姜海瀛，張志杰，王艷雙，張莉，高麗君，李明成,4，孫麗媛，張麗華

1(北華大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林，132013)2(北華大學(xué) 臨床學(xué)院，吉林 吉林，132013)3(北華大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林，132013)4(北華大學(xué) 吉林省中藥DNA指紋檢測(cè)技術(shù)科技創(chuàng)新中心，吉林 吉林，132013)5(吉林市第三十二中學(xué)，吉林 吉林，132013)6(吉林雷寧食品藥品檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司，吉林 吉林，132013)

肉類食品安全已經(jīng)成為全球關(guān)注的公共安全問題，比如“歐洲的馬肉風(fēng)波”[1]、“沃爾瑪狐貍?cè)馐录盵2]等。肉類食品質(zhì)量的好壞尤其是肉食品的真實(shí)性直接關(guān)系到人民群眾健康和生命安全。普通消費(fèi)者難以通過感官分辨摻假肉食品，執(zhí)法部門目前也缺乏簡(jiǎn)便有效快速的實(shí)地檢測(cè)技術(shù)手段，對(duì)摻假管控乏力。

基于蛋白的檢測(cè)手段，由于不同組織細(xì)胞和不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)水平不同，易受熱加工變性的影響，用于肉類食品的鑒定存在局限性[3-4]。相反，核酸作為生物體的基本遺傳物質(zhì), 廣泛存在于各種組織細(xì)胞中即無組織特異性，但在同種生物體內(nèi)核酸序列具有高度的保守性即具有種屬特異性。并且，耐熱性更好，結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，更有利于物種鑒別[5]。

是一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)快速的檢測(cè)方法。能夠準(zhǔn)確、快速、客觀地鑒別肉類食品成分的動(dòng)物來源，已經(jīng)廣泛地用于食品摻假成分的檢測(cè)[6-7]。本團(tuán)隊(duì)利用多重PCR技術(shù)可快速高通量鑒定牛肉中常見摻假動(dòng)物源性成分[8]。核酸試紙條是一種快速的免疫學(xué)測(cè)定方法[9]，具有簡(jiǎn)單、快速、可視化、低成本等特點(diǎn)。PCR-核酸試紙條法融合二者的特點(diǎn)，目前此技術(shù)已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因黑曲霉[10]、艾滋病毒[11]、丙型肝炎病毒[12]、線蟲[13]、乙型肝炎病毒[14]、農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、獸醫(yī)疫病的檢測(cè)[15]中得到應(yīng)用，適合基層單位就地檢測(cè)，被認(rèn)為是食品安全檢測(cè)最有前途的新技術(shù)之一，已成為食品安全檢測(cè)的主要發(fā)展趨勢(shì)[16-17]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)樣品：牛肉、豬肉、馬肉、羊肉、驢肉、雞肉、鴨肉、狗肉、兔肉等均購于本地超市。實(shí)測(cè)樣本購于本地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。樣品為鮮品，生理鹽水洗滌3次，去結(jié)締組織和脂肪，保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

Q6000超微量紫外-可見分光光度計(jì)，美國(guó)Quawell；T100 PCR儀、UV White-2020D紫外凝膠成像分析儀，美國(guó)Bio Rad公司；H-2050R高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；LX-100手掌型離心機(jī)，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DYY-8B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京市六一儀器廠；HH.S精密恒溫水浴鍋，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

DL100 bp DNA Marker、λDNA/HindⅢ、2×TaqPCR Master Mix、氨芐青霉素(ampicillin，Amp)、5-溴4-氯-3-吲哚-β-D硫代半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside，X-Gal)、異丙基β-D硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DNA凝膠回收試劑盒、pGM-T載體連接試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；引物由上海生物工程有限公司合成；一次性核酸試紙條，杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 基因組DNA的提取及質(zhì)量鑒定

