張倩，韓保林,2，李子健，謝軍,2，余東，鄒永芳，郭輝祥，文靜，張玲玲，羅惠波,2*，黃丹,2*

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 自貢，643000)2(釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川 宜賓，644000)3(舍得酒業(yè)股份有限公司，四川 遂寧，629209)

包包曲，是濃香型白酒釀造過程中重要的糖化發(fā)酵劑[1]，因其塊狀結(jié)構(gòu)一側(cè)具有較大凸起而得名。獨特的“包包”結(jié)構(gòu)使包包曲比一般大曲擁有更大的比表面積，更有利于霉菌等的生長[2]。同時，其外緊內(nèi)松的結(jié)構(gòu)特點[2]，增大了物料的孔隙率，更有利于大曲內(nèi)部和外部的物質(zhì)能量交換和微生物的生長繁殖。包包曲獨特的結(jié)構(gòu)使熱量、水分和氧氣含量等參數(shù)從曲塊外部到內(nèi)部呈梯度分布[3]，造成大曲不同部位微生物群落多樣性，從而導(dǎo)致了曲皮、曲心微生物群落的差異。

研究表明，大曲不同部位往往具有不同的質(zhì)量[4]和微生物群落結(jié)構(gòu)，其差異甚至大于同一環(huán)境下不同制曲方式[5]。不同部位大曲的研究對加深大曲微生物群落的理解有著重要作用。曲皮、曲心的理化、生化特性和基于傳統(tǒng)可培養(yǎng)方式的微生物群落特征及差異已經(jīng)取得了一定的研究成果[4,6]。隨著高通量測序技術(shù)被普遍應(yīng)用于白酒釀造研究[7]，曲皮、曲心微生物群落結(jié)構(gòu)與差異被進(jìn)一步解析。JIN等[8]通過Illumina MiSeq平臺測序發(fā)現(xiàn)醬香型大曲中乳桿菌目(Lactobacillales)在曲皮中豐度更高，而芽孢桿菌目(Bacillales)則在曲心中豐度更高。近期，CHEN等[9]也通過不可培養(yǎng)的手段得出特香型大曲曲皮和曲心微生物間存在顯著差異的結(jié)論。然而，運用高通量測序技術(shù)對曲皮、曲心在大曲發(fā)酵過程中的微生物群落變化情況和差異的報道目前幾乎沒有。

本研究采用高通量測序技術(shù)探究了包包曲發(fā)酵過程中的曲皮和曲心微生物群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，并與理化因子相關(guān)聯(lián)，旨在比較大曲發(fā)酵過程中曲皮、曲心微生物群落的差異及與理化因子的關(guān)系，有助于進(jìn)一步認(rèn)識濃香型白酒包包曲微生物種群多樣性，探明其形成機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：濃香型包包曲樣品源自四川某濃香型白酒廠，分別在發(fā)酵第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、20、23、29天取樣。每次取樣選擇3塊大曲，將大曲表面約1 cm的部分劃為曲皮(QP)，其余部分為曲心(QX)，分別粉碎、混勻、裝袋后，于4 ℃和-80 ℃保存。

試劑：NaOH(分析純)，成都市科龍化工試劑廠；乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，Na2EDTA)、Na2HPO4、NaH2PO4、蝸牛酶、溶菌酶、十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)，生工生物工程(上海)股份有限公司；CHCl3(分析純)，成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PT100溫度傳感器，華巨溫度傳感器有限公司；DHG-9245電熱干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；QL-861漩渦振蕩器，江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；LYNX 6000高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo公司。

1.3 包包曲理化指標(biāo)的測定

包包曲的水分、總酸、pH值采用大曲通用分析方法QB/T 4257—2011[10]測定。包包曲溫度采用溫度傳感器實時測定。

1.4 包包曲總DNA提取和測序

采用CTAB改良法提取大曲總DNA[11]。使用引物338F/806R(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′/5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)5F/ITS1R(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′/5′-GCTGCGTTC TTCATCGATGC-3′)對真菌的ITS1進(jìn)行擴(kuò)增。由上海派森諾生物科技有限公司在Illumina MiSeq 2500平臺上進(jìn)行雙端測序。

