賀朦迪，張珂睿，陳小龍，范永仙，陳翰馳，朱林江，陸躍樂*

1(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州，310014)2(浙江工業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州，310014)

脂肪酸蔗糖酯是一種非離子型表面活性劑，具有安全無毒、生物相容性好、可生物降解等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于食品、日化品、制藥等行業(yè)[1-7]。例如，蔗糖酯是聯(lián)合國國際糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織推薦使用的食品添加劑[8]。

目前工業(yè)化生產(chǎn)蔗糖酯主要采用化學(xué)法，但是存在高能耗、副產(chǎn)物多、溶劑毒性大等缺點(diǎn)。相比之下，酶法合成蔗糖酯則具有區(qū)域選擇性好、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)品安全性高等優(yōu)點(diǎn)，近年來日益引起人們的關(guān)注[9]。大部分研究者將叔戊醇/二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)二元體系作為反應(yīng)介質(zhì)以促進(jìn)蔗糖的溶解[10-12]。如FERRER等[12]報(bào)道了H.lanuginosa在叔戊醇/DMSO(叔戊醇的體積分?jǐn)?shù)為80%)體系中催化月桂酸蔗糖單酯的合成，產(chǎn)量可達(dá)到30 g/L。但是，DMSO沸點(diǎn)高且毒性大，不利于月桂酸蔗糖單酯的純化和應(yīng)用[9]。因此，使用叔戊醇等低毒性、易處理的溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)具有重要意義。

酶在非水介質(zhì)中的電離狀態(tài)對其催化活性的影響往往會被人們忽視。與水相催化不同，有機(jī)介質(zhì)的介電常數(shù)通常較低[13]，導(dǎo)致酶中的帶電氨基酸與介質(zhì)中帶相反電荷的“反離子”緊密結(jié)合，從而改變酶的電離狀態(tài)，影響酶的催化特性。例如，PARTRIDGE等[14]發(fā)現(xiàn)在枯草桿菌蛋白酶催化N-乙酰-L-酪氨酸乙酯與正丙醇的酯交換反應(yīng)中，在四氫呋喃中加入固態(tài)緩沖對-AMPSO/NaAMPSO，可使反應(yīng)速率從2.2 nmol/(mg·min)提升至52 nmol/(mg·min)[15]?？莶輻U菌蛋白酶與脂肪酶同屬于絲氨酸水解酶，然而，目前并沒有關(guān)于調(diào)控脂肪酶電離狀態(tài)以提高其催化合成蔗糖酯活性的報(bào)道。

蔗糖由于其較高的晶格能在叔戊醇中的溶解度很低(<1 g/L)，極大地限制了蔗糖酯的產(chǎn)量[16]。通過破壞糖類的晶體結(jié)構(gòu)可得到無定形糖類，以提高糖類在有機(jī)溶劑中的溶解度和溶解速率[17]。例如，F(xiàn)LORES等[18]發(fā)現(xiàn)無定形β-葡萄糖在叔戊醇中的溶解度為21 mmol/L，高于晶體β-葡萄糖(17.9 mmol/L)，當(dāng)采用Novozym 435催化無定形β-葡萄糖合成月桂酸葡萄糖酯時(shí)，反應(yīng)速率可從12 μmol/(g·min)提升至16 μmol/(g·min)。然而，目前并沒有關(guān)于使用無定形蔗糖合成月桂酸蔗糖單酯的報(bào)道。

本研究以叔戊醇為反應(yīng)介質(zhì)，以無定形蔗糖和月桂酸乙烯酯為底物，使用去質(zhì)子化劑活化的Novozym 435催化合成月桂酸蔗糖單酯，并對該體系進(jìn)行底物添加量、溫度、酶添加量等因素的優(yōu)化，所得月桂酸蔗糖單酯產(chǎn)量從1.04 g/L提高到23.2 g/L，并且對月桂酸蔗糖單酯合成的區(qū)域選擇性很好，實(shí)現(xiàn)了在低毒性有機(jī)體系中獲得較高蔗糖酯產(chǎn)量的目標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

