李解，翟秀明，唐敏，張維，袁林穎*，侯渝嘉*

1(重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，重慶，402160)2(重慶市茶葉工程技術(shù)研究中心，重慶，402160)3(重慶市永川區(qū)經(jīng)濟(jì)作物技術(shù)推廣站，重慶，402160)

茶(CamelliasinensisL.O.Ktze.)為山茶屬多年生常綠木本植物，茶葉內(nèi)富含多酚、咖啡堿、氨基酸、多糖和B族維生素等多種對(duì)人體有益的有效成分，具有降脂減肥[1]、抗氧化[2]、助消化和調(diào)理腸胃[3-5]等功效，是世界三大無酒精飲料之一[6]。隨著國(guó)民生活水平的逐步提升，飲食性肥胖成為公眾關(guān)注的重點(diǎn)健康問題。有研究表明，肥胖患者常伴有胰島素抵抗癥狀致使機(jī)體營(yíng)養(yǎng)代謝失調(diào)和脂肪積累，加劇高血脂、高血糖等并發(fā)疾病患病的風(fēng)險(xiǎn)，也是誘發(fā)非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)的重要原因之一[7]。

目前，關(guān)于改善胰島素抵抗的西藥包括：曲格列酮、口比格列酮、羅格列酮等二酮類化合物，在降低機(jī)體胰島素抵抗的同時(shí)，對(duì)機(jī)體和肝臟均具有一定程度的毒副作用。因此，尋找一種天然有效降低胰島素抵抗的食品或飲品具有重要意義。WU等[8]與PHUNG等[9]研究團(tuán)隊(duì)分別以流行病學(xué)分析和隨機(jī)對(duì)照干預(yù)試驗(yàn)2個(gè)方向證明，習(xí)慣性飲茶可減少身體脂肪積累和腰圍增加。CHEN等[10]研究者也提出，成人每日飲用10杯綠茶(約20 g)可有效預(yù)防肥胖，同時(shí)小鼠實(shí)驗(yàn)證明，飼料添加0.32%的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)能顯著降低小鼠體重增加，改善血漿總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)水平，減少脂肪吸收和積累。眾多研究表明，茶能控制體重和體脂含量，對(duì)于肥胖及并發(fā)癥具有顯著調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)以C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，每天高脂飲食喂養(yǎng)小鼠模擬非健康飲食狀態(tài)，通過補(bǔ)充1%茶葉水提物(tea water extract，TAE)，研究TAE對(duì)于小鼠血脂水平、肝臟脂肪累積、胰島素抵抗等功能指標(biāo)的影響，以期闡明TAE改善小鼠胰島素抵抗的作用機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)富含TEA的功能性食品和膳食補(bǔ)充劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 TAE的制備

TAE制備過程：綠茶茶樣500 g(茶葉原料品種：渝茶4號(hào))來自重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，經(jīng)過粉碎后過孔徑350 μm篩，然后按照茶水質(zhì)量比1∶20，用100 ℃沸蒸餾水浸提2次，第1次浸提20 min，第2次浸提10 min，合并濾液后過濾，于55 ℃下減壓濃縮，最后冷凍干燥成粉110 g，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 HPLC分析

將TAE粉末25 mg溶解于25 mL甲醇中，經(jīng)0.22 μm過濾器過濾后，采用安捷倫1200系列高效液相色譜儀進(jìn)行定量分析。使用安捷倫C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)在278 nm處分離成分，控制條件(柱溫30 ℃，劑量10 μL)，流動(dòng)相由甲醇(A)和水(B)組成，流速為0.8 mL/min，梯度洗脫方法：0～20 min，80%～50% A；20～25 min，50%～75% A。

1.3 動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

8周齡雄性C57BL/6小鼠，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(認(rèn)證號(hào)：SCXK 2018-0003)，將小鼠圈養(yǎng)在(25±1) ℃和濕度受控的室內(nèi)，其具有12 h光照/12 h黑暗循環(huán)。適應(yīng)期為1周后，將小鼠隨機(jī)分為4組(n=10)：正常飲食(normal control，NC)，高脂飲食(high fat diet，HF，脂肪40%卡路里)，NT-NC補(bǔ)充1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))TAE(NC+1%TAE)和HT-HF補(bǔ)充1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))TAE(HF+1%TAE)，持續(xù)13周。所有小鼠都可以自由飲水和飲食，每隔1 d記錄體重和食物攝入量。