1.5 包包曲微生物群落結(jié)構(gòu)分析

按照QIIME 2標(biāo)準(zhǔn)流程對原始序列進(jìn)行處理。使用DADA2對序列進(jìn)行質(zhì)量過濾、去噪、合并和去除嵌合體[12]，使用多樣性插件計算α多樣性指數(shù)。在R(version 4.0.3)的vegan(version 2.5-7)軟件包中進(jìn)行了層次聚類分析、相似性分析(analysis of similarities，ANOSIM)、mantel檢驗和理化因子與優(yōu)勢微生物的Pearson相關(guān)性分析。mantel test分析了基于bray-curtis距離的細(xì)菌、真菌ASV(amplicon sequence variant)相對豐度的距離矩陣和基于歐幾里得距離的理化因子相異性矩陣的Spearman相關(guān)性。使用canoco 4.5進(jìn)行包包曲微生物群落與環(huán)境因子的冗余分析(redundancy analysis，RDA)。通過STAMP(2.1.3)進(jìn)行Fisher′s精確檢驗得到兩樣本的顯著差異微生物。而線性判別分析效應(yīng)值(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)是通過http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/root?tool_id=PICRUSt_normalize網(wǎng)站完成的。

2 結(jié)果與分析

2.1 包包曲發(fā)酵過程中曲皮、曲心理化因子的變化特點

溫度、水分、酸度、pH值是大曲發(fā)酵過程的重要參數(shù)，在一定程度上可以反映大曲微生物的生長環(huán)境或代謝情況。曲心溫度符合“前緩中挺后緩落”的變化特點；曲皮溫度受到翻曲的影響，在第7～12天和第16～18 天有明顯的降低(圖1-a)。曲皮、曲心水分含量呈降低趨勢，并分別在第13～29天和第1～6天變化較??；出房時，曲皮、曲心水分含量分別為12.32%和16.23%。發(fā)酵初期，曲塊水分含量較高，霉菌菌絲沒有大量形成，曲塊處于缺氧環(huán)境。因此，微生物無氧發(fā)酵產(chǎn)生大量酸，尤其是曲心中總酸含量較高，曲皮、曲心pH值在第0～2天迅速下降，之后由于有機(jī)酸參與合成酯類及原料中蛋白質(zhì)的降解，導(dǎo)致了pH值的增加[13]。包包曲的塊狀結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其水分、溫度等理化指標(biāo)從內(nèi)到外呈梯度變化，進(jìn)而導(dǎo)致大曲發(fā)酵過程中，曲皮、曲心的理化因子存在明顯差異，并且這種差異是從發(fā)酵第2天開始的。

a-包包曲溫度和水分含量；b-包包曲總酸和pH值圖1 包包曲發(fā)酵過程中理化因子的變化規(guī)律Fig.1 Dynamics of physicochemical factors during Baobaoqu fermentation process

2.2 曲皮、曲心微生物群落測序深度評價和α多樣性分析

2.2.1 包包曲樣本微生物群落測序深度評價

Shannon指數(shù)稀釋曲線顯示在10 000條序列時趨于飽和(圖2)，表明所有樣本的測序深度均滿足分析要求。

a-細(xì)菌；b-真菌圖2 包包曲樣品稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves of Baobaoqu samples

2.2.2 包包曲發(fā)酵過程中曲皮、曲心微生物群落α多樣性分析

包包曲發(fā)酵過程中，曲皮、曲心細(xì)菌群落豐富度指數(shù)Chao1和群落多樣性指數(shù)Shannon具有先降低再增高趨勢(圖3-a、圖3-b)。曲皮細(xì)菌豐富度和多樣性與曲心沒有顯著差異(P>0.05)。曲皮真菌豐富度和多樣性在第1～9天持續(xù)下降；而曲心真菌豐富度和多樣性在發(fā)酵第1～3天迅速上升，在第3天達(dá)到最大值(165.56和5.90)；第7～29天，曲皮真菌豐富度和多樣性變化趨勢與曲心一致，且顯著高于曲心(P<0.05)(圖3-c、圖3-d)。

2.3 包包曲發(fā)酵過程中曲皮、曲心微生物群落演替規(guī)律

細(xì)菌16S rRNA和真菌ITS測序分別獲得了1 467 670 個和1 350 213個高質(zhì)量序列，按100%相似度聚類分別得到4 454個和504個ASV，覆蓋率均在99%以上。細(xì)菌、真菌ASV特征序列分別與Greengenes數(shù)據(jù)庫、UNITE數(shù)據(jù)庫比對進(jìn)行物種注釋，共檢測到475個細(xì)菌屬和69個真菌屬。