1.4.1.1 基因組DNA的提取

取肉類樣品各100 mg置于1.5 mL離心管中，剪碎；加入P1細(xì)胞裂解液500 μL [ 10%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)10 mL，1 mol/L Tris-HCl(pH值7.5) 1 mL，0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 2 mL，NaCl 0.58 g，20 mg/mL 蛋白酶K 1 mL，RNA酶5 μL，加滅菌ddH2O定容至100 mL]，振蕩混勻，55 ℃ 水浴1 h；加到DNA純化柱中，12 000 r/min離心3 min，棄去過濾液，加入P2漂洗液600 μL [5 mol/L 乙酸鉀26 μL，l mol/L Tris-HCl(pH 7.5) 18 μL，0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 3 μL，無水乙醇480 μL，無菌ddH2O 73 μL ]，12 000 r/min離心1 min；棄去過濾液，重復(fù)洗滌1次，棄去過濾液，12 000 r/min離心2 min；將DNA純化柱轉(zhuǎn)移入另一離心管中，加入P3無菌ddH2O 100 μL，室溫放置10～20 min后，12 000 r/min離心2 min；離心液即供試品DNA溶液，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1.2 基因組DNA的質(zhì)量鑒定

利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的完整性，并且取基因組DNA原溶液1 μL，利用微量核酸蛋白分析儀，分析樣品的濃度(A260×50 ng/μL)及純度(A260/A280)。

1.4.2 基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增及結(jié)果檢測(cè)

1.4.2.1 引物的設(shè)計(jì)與標(biāo)記

牛肉引物序列來自GB/T 20190—2006[18]，分別在引物的5′端進(jìn)行標(biāo)記，引物序列如下：上游引物5′(FAM)-ATGCTTAGAAGGGATGA-3′，下游引物5′(Biotin)-TAGGGAGGCTATTACG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為271 bp，由上海生物工程有限公司合成。

1.4.2.2 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

取牛肉及其他肉類樣品基因組DNA溶液、空白對(duì)照液各2 μL，加入試劑盒中PCR反應(yīng)管23 μL反應(yīng)體系中(其中10 μmol/μL上游引物、下游引物各1 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，滅菌ddH2O 8.5 μL)，總體積25 μL。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性5 min，20～30個(gè)循環(huán)(94 ℃ 30 s，56～59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃延伸5 min。

1.4.2.3 PCR產(chǎn)物檢測(cè)

取PCR產(chǎn)物5 μL 加到2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠孔中，在1×TBE電泳緩沖液中，100 V電泳40 min后，取凝膠在紫外分析儀上檢視并拍照。取PCR產(chǎn)物5 μL滴加到試紙條的樣品區(qū)，然后插入到含有95 μL展開緩沖液的試管中，2～3 min后即可見檢測(cè)結(jié)果并拍照。

1.4.2.4 結(jié)果判定

供試品凝膠電泳圖譜中，在與陽性對(duì)照品凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置上，在200～300 bp有1條DNA條帶，空白對(duì)照無條帶。供試品核酸試紙條圖譜中，在與陽性對(duì)照品核酸試紙條圖譜相應(yīng)的位置上，出現(xiàn)2條紅色條帶，空白對(duì)照出現(xiàn)1條紅色條帶。

1.4.3 牛肉陽性對(duì)照品的克隆及序列驗(yàn)證

回收牛肉陽性對(duì)照品 PCR產(chǎn)物與pGM-T載體16 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，增殖4 h后取菌液30 μL涂布于含Amp、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37 ℃過夜，挑取白色菌落，在含Amp的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證為陽性重組DNA分子，送至上海生工采用正反2個(gè)引物雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與靶基因進(jìn)行比對(duì)分析。擴(kuò)增區(qū)域DNA序列與牛靶基因特異性指紋區(qū)段DNA序列完全一致，同源性100%，確定為牛肉DNA陽性對(duì)照液。

1.4.4 牛肉DNA檢測(cè)試劑盒的設(shè)計(jì)

試劑盒為20次用量，由8部分組成，包括DNA提取、PCR擴(kuò)增和結(jié)果檢測(cè)(表1)。

表1 自主研發(fā)牛肉DNA提取、PCR擴(kuò)增和結(jié)果檢測(cè)試劑盒的組成及特征Table 1 Composition and characteristics of self-developed beef DNA extraction, PCR amplification and results detection kit

