師志云，尹曉麗，王良方，侯曉惠，張玉英，李剛，王菊英，王文，賈偉

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，銀川 750004；2.寧夏臨床病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004)

細(xì)胞自噬是先天免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的重要組成部分，在防御細(xì)菌感染中起著重要作用[1-2]。深入研究細(xì)菌自噬的機(jī)制及其與細(xì)胞的相互作用有助于發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染的新致病機(jī)制。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cells type Ⅱ, AECⅡ)與自噬的功能有相同之處，在肺臟抵御外源微生物感染中也具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用[3]。本課題組前期建立了體外肺炎克雷伯菌感染AECⅡ模型，通過上調(diào)或抑制自噬程度進(jìn)一步證實(shí)肺炎克雷伯菌能夠誘導(dǎo)AECⅡ A549發(fā)生自噬[4]。Notch信號(hào)是進(jìn)化上保守的信號(hào)級(jí)聯(lián)，對(duì)細(xì)胞分化、發(fā)育和體內(nèi)平衡的正常生物學(xué)過程至關(guān)重要[5]。最新研究表明，Notch信號(hào)可作為自噬的底物，參與機(jī)體自噬過程[6]。本研究通過抑制細(xì)胞自噬及Notch信號(hào)，觀察肺炎克雷伯菌對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞自噬、Notch信號(hào)及炎癥因子的影響，探討Notch信號(hào)調(diào)控肺泡上皮細(xì)胞自噬在肺炎克雷伯菌感染中的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究肺炎克雷伯菌的分子致病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，為臨床治療肺炎克雷伯菌提供新的線索。

1 材料與方法

1.1菌株與細(xì)胞株 肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 700603(美國(guó)ATCC)，人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞株A549(中科院細(xì)胞庫(kù))。

1.2試劑和儀器 TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，SYBR Premix Ex Taq(中國(guó)TaKaRa公司，RR820A)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(中國(guó)TaKaRa公司，RR047A)，RNAiso Plus(中國(guó)TaKaRa公司，9108)，Human INF-γ ELISA試劑盒(CSB-E04577h)、Human TNF-α ELISA試劑盒(CSB-E04740h)(中國(guó)cusabio公司)，Human IL-1β ELISA試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司，KHC0011)，雷帕霉素(rapa)、3-甲基腺嘌呤(3-MA，美國(guó)Sigma公司)，γ-分泌酶抑制劑(DAPT，美國(guó)Sellect公司)，LC3抗體及β-actin抗體(英國(guó)Abcam公司)。Stepone plus熒光定量PCR(美國(guó)ABI公司)，SDS-PAGE電泳儀、濕法轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，Tanon5200化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)(中國(guó)Tanon公司)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，去除DMEM培養(yǎng)基，加入PBS洗1～2次，去除PBS后，加入1 mL胰酶消化1～3 min后，加入3 mL完全培養(yǎng)基中和胰酶終止消化，將消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min。棄上清液，加入3 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，1∶3傳代至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

1.4實(shí)驗(yàn)分組 A549細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，以1×108個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板中。肺炎克雷伯菌以3個(gè)感染時(shí)間點(diǎn)(24 h、48 h、72 h)及細(xì)菌、細(xì)胞感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)比100∶1感染A549細(xì)胞，分為4組：A549對(duì)照組，A549+肺炎克雷伯菌-24 h，A549+肺炎克雷伯菌-48 h，A549+肺炎克雷伯菌-72 h，每組3個(gè)樣本，分別在24 h、48 h、72 h感染點(diǎn)應(yīng)用自噬抑制劑3-MA(終濃度5 mmol/L)和γ-分泌酶抑制劑DAPT(終濃度10 μmol/L)處理肺炎克雷伯菌感染的A549細(xì)胞，收集各組A549細(xì)胞用于熒光定量PCR、western-blot及ELISA檢測(cè)。

1.5熒光定量PCR檢測(cè)LC3 Ⅱ及Notch1 mRNA含量[4]使用TRlzol試劑從A549細(xì)胞提取總RNA，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)50 μL溶解，測(cè)定RNA純度和濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix Ex Taq進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR分析。以GAPDH為內(nèi)參，引物由上海生工生物公司合成，LC3：F:5′-GCGCTACAAGGGTGAGAAG-3′，R:5′-CCGGATGATCTTGACCAACTC-3′；Notch1：F:5′-AGGCAATCCGAGGACTATGA-3′，R:5′-CTCAGAACGCACTCGTTGAT-3′；GAPDH：F:5′-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′，R:5′-AGTAGAGGCAGGGATGATGT-3′。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，并繪制熔解曲線。2-ΔΔCt計(jì)算分析mRNA相對(duì)表達(dá)水平變化。