1.4 生化分析

關(guān)于血糖和胰島素測(cè)量，在研究期的最后一天將小鼠禁食12 h后，使用羅氏血糖儀(Accu-Chek Active， Roche，Mannheim, Germany)從尾靜脈血測(cè)定小鼠血糖水平。基于酶聯(lián)免疫(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法通過胰島素試劑盒測(cè)量小鼠胰島素濃度。穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估(homeostasis model assessment，HOMA)是用于評(píng)估胰島素抗性的方法，獲得HOMA指數(shù)(HOMA-IR)，計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.5 血清指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，以20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氨基甲酸乙酯麻醉小鼠，心臟穿刺取小鼠血樣，經(jīng)3 000×g離心15 min，得到小鼠血清樣本，采用中國(guó)上海中貝特生物技術(shù)有限公司的商用ELISA試劑盒測(cè)定小鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、TC、TG、胰島素、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等指標(biāo)。

1.6 組織學(xué)分析

制作石蠟切片，將小鼠附睪白色脂肪組織(epididymal white adipose tissue，Epi-WAT)在4%多聚甲醛中4 ℃固定浸泡，石蠟包埋，在5～7 μm處進(jìn)行切片。蘇木精和伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行[11]，使用細(xì)胞輪廓儀軟件分析Epi-WAT脂肪細(xì)胞的大小。小鼠肝臟冷凍切片(8～10 μm)用油紅O(oil red O)染色，在正置顯微鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多區(qū)間檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TAE生化成分分析

實(shí)驗(yàn)采用茶葉國(guó)標(biāo)法和高效液相色譜法對(duì)TAE進(jìn)行理化成分分析及兒茶素、咖啡因含量分析。TAE的理化成分含量如圖1-A所示，茶多酚占比53.98%，氨基酸占比7.35%，咖啡堿占比7.03%，可溶性糖占比23.49%。TAE中兒茶素、咖啡因(caffeine, CAF)含量分析如圖1-B所示，其中EGCG含量達(dá)(126.82±5.22) mg/g、CAF含量達(dá)(50.01±1.17) mg/g。

A-茶葉水提物常規(guī)理化成分；B-茶葉水提物兒茶素、咖啡因含量圖1 TAE生化成分分析Fig.1 Biochemical analysis of TAE

2.2 TAE預(yù)防高脂誘導(dǎo)引起的肥胖

為研究TAE對(duì)于雄性C57BL/6小鼠體重的影響，8周齡雄性C57BL/6小鼠分別飼喂正常飲食NC、NC+1%TAE與高脂飲食HF、HF+1%TAE，共13周。如圖2-A所示，高脂誘導(dǎo)飲食顯著增加小鼠體重，是NC組的1.32倍，通過添加1%TAE可以顯著降低高脂誘導(dǎo)小鼠的體重。喂食期間，添加1%TAE不影響正常飲食或高脂飲食小鼠的攝食量(圖2-B)。

2.3 TAE改善高脂誘導(dǎo)引起的血脂異常和肝損傷

為了探索TAE抑制高脂血癥的能力，研究測(cè)量了小鼠的血脂濃度。如圖3-A，圖3-B所示，實(shí)驗(yàn)飲食13周后，TG和TC濃度顯著升高，補(bǔ)充1%TAE喂食可顯著降低小鼠TG、TC含量。此外，由于血清ALT和AST水平是2個(gè)關(guān)鍵的肝臟病理學(xué)預(yù)后指標(biāo)[12]，所以研究測(cè)定了小鼠血清AST和ALT水平。如圖3-C、圖3-D所示，高脂誘導(dǎo)喂食以后，HF小鼠血清AST和ALT水平顯著增高，表明小鼠肝臟受到損傷，而HT小鼠顯著較低的血清AST和ALT水平水平，表明TAE對(duì)高脂誘導(dǎo)的肝損傷具有保護(hù)作用。

A-體重；B-飲食量圖2 TAE預(yù)防高脂誘導(dǎo)引起的肥胖Fig.2 TAE prevents obesity induced by high-fat注：數(shù)據(jù)顯示為每組10只小鼠的平均值±SD；*表示與NC組相比差異顯著(P<0.05);#表示與HF組相比差異顯著(P<0.05)(下同)