包包曲發(fā)酵過程中，曲皮、曲心的主要細(xì)菌目為Bacillales、Lactobacillales、假單胞菌目(Pseudomonadales)(平均相對豐度>10%)。如圖4-a和圖4-b所示，曲皮、曲心優(yōu)勢細(xì)菌屬(平均相對豐度>1%)在包包曲發(fā)酵過程中的變化趨勢較為相似，但豐度具有明顯差異，特別是在第13～29天。發(fā)酵第1～6天，Lactobacillales各屬和假單胞菌屬(Pseudomonas)在群落中占優(yōu)勢；隨著溫度升高，嗜熱菌芽孢桿菌屬(Bacillus)、熱放線菌屬(Thermoactinomyces)在第7～12天豐度最高，相對豐度占70%以上；第13天之后，曲皮群落優(yōu)勢微生物為Bacillus、Thermoactinomyces、Pseudomonas、魏斯氏菌屬(Weissella)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、未分類的根瘤菌屬(unclassifiedRhizobiaceae)等，而曲心中仍以Bacillus、Thermoactinomyces和Pseudomonas為主。并且，曲皮、曲心中的Bacillus分別在第3天和第8天達(dá)到優(yōu)勢豐度(相對豐度>1%)，這可能是由于曲心中高酸度、高水分的環(huán)境抑制了酸敏感的Bacillus[14]的生長繁殖。

包包曲發(fā)酵過程中，曲皮、曲心的主要真菌目為散囊菌目(Eurotiales)和毛霉目(Mucorales)。而優(yōu)勢真菌屬在曲皮、曲心中的分布具有明顯差異，如圖4-c 和圖4-d所示。嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)在曲心中更早出現(xiàn)優(yōu)勢，曲皮中根霉屬(Rhizopus)的豐度在第1～6天遠(yuǎn)大于曲心。發(fā)酵第13～29天，曲皮中優(yōu)勢微生物除Thermoascus外，還有Rhizopus、根毛霉屬(Rhizomucor)、曲霉屬(Aspergillus)、畢赤酵母屬(Pichia)、嗜熱真菌屬(Thermomyces)，而曲心中僅Thermoascus和Thermomyces在群落中占優(yōu)勢。

由圖4可知，出房時，曲皮、曲心微生物群落具有不同的結(jié)構(gòu)特點，曲皮微生物群落由多菌主導(dǎo)，而曲心微生物群落主要由Pseudomonas和嗜熱菌Thermoactinomyces、Thermoascus、Thermomyces主導(dǎo)。Bacillus、Rhizopus、Rhizomucor是大曲中主要糖化酶和淀粉酶產(chǎn)生菌[15]，其在曲皮中的優(yōu)勢可能導(dǎo)致了曲皮糖化力、液化力大于曲心。同時，這些優(yōu)勢微生物也是白酒釀造過程中的重要功能微生物。其中，Bacillus普遍具有良好的產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的功能，能夠代謝多種風(fēng)味物質(zhì)[16]。Thermoascus具有產(chǎn)熱穩(wěn)定性和高活力纖維素酶、蛋白酶的功能，具有產(chǎn)酒生香作用[11]。而Pseudomonas是大曲和糟醅的優(yōu)勢微生物[17]，可以產(chǎn)生嗜熱脂肪酶[18]并抑制谷物病原體[19]，也可能對發(fā)酵產(chǎn)生負(fù)面影響[20]，其在釀造系統(tǒng)中的功能及影響需要進(jìn)一步研究。曲皮、曲心中這些重要優(yōu)勢微生物的豐度差異，賦予了曲皮、曲心不同的微生物群落及代謝特點，也是曲皮、曲心理化因子存在較大差異的原因之一。

a，b-細(xì)菌多樣性指數(shù)；c，d-真菌多樣性指數(shù)圖3 包包曲發(fā)酵過程中曲皮、曲心微生物群落α多樣性指數(shù)Fig.3 Microbial communities αdiversity index during Baobaoqu fermentation

a-屬水平曲皮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；b-屬水平曲心細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；c-屬水平曲皮真菌群落結(jié)構(gòu)；d-屬水平曲心真菌群落結(jié)構(gòu)圖4 包包曲發(fā)酵過程中微生物群落演替規(guī)律Fig.4 Succession of microbial community during Baobaoqu fermentation

2.4 包包曲發(fā)酵過程中曲皮、曲心微生物群落的差異

2.4.1 包包曲發(fā)酵過程中曲皮、曲心樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)的差異性和相似性

