曾超，吳迪，丘文，周宏偉，沈薇

(1. 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院新生兒科，廣州 510515； 2. 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣州 510282)

喂養(yǎng)不耐受(feeding intolerance，F(xiàn)I)，指新生兒腸內(nèi)喂養(yǎng)后出現(xiàn)嘔吐、腹脹、胃潴留、血便等臨床表現(xiàn)，在早產(chǎn)兒中具有較高的發(fā)病率(25%～53%)[1-3]。該疾病與特定新生兒胃腸道不成熟或腸道功能障礙密切相關(guān)[4]，常是壞死性小腸結(jié)腸炎或敗血癥等嚴(yán)重疾病的早期臨床表現(xiàn)[4-5]。對(duì)于胎齡<34周的非晚期早產(chǎn)兒，輸血是生命早期較為常見的醫(yī)療干預(yù)措施[5]。有研究報(bào)道，輸血可能是FI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[6]，尤其是進(jìn)行紅細(xì)胞輸注可引發(fā)缺氧腸組織再灌注損傷[7]，進(jìn)而增加壞死性小腸結(jié)腸炎風(fēng)險(xiǎn)[8-10]。近年來，腸道菌群紊亂在壞死性小腸結(jié)腸炎中的角色日益受到關(guān)注[11]，而輸血可否通過改變腸道菌群影響FI，進(jìn)而對(duì)壞死性小腸結(jié)腸炎發(fā)揮作用未見報(bào)道。本研究回顧性分析輸血對(duì)FI事件的潛在影響，初步探索輸血治療的早產(chǎn)兒出現(xiàn)腸道FI表型與腸道菌群內(nèi)環(huán)境間潛在關(guān)聯(lián)。

1 對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象 以2021年3月至2021年6月南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院新生兒科重癥監(jiān)護(hù)室(NICU)住院收治的早產(chǎn)兒為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)胎齡<34周或出生體重<2 000 g；(2)出生后即轉(zhuǎn)入新生兒科病房，存活>7 d；(3)獲家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有多發(fā)畸形、遺傳代謝性疾病，伴有血流動(dòng)力學(xué)改變的動(dòng)脈導(dǎo)管未閉或其他紫紺型心臟病；(2)存在需要外科干預(yù)的疾病；(3)存在先天性免疫缺陷性疾病，或母親合并免疫性疾??；(4)生后1周內(nèi)進(jìn)行過輸血治療或輸注過血液制品；(5)出院或因其他疾病轉(zhuǎn)院時(shí)尚未達(dá)足量喂養(yǎng)等出院標(biāo)準(zhǔn)者。根據(jù)生后第1周后是否輸注紅細(xì)胞，分為輸血組和對(duì)照組。本研究通過南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院倫理委員會(huì)審查并獲批準(zhǔn)(NFEC-2021-054)。

1.2資料收集 采用回顧性分析。觀察至生后4周或出院時(shí)間。依據(jù)患兒病情，遵循科室臨床診療規(guī)范，統(tǒng)一確定紅細(xì)胞輸血量、輸血標(biāo)準(zhǔn)及輸血持續(xù)時(shí)間。早產(chǎn)兒均為配方奶喂養(yǎng)，喂養(yǎng)間隔時(shí)間3 h。輸血前1～2 h及輸血期間奶量減半，輸血結(jié)束后喂養(yǎng)量恢復(fù)干預(yù)前體積。調(diào)查輸血組在輸血起始干預(yù)后2周內(nèi)以及對(duì)照組在對(duì)應(yīng)周齡段是否發(fā)生FI及其臨床特征(包括腹脹、嘔吐、暫停喂養(yǎng)等癥狀次數(shù))。并采集兩組達(dá)全胃腸內(nèi)喂養(yǎng)時(shí)間、住院時(shí)長等資料。FI診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)中國醫(yī)師協(xié)會(huì)新生兒科醫(yī)師分會(huì)循證專業(yè)委員會(huì)指定的《早產(chǎn)兒喂養(yǎng)不耐受臨床診療指南(2020)》，具體為：胃殘余量超過前一次喂養(yǎng)量的50%，伴有嘔吐和/或腹脹；或喂養(yǎng)計(jì)劃失敗，包括減少、延遲或中斷腸內(nèi)喂養(yǎng)[12]。