A-TG；B-TC；C-ALT;D-AST圖3 TAE改善高脂誘導(dǎo)引起的血脂異常和肝損傷Fig.3 TAE improves dyslipidemia and liver damage induced by high-fat

2.4 TAE改善高脂誘導(dǎo)引起的胰島素抵抗

有研究表明，肥胖和胰島素抵抗密切相關(guān)。因此研究測(cè)定評(píng)估了小鼠空腹血糖、胰島素水平及相應(yīng)的HOMA-IR。如圖4-A～圖4-C所示，與NC組相比，HF高脂誘導(dǎo)了更高的空腹血糖和胰島素濃度，而TAE顯著逆轉(zhuǎn)了它們的含量，通過添加TAE，HT組小鼠相應(yīng)的HOMA-IR也顯著降低到接近正常水平。

2.5 TAE可降低高脂誘導(dǎo)引起的全身低度炎癥

通過研究TAE對(duì)小鼠血清內(nèi)毒素的影響[LPS和炎性細(xì)胞因子(TNF-α和IL-2)水平],發(fā)現(xiàn)TAE可以顯著降低高脂喂養(yǎng)肥胖小鼠血清的內(nèi)毒素LPS、TNF-α、IL-2水平(圖5)，表明TAE對(duì)小鼠的肝臟脂肪變性有很強(qiáng)的抑制作用，并能改善全身低度炎癥。

A-胰島素水平；B-空腹血糖水平；C-HOMA-IR圖4 TAE改善高脂誘導(dǎo)引起的胰島素抵抗Fig.4 TAE improves insulin resistance induced by high-fat

A-IL-2；B-LPS；C-TNF-a圖5 TAE可降低高脂誘導(dǎo)引起的全身低度炎癥Fig.5 TAE can reduce systemic low-grade inflammation induced by high-fat

2.6 TAE預(yù)防高脂誘導(dǎo)小鼠Epi-WAT肥大和肝臟脂肪變性

通過自動(dòng)圖像分析測(cè)量脂肪細(xì)胞大小，從小鼠Epi-WAT切片中獲得脂肪細(xì)胞的大小(圖6-A)。在400倍視野下，HF與NC相比，平均脂肪細(xì)胞大小較大，而HT組可以明顯地觀察到細(xì)胞數(shù)目比HF多，平均脂肪細(xì)胞大小接近于NC組的正常水平。肝臟油紅O染色結(jié)果顯示(圖6-B)，HF組小鼠肝臟脂肪著色明顯，可見大量的脂肪滴。HT與HF相比，切片內(nèi)著色脂肪顆粒明顯減少，分布稀疏，表明TAE能明顯抑制HF小鼠肥胖和肝臟脂質(zhì)積累，防止肝臟脂肪變性。

A-Epi-WAT、HE染色；B-油紅O染色圖6 TAE對(duì)高脂誘導(dǎo)小鼠Epi-WAT、肝臟病理變化HE染色和油紅O染色的影響Fig.6 Effect of TAE on Epi-WAT and liver pathological changes in mice induced by high-fat in HE staining and oil red O staining

3 討論

肥胖是目前備受全球關(guān)注的健康問題，主要表現(xiàn)為機(jī)體營(yíng)養(yǎng)代謝失調(diào)和脂肪積累，現(xiàn)已成為影響人類健康生活的重要因素，其根本原因在于能量攝入超過了能量消耗。有研究表明，綠茶可以增強(qiáng)脂肪分解和能量消耗，以防止肥胖[13-14]，HAMDAOUI等[15]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，通過對(duì)Wistar大鼠灌胃5%的綠茶和紅茶煎煮茶湯，能有效減少大鼠脂肪攝入，降低肝臟和血漿TG含量，減少脂肪累積，減輕體重；LEE等[16]研究普洱茶降脂減肥實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，普洱茶可顯著降低高脂飲食大鼠體重和脂肪系數(shù)。本研究對(duì)高脂誘導(dǎo)飲食C57BL/6小鼠喂養(yǎng)13周TAE，觀察TAE對(duì)于小鼠肥胖和胰島素抵抗的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在高脂誘導(dǎo)飲食小鼠模型中，TAE喂養(yǎng)可顯著降低小鼠體重增加和Epi-WAT平均脂肪細(xì)胞大小，使其接近對(duì)照水平，與之前研究結(jié)果保持一致，研究認(rèn)為TAE具有顯著的治療飲食性肥胖的作用。