ANOSIM分析表明曲皮、曲心細(xì)菌群落(R=0.161，P=0.004)和真菌群落(R=0.131，P=0.01)存在顯著差異?；赽ray-curtis距離對曲皮、曲心細(xì)菌和真菌微生物群落結(jié)構(gòu)的聚類分析，直觀展現(xiàn)了樣本間的差異性和相似性，如圖5-a和圖5-b所示。第1～6天和第7～29天包包曲細(xì)菌群落分別聚為2支(圖6-a)，表明第1～6天和第7～29天大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大；而第1～5天和第6～29天大曲真菌群落結(jié)構(gòu)差異也較大(圖6-b)。從包包曲不同部位來看，曲皮、曲心細(xì)菌群落在第1～4天較為相似；而第7～12天的曲皮微生物群落結(jié)構(gòu)和第8～29天曲心微生物群落結(jié)構(gòu)較為相似。而QX7、QP13、QP15、QP29的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和QP15真菌群落結(jié)構(gòu)與發(fā)酵前期樣品較為接近。曲皮、曲心微生物群落結(jié)構(gòu)聚類結(jié)果與理化因子變化具有相似的階段性，反映了理化因子與微生物群落間存在密切的相互影響關(guān)系，這種關(guān)系可能是包包曲微生物種群多樣性形成的重要原因。

2.4.2 包包曲發(fā)酵過程中曲皮、曲心微生物群落的差異微生物

利用LEfSe對包包曲發(fā)酵過程中曲皮、曲心間顯著差異微生物進(jìn)行分析(閾值為4)，結(jié)果如圖5-c和圖5-d所示。乳桿菌屬(Lactobacillus)、Weissella、Rhizopus、Rhizomucor、Pichia、Aspergillus的豐度在曲皮中更高，Thermoascus、Pseudomonadales、根瘤菌目(Rhizobiales)、酵母菌目(Saccharomycetales)、鎖擲酵母目(Sporidiobolales)的豐度在曲心中更高。曲心溫度更高可能導(dǎo)致了Thermoascus在曲心真菌群落中豐度更高、主導(dǎo)時間更長[21]。霉菌的好氧特性可能直接導(dǎo)致了其在曲皮中占優(yōu)勢。Lactobacillales的豐度變化趨勢與溫度一致，溫度可能是Lactobacillales在曲皮中豐度更高的重要原因。擲孢酵母屬(Sporobolomyces)的相對豐度極小，其相對豐度在曲皮中總是為0可能導(dǎo)致了Sporobolomyces在曲心中豐度顯著更大。而酵母菌易受環(huán)境因素影響，如低水分(<15%)和高溫(>50 ℃)[9]，這可能導(dǎo)致了Pichia在曲皮中更豐富。

a-細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的聚類分析；b-真菌群落結(jié)構(gòu)的聚類分析；c-細(xì)菌顯著差異物種LDA得分值分布柱狀圖；d-真菌顯著差異物種LDA得分值分布柱狀圖圖5 包包曲發(fā)酵過程中曲皮、曲心微生物群落的差異Fig.5 Differences in microbial communities between QP and QX during Baobaoqu fermentation注：LDA-linear discriminant analysis

此外，包包曲出房時，曲皮、曲心優(yōu)勢微生物的豐度也具有顯著差異(P<0.05)。來自于大曲的Bacillus、Saccharomycetales、Aspergillus和Thermoascus等，是白酒主發(fā)酵前期的優(yōu)勢微生物，對白酒發(fā)酵過程的乙醇或風(fēng)味代謝有重要貢獻(xiàn)[20]。大曲中的Lactobacillales可直接參與白酒發(fā)酵[22]，是白酒主發(fā)酵的主導(dǎo)菌群，還是酯類化合物積累的關(guān)鍵因素[23]。而大曲微生物代謝物質(zhì)也是白酒風(fēng)味的重要來源。因此，大曲微生物組成對白酒主發(fā)酵過程的微生物菌群結(jié)構(gòu)、豐度及微生物生長代謝都具有重要影響[24]，認(rèn)識和揭示包包曲多樣性及形成機(jī)制，對濃香型白酒主發(fā)酵過程具有重要意義。

2.5 包包曲發(fā)酵過程中曲皮、曲心微生物類群與理化因子的關(guān)系

利用RDA對包包曲發(fā)酵過程中曲皮、曲心細(xì)菌和真菌屬水平微生物群落與理化因子的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示。曲皮、曲心細(xì)菌和真菌群落在第1～4天與水分、總酸呈正相關(guān)，與溫度、pH值呈負(fù)相關(guān)；而在第7～12天與溫度、pH值呈正相關(guān)，與水分、總酸呈負(fù)相關(guān)。但第13～29天，曲心微生物群落主要受pH和溫度影響；而曲皮微生物群落在第15～20天仍主要受溫度和總酸含量的影響，在第23～29天主要受pH影響，曲皮、曲心樣本總是沿pH值的軸分布和聚集，表明pH值對曲皮、曲心微生物群落的影響較大。