收集患兒性別、出生體重、胎齡，出生時(shí)是否有窒息缺氧，生后第1周是否合并急性呼吸窘迫綜合征和感染性疾病等一般資料。其中感染性疾病特指細(xì)菌感染，包括：羊膜腔內(nèi)感染、早發(fā)型新生兒敗血癥(包含臨床敗血癥)、化膿性腦膜炎、肺炎等，與新生兒窒息及新生兒呼吸窘迫綜合征均參照人民衛(wèi)生出版社第5版《實(shí)用新生兒學(xué)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]。

1.3標(biāo)本采集 采集輸血組輸血后的第1周、第2周2次糞便樣本，如期間多次輸血?jiǎng)t以第1次輸血為準(zhǔn)。該時(shí)間節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)于對(duì)照組生后第3周至第4周出生周齡，采集對(duì)照樣本。所有樣本采集時(shí)均使用一次性糞便采樣管，收集尿布上非表層糞便0.5 g，置入無菌凍存管，迅速保存于-80 ℃待測。

1.4主要儀器與試劑 Nano Drop 2000超微量分光光度計(jì)(美國Thermo Scientific公司)，VII7000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，Illumina iSeq 100(美國Illumina公司)；QIAamp Mini Kit(德國Qiagen公司)， PCR檢測試劑盒(美國Invitrogen公司)，蛋白酶K(美國Sigma公司)，Phix溶液(美國Illumina公司)，分析純異丙醇、無水乙醇和氯仿(廣東光華化學(xué)廠)。

1.5方法

1.5.1DNA提取 -80 ℃保存的糞便樣本，置于4 ℃融解后，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒QIAamp Mini Kit，參照試劑盒說明書，提取糞便菌群總DNA。用Nano Drop 2000超微量分光光度計(jì)檢測DNA濃度及純度，DNA產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2PCR擴(kuò)增 以16S rRNA V4區(qū)作為擴(kuò)增靶標(biāo)，選用V4可變區(qū)的上游引物 514F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′、下游引物805R：5′-CCGGACTACNVGGTWTCTAAT-3′，對(duì)糞便總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上述引物插入序列不同的條碼序列以區(qū)分樣本。擴(kuò)增體系20 μL，包括：2×SYBR qPCR Master Mix 10 μL，ROX Reference Dye2 0.4 μL，514F 0.4 μL，805R 0.4 μL，DNA 2 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR循環(huán)條件為：94 ℃ 2 min；90 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s,30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；5 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

1.5.316S rRNA測序 根據(jù)樣本定量PCR擴(kuò)增曲線中的最高值G，計(jì)算各個(gè)樣本所需混樣量，同一批次PCR樣本均勻混樣后純化，以Phix溶液將混樣稀釋成50 pmol/L濃度的DNA溶液，取20 μL用于上機(jī)測序。開啟Illumina iSeq 100平臺(tái)，點(diǎn)擊GenerateFASTQ2.0.0.9模式進(jìn)行建庫，選擇Nextera XT工具，設(shè)計(jì)雙末端堿基測序長度為161，命名測序項(xiàng)目，然后點(diǎn)擊Sequence按平臺(tái)默認(rèn)程序測序。測序結(jié)束后查看測序數(shù)據(jù)質(zhì)量，確認(rèn)Phix數(shù)據(jù)占有量接近30%，去掉重復(fù)克隆簇后的測序量/總測序量(ClusterPF%)大于75%。