蔗糖、4?分子篩、叔戊醇、月桂酸鈉、酪蛋白酸鈉等，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；月桂酸乙烯酯、月桂酸蔗糖酯，阿拉丁試劑(上海)有限公司；Novozym 435，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 Infinity II型高效液相色譜儀、1260 Infinity II型蒸發(fā)光檢測器，美國安捷倫公司；Nucleosil C18色譜柱 (5 μm, 250 mm×4.6 mm，100A)，濟(jì)南賽暢科學(xué)儀器有限公司；圓底燒瓶(50 mL)、三頸燒瓶(50 mL)、冷凝管、75 mm研缽，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硅膠GF254薄層板，青島海洋化工廠；DK-8B恒溫水浴鍋，浙江明德儀器有限公司；DZF-6050真空干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ADL311/311S噴霧干燥器，浚和(上海)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 無定形蔗糖的制備

沿用ADHIKARI等[19]報(bào)道的噴霧干燥法制備無定形蔗糖：先在500 mL純水中加入1.25 g酪蛋白酸鈉，50 ℃下緩慢攪拌直至徹底溶解，再加入123.75 g蔗糖，完全溶解后制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的蔗糖溶液(酪蛋白酸鈉可防止無定形蔗糖相互粘連及附著在噴霧干燥器器壁上)。將上述蔗糖-酪蛋白酸鈉溶液進(jìn)行噴霧干燥，條件為：水分蒸發(fā)速率2 kg/h、進(jìn)口溫度170 ℃、出口溫度70 ℃，所得無定形蔗糖在60 ℃真空干燥箱中干燥6 h后備用，最終收率為82.7%。

1.3.2 月桂酸蔗糖單酯的合成

在50 mL圓底燒瓶中加入15 mL叔戊醇、一定量的蔗糖(研磨后的晶體蔗糖或無定形蔗糖)、月桂酸乙烯酯、去質(zhì)子化劑、Novozym 435和4?分子篩，在特定溫度的水浴鍋中反應(yīng)24 h后，使用薄層色譜法(thin-layer chromatography，TLC)及HPLC分析月桂酸蔗糖單酯的含量。當(dāng)反應(yīng)溫度≥70 ℃，使用回流反應(yīng)裝置以防止溶劑的逸散。

1.3.3 TLC分析

沿用李延科等[20]報(bào)道的方法，以硅膠G板為固定相，V(甲苯)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(水)=10∶5∶4.5∶0.2為展開劑，在蔗糖酯上行展開后，用脲-磷酸-水飽和正丁醇溶液顯色，斑點(diǎn)呈藍(lán)色。

1.3.4 HPLC檢測

使用美國安捷倫公司的高效液相色譜儀、Nucleosil C18色譜柱 (5 μm, 250 mm×4.6 mm, 100A)、蒸發(fā)光檢測器進(jìn)行HPLC檢測。以體積分?jǐn)?shù)為90%的甲醇作為流動(dòng)相，流速1.1 mL/min，柱溫為40 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 去質(zhì)子化劑對酶活性的影響

在酯交換反應(yīng)中，?；w水解產(chǎn)生的少量有機(jī)酸會使酶處于質(zhì)子化狀態(tài)，大大降低酶的催化活性[14]。因此，推測在反應(yīng)體系中加入堿性物質(zhì)作為去質(zhì)子化劑，可減少酸性副產(chǎn)物對酶活性的抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)在15 mL叔戊醇中加入3 g/L晶體蔗糖，0.15 mol/L月桂酸乙烯酯，6.7 g/L Novozym 435，20 g/L分子篩，反應(yīng)溫度為60 ℃，同時(shí)分別加入2 g/L的月桂酸鈉、甲酸鈉、乙酸鈉、磷酸氫二鈉及20 μL的三乙胺作為去質(zhì)子化劑調(diào)控Novozym 435的電離狀態(tài)，結(jié)果如圖1所示，相比于對照組，上述去質(zhì)子化劑對Novozym 435均有明顯的活化作用，其中月桂酸鈉對酶活性的提升效果最好，反應(yīng)24 h后，月桂酸蔗糖單酯的產(chǎn)量從1.04 g/L提升至2.1 g/L。