1.6western blot檢測(cè)LC3 Ⅱ及Notch1蛋白質(zhì)表達(dá)水平[4]抽取4組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549總蛋白，BCA法測(cè)蛋白質(zhì)濃度后-80 ℃保存。調(diào)整各組總蛋白濃度使每孔上樣量一致，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳分離后通過半干電轉(zhuǎn)儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗膜3次，每次5 min；一抗4 ℃過夜，TBST洗膜4次，每次5 min；溫育二抗，37 ℃搖床1 h，TBST洗膜4次，每次5 min；化學(xué)發(fā)光，曝光，定影；凝膠成像儀進(jìn)行圖像處理，采用Quantity-one軟件分析目的條帶的累積光密值(IOD值)，以內(nèi)參GAPDH作為參照。

1.7ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子INF-γ、TNF-α及IL-1β水平 吸取4組細(xì)胞上清液置于EP管中，12 000 r/min、4 ℃離心10 min。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，INF-γ、TNF-α及IL-1β檢測(cè)下限分別為6.25 pg/mL、7.8 pg/mL、1 pg/mL。

2 結(jié)果

2.1肺炎克雷伯菌感染肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞對(duì)細(xì)胞自噬、Notch信號(hào)及細(xì)胞因子的影響

2.1.1熒光定量PCR及western blot檢測(cè) LC3、Notch1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)與未感染肺炎克雷伯菌的A549細(xì)胞相比，感染組(24 h、48 h和72 h)肺炎克雷伯菌促進(jìn)A549細(xì)胞自噬蛋白LC3 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著增高(P<0.05)；同時(shí)促進(jìn)Notch信號(hào)，即Notch1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著增高(P<0.05)。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，LC3和Notch1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量逐漸增加，見表1、圖1。

表1 作用不同時(shí)間的肺炎克雷伯菌對(duì)A549細(xì)胞LC3和Notch1 mRNA的表達(dá)影響

圖1 作用不同時(shí)間的肺炎克雷伯菌對(duì)A549 細(xì)胞LC3和Notch1的表達(dá)影響

2.1.2ELISA檢測(cè) INF-γ、TNF-α及IL-1β的含量與未感染肺炎克雷伯菌的A549細(xì)胞相比，感染組(24 h，48 h和72 h)A549細(xì)胞上清中IL-1β、TNF-α、INF-γ含量顯著增高(P<0.05)。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，3個(gè)因子的含量有逐漸上升趨勢(shì)，見表2。

表2 作用不同時(shí)間的肺炎克雷伯菌對(duì)A549細(xì)胞上清中IL-1β、TNF-α、INF-γ含量變化(pg/mL)

2.2抑制自噬對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞Notch信號(hào)及細(xì)胞因子的影響

2.2.1熒光定量PCR及western blot檢測(cè)LC3、Notch1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá) 用3-MA 抑制細(xì)胞自噬，肺炎克雷伯菌對(duì)A549細(xì)胞的LC3和Notch1的mRNA表達(dá)均有顯著下降(P<0.05)，即抑制細(xì)胞自噬可影響Notch信號(hào)Notch1 mRNA的表達(dá)。與對(duì)照組比較，Notch1 和LC3表達(dá)量隨著肺炎克雷伯菌處理時(shí)間增加而增加，3-MA處理后其表達(dá)量下降(P<0.05)。見表3、圖2。

圖2 A549細(xì)胞用肺炎克雷伯菌和3MA處理后Notch1和LC3蛋白的表達(dá)影響

表3 3-MA對(duì)A549細(xì)胞中LC3和Notch1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

注：*，與Ctrl比較，P<0.05；#，與KPN-24 h比較，P<0.05；&，與KPN-48 h比較，P<0.05；^，與KPN-72 h比較，P<0.05。

2.2.2ELISA檢測(cè)INF-γ、TNF-α及IL-1β的含量 與對(duì)照組比較，A549細(xì)胞IL-1β、TNF-α、INF-γ含量隨著肺炎克雷伯菌處理時(shí)間增加而顯著增加(P<0.05)，3-MA處理后其含量下降。見表4。

表4 3-MA對(duì)A549細(xì)胞上清中IL-1β、TNF-α、INF-γ含量變化(pg/mL)

2.3抑制Notch信號(hào)對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞自噬及細(xì)胞因子的影響

2.3.1熒光定量PCR及western blot檢測(cè) LC3、Notch1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)應(yīng)用DAPT 抑制細(xì)胞Notch信號(hào)，肺炎克雷伯菌對(duì)A549細(xì)胞的LC3和Notch1的mRNA表達(dá)均有顯著下降(P<0.05)。與對(duì)照組比較，Notch1表達(dá)量隨著肺炎克雷伯菌處理時(shí)間增加而增加，DAPT處理后其表達(dá)量下降(P<0.05)；LC3隨著處理時(shí)間增加而表達(dá)量增加，DAPT處理后在48 h前其表達(dá)量下降，72 h表達(dá)量在DAPT處理后略有上升。見表5、圖3。