1.5.4生物信息學(xué)分析 使用DADA2(版本1.6.0)對(duì)每個(gè)糞便樣本的16S rRNA測序讀數(shù)進(jìn)行去噪以生成擴(kuò)增子序列變體(amplicon sequence variants，ASV)。通過PyNAST算法比對(duì)代表性序列并通過FastTree構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。基于Greengene(版本13.8)數(shù)據(jù)庫，使用RDP分類器的默認(rèn)參數(shù)對(duì)ASV進(jìn)行物種注釋。來自試劑對(duì)照的ASV被排除在下游分析之外。所有后續(xù)的生物統(tǒng)計(jì)分析均使用QIIME(版本1.9.1)軟件或R語言(版本4.0.5)進(jìn)行。根據(jù)ASV的注釋結(jié)果，分別在各個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)各樣本的物種相對(duì)豐度，繪制菌群堆疊圖、柱狀圖展示菌群構(gòu)成；同時(shí)分析ASV的分類比對(duì)結(jié)果，比較在輸血組和對(duì)照組中觀察到的ASV，以Y表示輸血組，N表示對(duì)照組，對(duì)兩組的菌群數(shù)據(jù)分別進(jìn)行α多樣性分析及β多樣性相異矩陣分析。通過主成分分析(principal component analysis，PCA)圖對(duì)兩組數(shù)據(jù)的相似性進(jìn)行可視化，用于顯示基于β多樣性相異矩陣和排列多元方差分析(PERMANOVA)的樣本之間的差異，進(jìn)行999次置換來估計(jì)分組β多樣性的統(tǒng)計(jì)顯著性。

2 結(jié)果

2.1入組患兒基礎(chǔ)資料 本研究共納入早產(chǎn)兒33例，其中生后第1周后進(jìn)行過紅細(xì)胞輸注早產(chǎn)兒共14例，為輸血組；同期無輸血史早產(chǎn)兒19例，為對(duì)照組。兩組早產(chǎn)兒的性別、胎齡、出生體重以及基礎(chǔ)疾病等一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，組間具有可比性。見表1。

表1 兩組患兒一般臨床資料比較

2.2FI事件比較 輸血組中12例發(fā)生FI事件(85.7%)，相關(guān)FI癥狀數(shù)為(7.7±5.4)次/人；對(duì)照組出現(xiàn)7例FI(36.8%)，其相關(guān)癥狀數(shù)為(6.7±5.9)次/人。兩組早產(chǎn)兒FI事件發(fā)生率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)，但兩組FI患兒間癥狀頻次差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.712)。見表2。兩組達(dá)到全胃腸內(nèi)喂養(yǎng)所需的時(shí)間、住院時(shí)長及住院花費(fèi)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究兩組患兒觀察至4周齡，均未發(fā)生壞死性小腸結(jié)腸炎。

表2 兩組發(fā)生喂養(yǎng)不耐受(FI)事件的比較

2.3腸道菌群比較 研究共獲得來源于33例早產(chǎn)兒的糞便樣本55份。測序并經(jīng)質(zhì)控后，共獲得610 515條序列，有效序列為10 758(7 416，13 060)條/樣本。經(jīng)DADA2去噪后得到1 476個(gè)ASV，歸一化到3 180條序列后，保留55個(gè)樣本和1 379個(gè)ASV進(jìn)行下游分析。根據(jù)細(xì)菌門水平(Phylum)分類展示，該階段早產(chǎn)兒輸血組與對(duì)照組總體構(gòu)成相似(圖1)，其腸道菌群以厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)為主，并存在一定比例的放線菌門(Actinobacteria)及擬桿菌門(Bacteroidetes)細(xì)菌。在非輸血組，還觀察到少數(shù)個(gè)體腸道以浮霉菌門(Verrucomicrobia)為優(yōu)勢(shì)豐度菌。

注：Y，輸血組；N，對(duì)照組。

依據(jù)ASV水平的菌群多樣性分析，四類α多樣性指數(shù)，無論是Chao1(反應(yīng)物種總數(shù))、observed otu(物種豐富度指數(shù))、PD_whole_tree(系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù))、Shannon(香農(nóng)指數(shù)，同時(shí)反映物種豐富度及均勻度)，兩組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2A-D。在β多樣性分析中，依據(jù)Bray-Curtis距離(基于ASV的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)比較兩個(gè)群落微生物的組成差異)的PCA，輸血干預(yù)組與對(duì)照組呈區(qū)分趨勢(shì)，但P值為0.089，見圖2E。