胰島素抵抗與肥胖、非酒精性脂肪肝病、高胰島素血癥和血脂異常等嚴(yán)重代謝障礙密切相關(guān)[17]。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高脂誘導(dǎo)喂養(yǎng)HF小鼠血糖和胰島素水平顯著增高，而TAE的補(bǔ)充使用產(chǎn)生了保護(hù)作用，抵消了肥胖小鼠胰島素抵抗的增加。非酒精性脂肪性肝病的主要特征是脂肪變性，是由于細(xì)胞質(zhì)脂質(zhì)在肝細(xì)胞內(nèi)過度積累而形成的，當(dāng)肝臟中脂肪酸的合成或?qū)胨俣瘸^出口或分解代謝速度時(shí)，肝臟脂肪變性容易發(fā)生[18]。本研究中，添加1%TAE喂養(yǎng)的HT組小鼠能顯著降低血清TG以及肝臟脂質(zhì)積累，有助于改善肝臟脂肪變性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充1%TAE喂養(yǎng)可顯著降低血清TC水平和ALT、AST濃度，這與CHEN等[19]在研究綠茶提取物幫助SD大鼠抵抗高能量飲食誘導(dǎo)的肥胖實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果保持一致，綠茶提取物可以增加大鼠能量消耗，減少脂肪積累，降低血清TG、TC、游離脂肪酸、LDL、ALT、AST濃度。因此，推斷補(bǔ)充TAE可能是一種潛在的飲食補(bǔ)充，影響體內(nèi)膽固醇代謝，以防止高膽固醇血癥的發(fā)生，后續(xù)將對(duì)于膽固醇代謝相關(guān)基因檢測(cè)，解析TAE補(bǔ)充后TC降低的可能機(jī)制做進(jìn)一步探究。

高脂肪飲食會(huì)引起腸道菌群紊亂，導(dǎo)致代謝內(nèi)毒素血癥，異位脂肪沉積以及低水平的全身炎癥。有研究表明，綠茶提取物與麥芽低聚糖協(xié)同作用，可以幫助飲食性肥胖小鼠的腸道微生態(tài)恢復(fù)正常，同時(shí)二者協(xié)同可降低小鼠血漿LPS、炎性細(xì)胞因子Resistin、TNF-α、IL-1、脂聯(lián)素和IL-6的水平[20]。AXLING等[21]在研究綠茶粉與LactobacillusplantarumDSM15313(Lp)協(xié)同抑制腸道有害菌群，促進(jìn)有益菌群增殖的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，復(fù)配物可降低小鼠炎癥指標(biāo)PAI-1、IL-6、MCP-1、TNF-α及TLR4的水平，改善小鼠脂質(zhì)代謝。本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)TAE可以顯著降低高脂喂養(yǎng)肥胖小鼠血清的內(nèi)毒素LPS、TNF-α、IL-2水平，抑制肝臟脂肪變性，減輕了內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠NAFLD，改善腸道菌群微生物菌群及代謝。但目前缺乏基礎(chǔ)性的調(diào)節(jié)機(jī)制研究，證明TAE在調(diào)節(jié)胰島素抵抗過程中與腸道微生物相互作用的因果關(guān)系。因此，本研究后續(xù)將從微生物種類及相關(guān)代謝通路上分析，闡明具體的作用靶點(diǎn)和調(diào)節(jié)機(jī)制，更深層次挖掘調(diào)節(jié)機(jī)理。

本研究以高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6小鼠模型為研究對(duì)象，通過補(bǔ)充1%TAE 13周后發(fā)現(xiàn)，TAE可顯著降低高脂誘導(dǎo)小鼠體重增加和Epi-WAT平均脂肪細(xì)胞大小，減輕高脂誘導(dǎo)所致胰島素抵抗，改善糖穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝、肝氧化損傷等代謝參數(shù)。結(jié)果表明，TAE對(duì)高脂飲食引起的肥胖、胰島素抵抗、肝臟脂肪變性和低度炎癥具有保護(hù)作用，為改善飲食所致胰島素抵抗，降低Ⅱ型糖尿病的發(fā)生提供有效途徑，并為今后開發(fā)富含TAE的功能性食品和膳食補(bǔ)充劑提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論支持。