圖1 不同類型的去質(zhì)子化劑對Novozym 435催化合成月桂酸蔗糖單酯的影響Fig.1 The effect of different deprotonants on the catalytic synthesis of sucrose laurate monoester by Novozym 435

隨后，在以上催化條件下對月桂酸鈉的添加量進(jìn)行優(yōu)化。如圖2所示，當(dāng)月桂酸鈉的添加量>2 g/L時(shí)，Novozym 435的酶活性不再提升，可能是因?yàn)樵鹿鹚徕c在叔戊醇中的溶解度較低，而只有溶于體系的少量Na+才能起到調(diào)控作用[14]。然而，經(jīng)探究，有機(jī)可溶的三乙胺添加量對Novozym 435酶活性的影響也不顯著(文中未顯示數(shù)據(jù))。因此，在之后的研究中均在體系中加入2 g/L的月桂酸鈉以活化Novozym 435。

圖2 月桂酸鈉質(zhì)量濃度對Novozym 435催化合成月桂酸蔗糖單酯的影響Fig.2 The effect of concentration of sodium laurate on the catalytic synthesis of sucrose laurate monoester by Novozym 435

2.2 晶體蔗糖和月桂酸乙烯酯添加量對月桂酸蔗糖單酯產(chǎn)量的影響

為探究底物添加量對月桂酸蔗糖單酯產(chǎn)量的影響，本實(shí)驗(yàn)在15 mL叔戊醇中加入6.7 g/L Novozym 435，2 g/L月桂酸鈉，20 g/L分子篩，反應(yīng)溫度為60 ℃，此外分別加入不同濃度的底物。如表1所示。當(dāng)晶體蔗糖添加量為0.03 mol/L，月桂酸乙烯酯添加量為0.15 mol/L時(shí)，反應(yīng)24 h后月桂酸蔗糖單酯的產(chǎn)量為4.26 g/L，遠(yuǎn)高于蔗糖添加量為0.01 mol/L時(shí)的產(chǎn)量(2.02 g/L)?？赡苁且?yàn)轶w系中存在較多未溶解的蔗糖，可以及時(shí)補(bǔ)充反應(yīng)所消耗的蔗糖；但當(dāng)晶體蔗糖添加量>0.03 mol/L時(shí)，體系中大量未溶解的蔗糖會增大傳質(zhì)阻力，抑制反應(yīng)的進(jìn)行[21]。與蔗糖不同，月桂酸乙烯酯在叔戊醇中的溶解性較好，當(dāng)乙烯酯濃度<0.15 mol/L時(shí)，月桂酸蔗糖單酯的產(chǎn)量隨乙烯酯添加量的增加而提高。當(dāng)乙烯酯濃度進(jìn)一步增加時(shí)，月桂酸蔗糖單酯產(chǎn)量略有下降，可能是因?yàn)轶w系中存在大量的乙烯酯會抑制蔗糖的溶解。

表1 晶體蔗糖和月桂酸乙烯酯加量對月桂酸蔗糖單酯產(chǎn)量的影響Table 1 The effect of concentration of crystalline sucrose and vinyl laurate on the yield of sucrose monolaurate

2.3 溫度對月桂酸蔗糖單酯產(chǎn)量的影響

之前的研究表明，Novozym 435對高溫的耐受性較強(qiáng)。如Novozym 435可在82 ℃下催化蔗糖與月桂酸乙酯的酯交換反應(yīng)(叔丁醇回流體系)，反應(yīng)7 d后月桂酸蔗糖單酯的產(chǎn)率達(dá)到35%[16]。為探究溫度對月桂酸蔗糖單酯產(chǎn)量的影響，本實(shí)驗(yàn)在15 mL叔戊醇中加入0.03 mol/L無定形蔗糖，0.15 mol/L月桂酸乙烯酯，6.7 g/L Novozym 435，2 g/L月桂酸鈉，20 g/L 分子篩，并在不同溫度下反應(yīng)，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)反應(yīng)溫度≤75 ℃時(shí)，月桂酸蔗糖單酯產(chǎn)量隨溫度的升高而增加，在75 ℃時(shí),月桂酸蔗糖單酯產(chǎn)量最高，達(dá)到6.42 g/L。這是因?yàn)闇囟壬呖墒拐崽窃谑逦齑贾械娜芙舛仍黾樱龠M(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。隨著溫度進(jìn)一步上升，月桂酸蔗糖單酯產(chǎn)量逐漸下降，可能是因?yàn)闇囟冗^高會降低脂肪酶的活性和穩(wěn)定性，且易使月桂酸蔗糖單酯變性著色，從而降低產(chǎn)量。因此，該反應(yīng)的最適溫度為75 ℃。

