學研究所)，細菌基因組DNA提取試劑盒(Tiangen公司)，Premix Taq和DL2000(TaKaRa公司)，PCR引物由上海英濰捷基公司合成。

1.3培養(yǎng)特性及顯微形態(tài)觀察 13株肺炎鏈球菌標準菌株劃線于含5%羊血的哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃、5% CO2倒置培養(yǎng)過夜，觀察菌落形態(tài)，并進行革蘭染色觀察菌株的顯微形態(tài)。

1.4血清凝集試驗 在潔凈的載玻片上，取少量過夜培養(yǎng)的新鮮菌苔與適量生理鹽水混合制備菌懸液。分別與等量的肺炎鏈球菌分型血清或因子血清混勻，放置片刻，出現(xiàn)明顯凝集現(xiàn)象的判定為陽性(+)，呈均勻渾濁現(xiàn)象的為陰性(-)，以生理鹽水作為對照。

1.5質譜鑒定 菌種經過夜培養(yǎng)后，參照參考文獻[5]中所述直涂法進行質譜鑒定。譜圖分析得分大于2.0，鑒定結果達到種水平置信。

1.6肺炎鏈球菌分子質控方法

1.6.1DNA的提取 肺炎鏈球菌經過夜培養(yǎng)后，刮取菌體。參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.216S rRNA基因分析 參照文獻[6]，以提取的基因組DNA為模板，PCR擴增13株肺炎鏈球菌標準菌株16S rRNA基因序列。PCR產物委托上海生工生物公司進行Sanger法測序。測序使用ABI 3730XL測序儀及其配套試劑。將測序結果與EZ BioCloud(https://www.ezbiocloud.net/identify)數(shù)據(jù)庫進行比對分析，并應用MEGA軟件將測序結果序列與肺炎鏈球菌模式株NCTC 7465的16S rRNA基因序列(LN831051)進行系統(tǒng)進化分析。

1.6.3MLST 參照文獻[6]，以提取的基因組DNA為模板，PCR擴增7種管家基因aroE、gdh、gki、recP、spi、xpt和ddl。PCR產物委托上海生工生物公司進行Sanger法測序。測序使用ABI 3730XL測序儀及其配套試劑。將測序得到的基因序列與肺炎鏈球菌MLST數(shù)據(jù)[7]進行比對，獲得等位基因編號(或者申請新的編號)，所有等位基因編號組成菌株最終的基因序列型ST(aroE-gdh-gki-recP-spi-xpt-ddl)或申請新的ST編號。

2 結果

2.1培養(yǎng)特性及顯微形態(tài)觀察 13株肺炎鏈球菌標準菌株經培養(yǎng)過夜后，菌落形態(tài)均呈圓形、濕潤、灰白色或灰色，并且有草綠色的α溶血現(xiàn)象。革蘭染色符合肺炎鏈球菌的特征，革蘭染色陽性，呈雙球或短鏈狀排列。圖1所示為菌株CMCC(B)31228菌落形態(tài)和革蘭染色結果。

圖1 CMCC(B)31228菌落形態(tài)(左)和革蘭染色(右)結果

2.2血清凝集試驗 結果顯示，除CMCC(B)31228和CMCC(B)31267外，其余11株肺炎鏈球菌均與相應的肺炎鏈球菌分型血清或因子血清產生凝集反應。CMCC(B)31228顯示15b-、15c+、15e-、15h-的凝集結果，型別判定為15A型。CMCC(B)31267顯示35a+、35b-、35c+、29b+、42a-的凝集結果，型別判定為35B型。見表1。

2.3質譜鑒定 13株菌株質譜鑒定結果均為肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)，且分值在2.08～2.32之間，鑒定準確度高，見表1。圖2所示為CMCC(B)31001質譜鑒定結果。