注：Y，輸血組；N，對(duì)照組；A,Chao1;B，observed_otus;C，PD_whole_tree;D，Shannon;E,PCA。

在屬水平，發(fā)現(xiàn)兩組間的特定菌豐度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。輸血組葡萄球菌屬(Staphylococcus)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)顯著高于對(duì)照組；而腸球菌屬(Enterococcus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)及阿克曼氏菌(Akkermansia)則顯著下降。

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)歷輸血事件早產(chǎn)兒治療結(jié)束后2周內(nèi)，F(xiàn)I發(fā)生率顯著高于對(duì)照組。盡管樣本量較小，但本研究中對(duì)照組FI發(fā)生率與文獻(xiàn)報(bào)道一致[1-3]，提示本研究結(jié)果相對(duì)可靠。既往研究主要關(guān)注輸血干預(yù)與新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎發(fā)生率間關(guān)聯(lián)，但二者間是否存在顯著關(guān)聯(lián)，系統(tǒng)評(píng)價(jià)結(jié)果并不一致[6-7,10,14]。從FI發(fā)展為新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎，存在復(fù)雜的外界環(huán)境(包括喂養(yǎng)、機(jī)械通氣、藥物等)及個(gè)體病理進(jìn)程(缺氧、感染等)多因素影響[15]。本研究結(jié)果提示，以FI為首要終點(diǎn)事件，將更有利于揭示輸血事件與不良腸道事件間的潛在關(guān)聯(lián)，從而為未來的臨床干預(yù)提供新線索。

盡管兩組間FI發(fā)生率存在顯著差異，但兩組間發(fā)生FI事件患兒的臨床表現(xiàn)并無差別，且兩組最終達(dá)到全胃腸內(nèi)喂養(yǎng)時(shí)間及住院時(shí)長差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果提示輸血事件并未導(dǎo)致更嚴(yán)重的FI，且對(duì)于病情的恢復(fù)及整體治療影響較小。其中一項(xiàng)潛在的原因是，本研究單位輸血治療時(shí)常規(guī)采取奶量減半喂養(yǎng)保護(hù)策略，可能減小了輸血對(duì)腸道的干擾。另外，本研究中部分早產(chǎn)兒由于住院時(shí)間不足4周而只留取到1份樣本，可能使結(jié)果產(chǎn)生一定的偏倚；同時(shí)，發(fā)生FI患兒均未發(fā)生壞死性小腸結(jié)腸炎，存在一定的幸存者偏倚。

注：Y，輸血組；N，對(duì)照組；Abundance,豐度。

本研究發(fā)現(xiàn)，輸血組葡萄球菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬相對(duì)豐度增加，雙歧桿菌屬及腸球菌屬相對(duì)豐度減少。雙歧桿菌是健康嬰兒腸道主要優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)腸道和宿主的發(fā)育具有重要作用[11]；健康早產(chǎn)兒腸球菌的相對(duì)豐度顯著高于FI早產(chǎn)兒[16]；葡萄球菌、寡養(yǎng)單胞菌與壞死性小腸結(jié)腸炎、敗血癥發(fā)病高度相關(guān)[17]。絕大多數(shù)早產(chǎn)兒均接受多種抗菌藥物治療，對(duì)腸道菌群整體產(chǎn)生顯著影響。因此，輸血組與對(duì)照組間α及β多樣性差異均不顯著。但兩組間差異菌與既往報(bào)道的FI及壞死性小腸結(jié)腸炎存在關(guān)聯(lián)，提示腸道菌群在上述疾病中可能具有潛在的因果作用，其具體機(jī)制值得深入探討。

本研究不足之處在于樣本量偏小，未能對(duì)是否紅細(xì)胞輸注、輸血量、輸血次數(shù)等進(jìn)行進(jìn)一步的亞組分析，無法為腸損傷機(jī)制研究提供線索。從菌群角度，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，將有助于探明輸血是否可以改變腸道菌群β多樣性，并為探明特定腸道菌作為FI乃至壞死性小腸結(jié)腸炎風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測新型標(biāo)志物提供可能。