a-曲皮細(xì)菌；b-曲皮真菌；c-曲心細(xì)菌；d-曲心真菌圖6 包包曲發(fā)酵過程中微生物群落與理化因子的冗余分析Fig.6 Redundancy analysis of microbial communities and physicochemical factors during Baobaoqu fermentation

mantel test分析進(jìn)一步表明，包包曲發(fā)酵過程中，pH值、總酸對曲皮、曲心的細(xì)菌和真菌組成具有顯著影響，溫度僅對真菌組成有顯著影響，而水分僅對曲皮微生物群落組成具有顯著影響(表1)。包包曲發(fā)酵過程中平均相對豐度前25的微生物屬與理化因子的Pearson相關(guān)性分析也表明pH值與優(yōu)勢微生物存在大量顯著正或負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖7)。且pH值是影響微生物生長代謝的重要因素。Bacillus在曲心中與總酸呈負(fù)相關(guān)，與2.3的結(jié)論一致，酸度可能是導(dǎo)致發(fā)酵前期Bacillus在曲皮中豐度更高的主要原因。曲皮、曲心的微環(huán)境差異是導(dǎo)致其微生物群落結(jié)構(gòu)差異的重要原因[4]，如曲心中更高的溫度可能導(dǎo)致了嗜熱菌相對豐度在曲心中更具優(yōu)勢、更穩(wěn)定[25]；而微生物群落代謝也會反過來影響環(huán)境因子，特別是酸度、溫度等理化特性[9]。pH值、總酸、溫度、水分是與曲皮、曲心微生物組成密切相關(guān)的重要影響因素。

a-曲皮；b-曲心圖7 優(yōu)勢微生物與理化因子的Pearson相關(guān)性分析Fig.7 Pearson correlation analysis of dominant microorganisms and physicochemical factors注：*表示顯著相關(guān)(P <0.05)；**表示極顯著相關(guān)(P<0.01)；Rhizobium ：Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium

表1 包包曲發(fā)酵過程中細(xì)菌和真菌群落與理化因子的mantel test分析Table 1 Mantel test analysis of bacteria and fungi communities and physicochemical factors during Baobaoqu fermentation

3 結(jié)論與討論

通過研究濃香型包包曲發(fā)酵過程中曲皮、曲心理化特性和微生物群落組成，討論理化因子對微生物群落的影響，得出以下結(jié)論：曲皮、曲心的理化特性從發(fā)酵第2天開始出現(xiàn)差異，并且曲皮pH值高于曲心，水分、溫度和總酸低于曲心；高通量測序結(jié)果表明曲皮、曲心優(yōu)勢微生物類群相似，為Lactobacillales、Pseudomonadales、腸桿菌目(Enterobacteriales)、Bacillales、Eurotiales、Mucorales、Saccharomycetales，但曲皮、曲心優(yōu)勢微生物在發(fā)酵過程中的分布和豐度具有明顯區(qū)別；ANOSIM分析表明曲皮、曲心微生物群落存在顯著差異；LEfSe分析得出Lactobacillus、Weissella、Rhizopus、Rhizomucor、Pichia、Aspergillus的豐度在曲皮中顯著更高，Thermoascus、Pseudomonadales、Rhizobiales、Saccharomycetales、Sporidiobolales的豐度在曲心中顯著更高；RDA、mantel test分析及Pearson相關(guān)性分析共同表明，pH值、總酸、溫度、水分是與曲皮、曲心微生物組成密切相關(guān)的重要影響因素。本研究揭示了包包曲發(fā)酵過程中曲皮、曲心微生物群落多樣性差異及與大曲理化因子的相關(guān)性，有助于解析包包曲微生物種群多樣性的形成機(jī)制。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)包包曲發(fā)酵過程中曲皮、曲心的理化性質(zhì)、微生物群落結(jié)構(gòu)、理化因子與微生物類群的關(guān)系間的差異都存在較明顯的階段性，這些階段間存在一定規(guī)律但尚不明晰。進(jìn)一步通過引入其他與大曲微生物類群生長相關(guān)的因素，如氧氣濃度或加大樣本量等方式，可能有助于包包曲發(fā)酵過程中微生物群落變化規(guī)律的探究。而各環(huán)境因子是協(xié)調(diào)影響微生物群落的，微生物群落代謝也會反過來影響環(huán)境因子，量化的復(fù)合因素對微生物群落的研究或許能夠進(jìn)一步解析包包曲微生物種群變化規(guī)律。