圖2 CMCC(B)31001質譜鑒定結果

表1 13株肺炎鏈球菌標準菌株的血清凝集及質譜鑒定結果

2.416S rRNA基因分析 13株肺炎鏈球菌標準菌株DNA經16S rRNA基因特異性引物擴增后均擴增出預期大小約1 500 bp的16S rRNA基因片段，與EZ BioCloud數(shù)據(jù)庫比對后，與肺炎鏈球菌模式株NCTC 7465的16S rRNA基因序列(LN831051)的相似性均在99.00%以上，系統(tǒng)進化分析結果顯示，CMCC(B)31439和CMCC(B)31456與肺炎鏈球菌模式株NCTC 7465同屬于一個分支，其他11株肺炎鏈球菌屬于另一分支，見圖3。

圖3 13株肺炎鏈球菌菌株與模式菌株16S rRNA基因的系統(tǒng)進化分析

2.5MLST分型 13株肺炎鏈球菌標準菌株共分為13個ST型，分別為ST2296、ST180、ST2759、ST3844、ST12973、ST12977、ST3545、ST16632、ST875、ST10189、ST870、ST342和ST7234。菌株CMCC(B)31547的ST16632為新發(fā)現(xiàn)的ST型。

3 討論

CMCC保藏有大量不同時期收集的不同型別的肺炎鏈球菌國家標準菌種，這些菌種常被用于教學、科研、質量控制、疫苗研發(fā)以及診斷試劑參考品研制等。因此，確保肺炎鏈球菌國家標準菌種質量穩(wěn)定、可靠、可溯源具有重要意義。傳統(tǒng)的質量控制方法已被廣泛應用于肺炎鏈球菌的分離、鑒定和質量控制[3]，但傳統(tǒng)方法主要以區(qū)分菌株的表型差異為主，不能很好地區(qū)分相同表型的不同菌株之間的差別。近年來，16S rRNA基因分析、PCR血清分型、MLST分型、PFGE分型和基因組測序等分子生物學技術在多種病原微生物的質量控制和溯源分析中都發(fā)揮了重要作用，是傳統(tǒng)菌株質量控制方法的有力補充[6,8-11]。本研究采用培養(yǎng)特性、染色鏡檢、血清學試驗和質譜鑒定方法對CMCC保藏的13株肺炎鏈球菌標準菌株進行初步質量復核，進一步測定了菌株的16S rRNA基因序列，結果顯示16S rRNA基因分析結果與質譜鑒定結果一致。與質譜鑒定方法一樣，雖然測定16S rRNA基因序列能很方便地鑒定菌株是否為肺炎鏈球菌，并進行系統(tǒng)進化分析，但是無法區(qū)分不同型別的肺炎鏈球菌，在肺炎鏈球菌菌株的溯源中存在一定的局限。

MLST分型方法因具有很高的分辨能力，易實現(xiàn)標準化和不同實驗室間的對比分析，已成為研究分子進化和分子流行病學的重要手段[12]。本研究對13株肺炎鏈球菌標準菌株的MLST分型結果顯示，共分為13個ST型，說明肺炎鏈球菌的MLST序列呈現(xiàn)良好的多樣性和辨識度，可以作為一種分子標簽用于不同型別肺炎鏈球菌菌株的鑒定和溯源分析。有研究報道，11A、15A、35B和23A等多藥耐藥的肺炎鏈球菌血清型有增加的趨勢[13]。國內疫苗研發(fā)企業(yè)也在考慮將24F和35B型用于多價肺炎球菌結合疫苗的研發(fā)[14]。本研究前瞻性地對CMCC保藏的15A型和35B型肺炎鏈球菌進行了檢定和分析，獲得了15A型菌株CMCC(B)31228和35B型菌株CMCC(B)31267的16S rRNA基因序列和MLST分型數(shù)據(jù)。

綜上，本研究獲得了13株不同型別的肺炎鏈球菌標準菌株的16S rRNA基因序列信息和MLST分型數(shù)據(jù)，完善了肺炎鏈球菌標準菌株的檔案信息，為肺炎鏈球菌菌株溯源和質量標準的進一步完善提供了數(shù)據(jù)支撐。