1.4.5 試劑盒的評(píng)價(jià)

1.4.5.1 特異性

對(duì)牛肉正品及其他肉類樣品在59 ℃,20個(gè)循環(huán)條件下進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增，核酸試紙條檢測(cè)試劑的特異性，并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4.5.2 重現(xiàn)性

對(duì)牛肉正品及其他肉類樣品分別在3個(gè)實(shí)驗(yàn)室，由3位技術(shù)人員檢測(cè)相同樣品，核酸試紙條檢測(cè)觀察試劑的重現(xiàn)性，并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4.5.3 穩(wěn)定性

試劑盒配制后第3、6、9、12個(gè)月進(jìn)行檢測(cè)，核酸試紙條檢測(cè)試劑的穩(wěn)定性，并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4.5.4 靈敏性

將牛肉正品DNA對(duì)照液進(jìn)行101、102、103、104、105倍稀釋，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，核酸試紙條檢測(cè)試劑的靈敏性，并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4.5.5 樣品最低檢出限

將牛肉正品及其他肉類樣品(牛肉100 mg、其他肉類各0 mg，牛肉30 mg、其他肉類各8.75 mg，牛肉20 mg、其他肉類各10 mg，牛肉10 mg、其他肉類各11.25 mg，牛肉5 mg、其他肉類各11.875 mg)進(jìn)行混合，提取基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用核酸試紙條檢測(cè)試劑的最低檢出率，并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

使用自主研發(fā)的試劑盒對(duì)市售9個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，核酸試紙條鑒定樣品的真?zhèn)?，并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的提取及質(zhì)量鑒定結(jié)果

采用自主研發(fā)的試劑能夠成功的提取出牛肉及其易混品的基因組DNA，經(jīng)測(cè)定純度為1.7～1.9，質(zhì)量濃度為200～300 ng/μL。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，基因組DNA無降解(圖1)。

2.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件的優(yōu)化及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

如圖2所示，利用GB/T 20190—2006中的反應(yīng)條件，在56 ℃，30個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，牛肉出現(xiàn)1條陽性條帶，但是馬和羊肉出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶，其余陰性對(duì)照及空白對(duì)照均無條帶出現(xiàn)。

M-λDNA/HindⅢ；1-豬肉；2-牛肉；3-馬肉；4-羊肉；5-驢肉；6-雞肉；7-鴨肉；8-狗肉圖1 基因組DNA電泳圖譜Fig.1 Electrophoretic map of genomic DNA

M-DL100 bp Marker；1-牛肉陽性對(duì)照；2-牛肉正品1；3-牛肉正品2；4-豬肉；5-馬肉；6-羊肉；7-驢肉；8-雞肉；9-鴨肉；10-狗肉；11-兔肉；N-空白對(duì)照a-退火溫度56 ℃,30個(gè)循環(huán)；b-退火溫度57 ℃,25個(gè)循環(huán)；c-退火溫度59 ℃,25個(gè)循環(huán)；d-退火溫度59 ℃,20個(gè)循環(huán)圖2 PCR反應(yīng)條件篩選圖譜Fig.2 Screening map of PCR reaction conditions

在57 ℃，25個(gè)循環(huán)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，只有牛肉樣品出現(xiàn)1條陽性條帶，其余陰性對(duì)照及空白對(duì)照均無條帶出現(xiàn)。但是核酸試紙條檢測(cè)結(jié)果顯示，牛肉樣品出現(xiàn)質(zhì)控線(C線)、檢測(cè)線(T線)2條紅色條帶，而馬、羊、驢肉樣品均出現(xiàn)2條紅色條帶(C線明顯、T線均隱約可見)，其余陰性對(duì)照及空白對(duì)照均出現(xiàn)C線1條紅色帶。