圖3 溫度對Novozym 435催化合成月桂酸蔗糖單酯的影響Fig.3 Effect of temperature on the catalytic synthesis of sucrose laurate monoester by Novozym 435

2.4 無定形蔗糖對月桂酸蔗糖單酯產(chǎn)量的影響

蔗糖在反應(yīng)體系中的溶解度及溶解速率是影響蔗糖酯產(chǎn)量的又一關(guān)鍵因素。糖類在有機(jī)溶劑中的溶解度主要取決于其晶格能大小，體現(xiàn)在糖類的熔點(diǎn)上。一般來講，糖類的熔點(diǎn)越高，晶格能越大，在有機(jī)溶劑中的溶解性越差，而蔗糖正是一種晶格能較高的糖類(熔點(diǎn)約為185 ℃)。因此，為驗(yàn)證無定形蔗糖是否具有改善蔗糖在叔戊醇中的溶解特性，實(shí)現(xiàn)對月桂酸蔗糖單酯合成的促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)在15 mL叔戊醇中加入0.15 mol/L月桂酸乙烯酯，6.7 g/L Novozym 435，2 g/L月桂酸鈉，20 g/L分子篩，反應(yīng)溫度為75 ℃，此外，分別加入0.03 mol/L無定形蔗糖和晶體蔗糖，結(jié)果如圖4所示。使用無定形蔗糖可使月桂酸蔗糖單酯產(chǎn)量(24 h)從6.42 g/L提升至11.1 g/L，因此，在之后的研究中均采用無定形蔗糖作為?；荏w合成月桂酸蔗糖單酯(對照組除外)。

圖4 無定形蔗糖對Novozym 435催化合成月桂酸蔗糖單酯的影響Fig.4 Effect of amorphous sucrose on the catalytic synthesis of sucrose laurate monoester by Novozym 435

為探索無定形蔗糖和和月桂酸乙烯酯的添加量對月桂酸蔗糖單脂產(chǎn)量的影響，本實(shí)驗(yàn)在15 mL叔戊醇中加入6.7 g/L Novozym 435，2 g/L月桂酸鈉，20 g/L分子篩，反應(yīng)溫度為75 ℃，此外，分別加入不同濃度的無定形蔗糖和月桂酸乙烯酯，結(jié)果如表2所示。由表2可知，當(dāng)無定形蔗糖添加量為0.09 mol/L，月桂酸乙烯酯添加量為0.15 mol/L時(shí)，月桂酸蔗糖單酯產(chǎn)量可達(dá)到最高值13.71 g/L，轉(zhuǎn)化率為29.1%(24 h)，因此將無定形蔗糖添加量為0.09 mol/L，月桂酸乙烯酯添加量為0.15 mol/L定為最佳底物添加濃度。

表2 無定形蔗糖和月桂酸乙烯酯添加量對月桂酸蔗糖單酯產(chǎn)量的影響Table 2 The effect of concentration of amorphous sucrose and vinyl laurate on the yield of sucrose laurate monoester