圖3 A549細(xì)胞用肺炎克雷伯菌和DAPT處理后Notch1和LC3的表達(dá)影響

表5 DAPT對(duì)A549細(xì)胞中LC3和Notch1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

注：*，與Ctrl比較，P<0.05；#，與KPN-24 h比較，P<0.05；&，與KPN-48 h比較，P<0.05；^，與KPN-72 h比較，P<0.05。

2.3.2ELISA 檢測(cè)INF-γ、TNF-α及IL-1β的含量與對(duì)照組比較，A549細(xì)胞IL-1β、TNF-α、INF-γ含量隨著肺炎克雷伯菌處理時(shí)間增加而顯著增加(P<0.05)，DAPT處理后其含量下降，見表6。

表6 DAPT對(duì)A549細(xì)胞上清中IL-1β、TNF-α，INF-γ含量變化(pg/mL)

3 討論

肺炎克雷伯菌是一種胞外菌，可以黏附并侵入多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，包括肺泡上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并能在感染的宿主細(xì)胞內(nèi)獲取必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而存活。研究證實(shí)，Notch信號(hào)通路在胎肺發(fā)育、AECⅡ的增殖和分化過程中呈時(shí)序性表達(dá)，推測(cè)Notch信號(hào)可能在決定AECⅡ細(xì)胞行為中起重要作用[7]。研究表明，Notch1 信號(hào)通路與其他細(xì)胞信號(hào)通路，如Akt、Ras、NF-κB、Wnt、EGFR、PDGF 等[8-9]，可互為激活，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡中發(fā)揮重要作用。目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)都研究了Notch信號(hào)在巨噬細(xì)胞免疫反應(yīng)中起的重要作用及Notch信號(hào)精細(xì)調(diào)節(jié)肺發(fā)育及肺上皮細(xì)胞的增殖、分化。然而，對(duì)于Notch信號(hào)在肺臟感染肺炎克雷伯菌的過程中，其所在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞是否也對(duì)先天免疫發(fā)揮調(diào)控作用知之甚少。

前期結(jié)果表明，體外肺炎克雷伯菌能夠誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549發(fā)生自噬[4]，但具體的分子機(jī)制有待研究。本研究結(jié)果顯示，利用體外肺炎克雷伯菌感染人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549模型，感染組A549細(xì)胞在感染后24 h、48 h和72 h能明顯上調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3及Notch信號(hào)中Notch1的表達(dá)，且隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，LC3、Notch1表達(dá)量逐漸增加，表明肺炎克雷伯菌能夠激活Notch信號(hào)通路，誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞自噬，進(jìn)一步說(shuō)明肺炎克雷伯菌可能通過Notch信號(hào)通路參與肺泡上皮細(xì)胞自噬，為研究肺炎克雷伯菌致病的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

自噬在調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)中具有重要作用，并影響細(xì)胞因子的產(chǎn)生[10]。如布魯桿菌感染期間，LC3依賴的自噬途徑抑制布魯氏菌病患者的單核細(xì)胞中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的產(chǎn)生[11]。有研究表明，細(xì)胞因子也能影響自噬產(chǎn)生。輔助性T細(xì)胞Th1細(xì)胞因子(如 IFN-γ、TNF-α、IL-1等)已被證明能夠誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生；而經(jīng)典的Th2細(xì)胞因子(如IL-4、IL-10和IL-13)則對(duì)自噬具有抑制作用[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌感染A549細(xì)胞后促進(jìn)細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、INF-γ的產(chǎn)生，隨著時(shí)間(24 h、48 h和72 h)延長(zhǎng)，3個(gè)因子的含量逐漸上升，表明自噬、Notch信號(hào)與炎癥介質(zhì)(細(xì)胞因子)在肺炎克雷伯菌感染肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中可能存在相互促進(jìn)關(guān)系，為肺炎克雷伯菌感染的治療提供一個(gè)新的思路。

本研究在肺炎克雷伯菌感染A549細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，分別應(yīng)用自噬抑制劑3-MA和γ-分泌酶抑制劑DAPT處理細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3-MA抑制細(xì)胞自噬可以顯著下調(diào)A549細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3、Notch1的表達(dá)及炎癥因子的產(chǎn)生，同時(shí)DAPT抑制Notch信號(hào)可以顯著下調(diào)Notch1、LC3的表達(dá)及炎癥因子的產(chǎn)生，表明LC3、Notch1及細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、INF-γ變化趨勢(shì)相同，進(jìn)一步闡述Notch信號(hào)與肺泡上皮細(xì)胞自噬相互作用的分子機(jī)制及自噬作為宿主天然免疫機(jī)制在抵抗肺炎克雷伯菌的感染過程作用的分子機(jī)制，有助于指導(dǎo)臨床治療和預(yù)防肺炎克雷伯菌感染提供理論依據(jù)和新思路，在開發(fā)新藥和改進(jìn)疫苗等方面有重要的指導(dǎo)意義。