在59 ℃，25個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，只有牛肉樣品出現(xiàn)1條陽性條帶，其余陰性對(duì)照及空白對(duì)照均無條帶出現(xiàn)。但是核酸試紙條檢測(cè)結(jié)果顯示，牛肉樣品出現(xiàn)C線、T線2條紅色條帶，而此時(shí)只有馬肉樣品出現(xiàn)2條紅色條帶(C線明顯、T線均隱隱約約可見)，其余陰性對(duì)照及空白對(duì)照均出現(xiàn)C線1條紅色帶。

在59 ℃，20個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，只有牛肉樣品出現(xiàn)1條陽性條帶，其余陰性對(duì)照及空白對(duì)照均無條帶出現(xiàn)。核酸試紙條檢測(cè)結(jié)果顯示，只有牛肉樣品出現(xiàn)C線、T線2條紅色條帶，陰性對(duì)照及空白對(duì)照均出現(xiàn)C線1條紅色帶。

因此，PCR反應(yīng)條件定為59 ℃，20個(gè)循環(huán)。

2.3 牛肉標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液的克隆及序列驗(yàn)證結(jié)果

經(jīng)過分子克隆篩選，可見氨芐陽性平皿出現(xiàn)藍(lán)-白菌落(圖3)。挑區(qū)白色菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，退火溫度59 ℃時(shí)，在271 bp有1條特異性DNA條帶(圖4)。將牛肉質(zhì)粒DNA送至上海生工進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示擴(kuò)增區(qū)域DNA序列與牛線粒體DNA特異性指紋區(qū)段DNA序列完全一致，同源性為100%(圖5)，將牛肉質(zhì)粒DNA作為牛肉陽性對(duì)照液，裝入牛肉PCR-核酸試紙條快速檢測(cè)試劑盒中。

a-Amp；b-Amp+牛圖3 牛肉DNA分子克隆藍(lán)-白斑篩選圖譜Fig.3 DNA molecular clone blue-white selection of beef

M-DL100 bp Marker；1-牛肉陽性對(duì)照；N-空白對(duì)照?qǐng)D4 牛肉質(zhì)粒DNA PCR電泳圖譜Fig.4 PCR electrophoresis map of beef plasmid DNA

圖5 牛肉質(zhì)粒DNA測(cè)序與牛靶基因比對(duì)結(jié)果圖譜Fig.5 Comparis on results of beef plasmid DNA sequencing and bos target gene

2.4 試劑盒評(píng)價(jià)結(jié)果

2.4.1 特異性

對(duì)牛肉正品及其他肉類樣品在59 ℃,20個(gè)循環(huán)條件下進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增，核酸試紙條檢測(cè)結(jié)果顯示，只有牛肉樣品出現(xiàn)C線、T線2條紅色條帶，陰性對(duì)照及空白對(duì)照均出現(xiàn)C線1條紅色帶。瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證正確(圖6)。表明自主研發(fā)的試劑盒特異性強(qiáng)。

M-DL100 bp Marker;1-牛肉陽性對(duì)照DNA克隆液；2-牛肉陽性對(duì)照；3-牛肉正品；4-豬肉；5-馬肉；6-羊肉；7-驢肉；8-雞肉；9-鴨肉；10-狗肉；11-兔肉；N-空白對(duì)照?qǐng)D6 PCR-核酸試紙條快速檢測(cè)試劑盒特異性圖譜Fig.6 Specificity map of PCR-nucleic acid strip fast detection kit

2.4.2 重現(xiàn)性

對(duì)牛肉正品及其他肉類樣品分別在3個(gè)實(shí)驗(yàn)室，由3位技術(shù)分析人員檢測(cè)相同樣品，核酸試紙條檢測(cè)結(jié)果顯示，只有牛肉樣品出現(xiàn)C線、T線2條紅色條帶，陰性對(duì)照及空白對(duì)照均出現(xiàn)C線1條紅色帶。瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證正確(圖7)。表明自主研發(fā)的試劑盒重現(xiàn)性好。

2.4.3 穩(wěn)定性

分別在試劑盒配制后第3、6、9、12個(gè)月進(jìn)行檢測(cè)。核酸試紙條檢測(cè)結(jié)果顯示，只有牛肉樣品出現(xiàn)C線、T線2條紅色條帶，陰性對(duì)照及空白對(duì)照均出現(xiàn)C線1條紅色帶。瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證正確(圖8)。表明自主研發(fā)的試劑盒穩(wěn)定性良好，試劑盒的保質(zhì)期可以暫定1年。