2.5 酶添加量對月桂酸蔗糖單酯產(chǎn)量的影響

為探究酶添加量對月桂酸蔗糖單酯產(chǎn)量的影響，本實(shí)驗(yàn)在15 mL叔戊醇中加入0.09 mol/L無定形蔗糖，0.15 mol/L月桂酸乙烯酯，2 g/L月桂酸鈉，20 g/L分子篩，反應(yīng)溫度為75 ℃，結(jié)果如圖5所示，當(dāng)Novozym 435的添加量≤10 g/L時(shí)，月桂酸蔗糖單酯產(chǎn)量隨酶加量的增加顯著提升，繼續(xù)增大酶添加量，蔗糖酯產(chǎn)量緩慢提升，在Novozym 435 的添加量為16.7 g/L時(shí)，月桂酸蔗糖單酯產(chǎn)量達(dá)到最大值16.6 g/L(24 h)，酶添加量>16.7 g/L時(shí)，月桂酸蔗糖單酯產(chǎn)量逐漸下降，主要是因?yàn)轶w系中存在過量的酶會增大傳質(zhì)阻力，抑制反應(yīng)的進(jìn)行[22]，因此最佳的酶添加量為16.7 g/L。

圖5 酶添加量對Novozym 435催化合成月桂酸蔗糖單酯的影響Fig.5 Effect of enzyme addition on the catalytic synthesis of sucrose laurate monoester by Novozym 435

2.6 反應(yīng)時(shí)間對月桂酸蔗糖單酯產(chǎn)量的影響

為探究反應(yīng)時(shí)間對月桂酸蔗糖單酯產(chǎn)量的影響，同時(shí)考察無定形蔗糖和晶體蔗糖作為底物時(shí)最適轉(zhuǎn)化結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)在15 mL叔戊醇中加入0.15 mol/L月桂酸乙烯酯，16.7 g/L Novozym 435，2 g/L月桂酸鈉，20 g/L分子篩，反應(yīng)溫度為75 ℃，再分別加入0.09 mol/L晶體蔗糖和無定形蔗糖，結(jié)果如圖6所示，使用無定形蔗糖作為底物，在60 h后反應(yīng)達(dá)到平衡，在該反應(yīng)條件下，可得到最高的產(chǎn)物濃度和最佳的轉(zhuǎn)化率，此時(shí)月桂酸蔗糖單酯質(zhì)量濃度為23.2 g/L，轉(zhuǎn)化率為49.2%；使用晶體蔗糖作為底物，反應(yīng)平衡時(shí)(55 h)月桂酸蔗糖單酯質(zhì)量濃度為14.9 g/L，轉(zhuǎn)化率為32.5%。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對Novozym 435催化合成月桂酸蔗糖單酯的影響Fig.6 Effect of reaction time on the catalytic synthesis of sucrose laurate monoester by Novozym 435

3 結(jié)論與展望

相比于化學(xué)法，脂肪酶催化合成蔗糖酯具有區(qū)域選擇性高、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)品安全性高等優(yōu)點(diǎn)[23-24]。然而，絕大部分研究者仍以含少量DMSO的叔戊醇作為反應(yīng)介質(zhì)，加大了蔗糖酯純化的難度并使其在食品等領(lǐng)域中的應(yīng)用受限。

本研究以低毒性的叔戊醇作為反應(yīng)介質(zhì)合成月桂酸蔗糖單酯。通過加入去質(zhì)子化劑調(diào)控Novozym 435的電離狀態(tài)，以減小酰基供體水解產(chǎn)生的少量月桂酸對酶活性的抑制作用，并以無定形蔗糖作為底物，提高蔗糖在叔戊醇的溶解度及溶解速率，使得反應(yīng)速率進(jìn)一步提升。實(shí)驗(yàn)表明，在15 mL叔戊醇中，加入0.09 mol/L無定形蔗糖、0.15 mol/L月桂酸乙烯酯、16.7 g/L Novozym 435，2 g/L月桂酸鈉及20 g/L分子篩，在75 ℃下反應(yīng)60 h，月桂酸蔗糖單酯的質(zhì)量濃度達(dá)到23.2 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到49.2%，已接近報(bào)道中在叔戊醇/DMSO(叔戊醇的體積分?jǐn)?shù)為80%)體系中合成蔗糖酯的產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)了一種綠色安全、高效、低成本的月桂酸蔗糖單酯生產(chǎn)方式，為今后的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，也為同類產(chǎn)品的開發(fā)提供了一個(gè)新的工藝優(yōu)化思路。