M-DL100 bp Marker；1-牛肉陽性對(duì)照DNA克隆液；2-牛肉陽性對(duì)照；3-牛肉正品；N-空白對(duì)照a-3個(gè)月；b-6個(gè)月；c-9個(gè)月；d-12個(gè)月圖8 PCR-核酸試紙條快速檢測(cè)試劑盒穩(wěn)定性圖譜Fig.8 Stability map of PCR-nucleic acid strip fast detection kit

2.4.4 靈敏性

核酸試紙條檢測(cè)結(jié)果顯示，DNA原液、稀釋101、102倍模板出現(xiàn)的T線、C線2條紅色條帶明顯，稀釋103、104倍的模板出現(xiàn)T線、C線2條紅色條帶(C線明顯、T線條帶隱約可見)，稀釋105倍模板與空白對(duì)照只出現(xiàn)C線1條紅色條帶。而瓊脂糖凝膠電泳稀釋102倍模板無電泳條帶出現(xiàn)。表明核酸試紙條法的靈敏度至少高于瓊脂糖凝膠電泳法10倍(圖9)。

2.4.5 樣品最低檢出限

核酸試紙條檢測(cè)結(jié)果顯示只要取樣的混合肉樣中含有5 mg的牛肉，就可檢定出陽性結(jié)果。瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證一致(圖10)。

M-DL100 bp Marker；1-DNA原液；2-稀釋101倍；3-稀釋102倍；4-稀釋103倍；5-稀釋104倍；6-稀釋105倍；N-空白對(duì)照?qǐng)D9 PCR-核酸試紙條快速檢測(cè)試劑盒靈敏性圖譜Fig.9 Sensitivity map of PCR-nucleic acid strip fast detection kit

M-DL100 bp Marker；1-牛肉100 mg，其他肉類各0 mg；2-牛肉30 mg，其余肉類各8.75 mg；3-牛肉20 mg，其他肉類各10 mg；4-牛肉10 mg，其他肉類各11.25 mg；5-牛肉5 mg，其他肉類各11.875 mg；N-空白對(duì)照?qǐng)D10 PCR-核酸試紙條快速檢測(cè)盒最低檢出限圖譜Fig.10 Minimum detection limit map of PCR-nucleic acid strip fast detection kit

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

使用自主研發(fā)的試劑盒對(duì)市售9個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)真?zhèn)舞b定，核酸試紙條檢測(cè)結(jié)果顯示，牛肉陽性對(duì)照液、陽性對(duì)照和9個(gè)樣品均出現(xiàn)2條紅色條帶，空白對(duì)照出現(xiàn)1條紅色帶。瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證正確(圖11)。表明本地市場(chǎng)牛肉安全性良好。

M-DL100 bp Marker;1-牛肉陽性對(duì)照DNA克隆液；2-牛肉陽性對(duì)照；N-空白對(duì)照；3,4,5-生牛肉；6,7,8-熟牛肉；9,10,11-牛肉片圖11 PCR-核酸試紙條快速檢測(cè)盒檢測(cè)實(shí)際樣品圖譜Fig.11 Map of real samples detected by PCR-nucleic acid strip fast detection kit

3 討論

PCR-核酸試紙條檢測(cè)原理，引物的5′端分別標(biāo)記羧基熒光素(fluorescein,F)和生物素(biotin,B)，則PCR產(chǎn)物都帶有2種標(biāo)記物，取產(chǎn)物5 μL滴加到試紙條的樣品區(qū)，然后插入到含有95 μL展開緩沖液的試管中，展開緩沖液通過毛細(xì)作用向前流動(dòng)進(jìn)行層析，生物素端首先與固定在金標(biāo)墊上的鏈霉親和素的膠體金顆粒結(jié)合，形成復(fù)合物(Au-SA-B)，液相到達(dá)檢測(cè)線(T線)，固定在T線上的抗熒光素抗體捕獲熒光素端，形成形成復(fù)合物(Anti-F-F-Au-SA-B)，停留在T線處，產(chǎn)生紅色條帶，多余的膠體金顆粒被質(zhì)控線(C線)上的B捕獲，使C線也產(chǎn)生紅色條帶，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物不存在時(shí)，膠體金顆粒無法停留在T線處，而被C線上的B捕獲，所以只有C線出現(xiàn)1條紅色條帶[14]。2～3 min后即可見檢測(cè)結(jié)果(圖12)。

S-樣品區(qū)；T-檢測(cè)線；C-質(zhì)控線；Au-納米金粒子；SA-鏈霉親和素；B-生物素；F-熒光素；Anti-F-抗熒光素；BSA-牛血清白蛋白圖12 核酸試紙條法檢測(cè)原理Fig.12 Detection principle of nucleic acid test strip method

在食品安全的實(shí)地監(jiān)督和管控工作中，需要開發(fā)不依賴貴重儀器設(shè)備、簡(jiǎn)單快速、低成本的鑒定方法和檢測(cè)試劑。本研究建立的肉類食品中牛肉PCR-核酸試紙條快速鑒定方法及研發(fā)的配套檢測(cè)試劑盒，為了實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，對(duì)核酸提取、擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測(cè)3個(gè)基本模塊進(jìn)行優(yōu)化和篩選，以期在保證結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前提下，盡量操作簡(jiǎn)便、快速、規(guī)范。

本實(shí)驗(yàn)核酸提取模塊，直接將裂解后的細(xì)胞溶液倒入純化柱中進(jìn)行純化，溶解得到DNA溶液。只需裂解、純化、溶解3步完成核酸的提取，操作步驟簡(jiǎn)單，縮短了提取時(shí)間，得到DNA的濃度、純度、完整性均完全滿足PCR的要求。核酸PCR擴(kuò)增模塊，優(yōu)化退火溫度及循環(huán)次數(shù)，使得在最短的時(shí)間內(nèi)59 ℃,20個(gè)循環(huán)所得PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果最佳，擴(kuò)增時(shí)間與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)相比縮短了30 min。PCR產(chǎn)物檢測(cè)模塊，采用核酸試紙條檢測(cè)2～3 min即出現(xiàn)可視化的結(jié)果，操作簡(jiǎn)便快捷，與凝膠電泳檢測(cè)相比節(jié)省1 h，并且不需要電泳裝備和紫外裝置參與，更適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

本研究將3個(gè)模塊整合到一起，包括DNA提取試劑(P1、P2、P3)、PCR檢測(cè)試劑(23 μL PCR反應(yīng)體系中，其中10 μmol/μL上、下游引物各1 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，滅菌ddH2O 8.5 μL)、核酸試紙條以及陽性對(duì)照液、空白對(duì)照液。只需將提取的DNA溶液2 μL直接加入到23 μL PCR反應(yīng)體系中，就可進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用核酸試紙條進(jìn)行可視化檢測(cè)，同時(shí)提供陽性對(duì)照液、空白對(duì)照液。1個(gè)試劑盒解決了從DNA提取、PCR擴(kuò)增及結(jié)果檢測(cè)的全部操作，直接解決特異性引物設(shè)計(jì)與篩選的技術(shù)難題；又可以避免試劑配制的繁瑣，購買太多試劑造成浪費(fèi)，以及防止不同來源試劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響；并且陽性對(duì)照品以DNA克隆液的形式提供，直接反映了牛肉獨(dú)一無二的DNA序列，避免每次提取對(duì)照品時(shí)誤差的產(chǎn)生，檢測(cè)結(jié)果特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性好、靈敏度更高。

本研究成果同時(shí)具有PCR技術(shù)的特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn),核酸試紙條可視化、簡(jiǎn)便快速、低成本的優(yōu)勢(shì)，試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的特征，更適合執(zhí)法部門和檢測(cè)人員現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。對(duì)于規(guī)范食品生產(chǎn)與流通、保障食品安全具有十分重要的意義。