彭蕾，姜巖，夏如馨

（重慶工商大學(xué)廢油資源化技術(shù)與裝備教育部工程研究中心，重慶 400067）

引言

鉻由于其良好的耐腐蝕性和硬度，被廣泛應(yīng)用于染料生產(chǎn)、皮革鞣制、合金制造等現(xiàn)代工業(yè)，但處理技術(shù)的不完善以及其他人為因素等使得鉻以不同的形態(tài)和形式進(jìn)入到環(huán)境系統(tǒng)中，由于重金屬累積效應(yīng)，危害了生態(tài)環(huán)境[1]。鉻的毒性強烈依賴于氧化狀態(tài)，環(huán)境中鉻的氧化態(tài)包括Cr(Ⅱ～Ⅵ)，但主要以Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的形式穩(wěn)定存在[2]。Cr(Ⅵ)是一種毒性極高的物質(zhì)，有較好的流動性和溶解性，易于通過生物膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并在胞內(nèi)還原代謝過程中，導(dǎo)致一系列遺傳損傷，對人體和動物造成“三致”作用，也會影響植物對養(yǎng)分的吸收和光合作用[3]。Cr(Ⅲ)的毒性僅為Cr(Ⅵ)的1/100，相對難溶，不易被吸收，也不易生物積累，且是人體代謝所必需的微量元素[4]。目前，將Cr(Ⅵ)轉(zhuǎn)化為Cr(Ⅲ)是最為常見的鉻污染處理方式。

利用微生物還原Cr(Ⅵ)來修復(fù)鉻污染場地，具有經(jīng)濟、安全、環(huán)保、可持續(xù)且無殘留等優(yōu)勢，具有良好的應(yīng)用潛質(zhì)[5]。當(dāng)前的研究熱點追根溯源聚焦在各種生物應(yīng)激機制上。普遍認(rèn)為，生物解毒Cr(Ⅵ)的機制主要體現(xiàn)在兩個方面：其一，生物吸附和轉(zhuǎn)化等去除機制；其二，鉻離子的吸收、外排和抗氧化應(yīng)激反應(yīng)等的抗性機制。其中，生物吸附技術(shù)已在含鉻工業(yè)廢水處置中得以應(yīng)用；而轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展也為生物修復(fù)鉻污染提供了可能的解決方案。通過探索微生物去除Cr(Ⅵ)的作用機制可以為開發(fā)鉻污染治理新技術(shù)提供理論指導(dǎo)。本文針對鉻污染的微生物治理技術(shù)，論述了細(xì)胞在鉻污染環(huán)境下的各種解毒和轉(zhuǎn)化機制，以及共存離子脅迫對微生物去除Cr(Ⅵ)的影響，展望了含鉻復(fù)合污染場地治理技術(shù)的發(fā)展前景。

1 微生物去除Cr（Ⅵ）的作用機制

1.1 細(xì)胞膜吸附及轉(zhuǎn)化

1.1.1 細(xì)胞膜吸附機制 細(xì)菌和真菌等與Cr(Ⅵ)接觸于細(xì)胞表面時，利用其表面多糖、脂類及蛋白質(zhì)等提供結(jié)合位點，通過羥基、羧基等官能團依靠理化作用將Cr(Ⅵ)吸附于細(xì)胞表面，部分被吸附的Cr(Ⅵ)還將進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化為Cr(Ⅲ)，從而減少環(huán)境中的鉻污染和降低鉻毒性(圖1)[6]。吸附作用較為單一，但不同的研究體系所呈現(xiàn)出的作用機制有所差別，主要包括細(xì)胞膜表面官能團的化學(xué)結(jié)合力、靜電吸引力，以及細(xì)胞表面陽離子引起的靜電吸引效應(yīng)。在Sphingopyxis macrogoltabida中，羥基、酰胺Ⅰ帶、羧基、磷酸基等官能團都發(fā)生了波數(shù)的變化，推測參與了Cr(Ⅵ)的生物吸附過程，而且，Zeta 電位分析發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞等電點的移動，佐證了化學(xué)結(jié)合力參與了細(xì)胞表面吸附[7]；利用傅里葉變換紅外吸收光譜圖(FTIR)還發(fā)現(xiàn)了官能團的靜電吸引作用，在常見真菌Aspergillus flavus的細(xì)胞膜表面官能團存在三種可能吸附途徑：C≡C 中π 鍵與Cr(Ⅵ)相互作用形成Cr(Ⅵ)-π 配合物；蛋白的—NH2、—OH 提供孤電子與Cr(Ⅵ)結(jié)合形成配合物；酰胺Ⅲ帶的COO-通過靜電引力與Cr(Ⅵ)結(jié)合[8]。這兩個代表性研究均采用FTIR 法證實了細(xì)胞膜上的官能團對于Cr(Ⅵ)吸附的重要作用。此外，由于Cr(Ⅵ)在環(huán)境中多以等鉻酸根形態(tài)存在，因此細(xì)胞表面陽離子的特性也不容忽視。在酸性環(huán)境中，Penicillium griseofulvum細(xì)胞內(nèi)的氨基發(fā)生解離，繼而誘導(dǎo)正電荷聚集于細(xì)胞表面形成了帶正電荷的細(xì)胞壁，通過靜電作用直接將帶負(fù)電荷的鉻酸根離子吸附于細(xì)胞表面[9]。這個作用的關(guān)鍵控制就在于利用特定的細(xì)胞生存環(huán)境來誘導(dǎo)細(xì)胞生理特性的應(yīng)激變化，事實上，在利用生物法修復(fù)各類污染場地技術(shù)中，核心問題就是如何調(diào)控細(xì)胞產(chǎn)生特有的作用機制，發(fā)揮預(yù)期的功效以去除污染物。生物處理技術(shù)總體來講作用條件溫和，功能多樣化，多數(shù)情況下也具備一定的抗環(huán)境因子波動能力，因此具有良好的應(yīng)用潛力。

圖1 細(xì)胞表面Cr(Ⅵ)吸附Fig.1 Cr(Ⅵ)adsorption on cell surface

在各種Cr(Ⅵ)的去除機制中，國內(nèi)外對于生物吸附作用的理論和技術(shù)研究得最多，距離形成穩(wěn)定的應(yīng)用也最近。表1總結(jié)了以真菌、細(xì)菌、微藻等作為生物吸附劑去除Cr(Ⅵ)的代表性研究。因微生物種類不同、處理條件不同，吸附特性存在較大差別。微藻類一如既往地表現(xiàn)出對重金屬吸附的高活力，Cr(Ⅵ)的吸附量達(dá)到了90 mg/g 以上。并且，從傳統(tǒng)觀點來看，死藻類仍具備很強的吸附特性，賦予了該技術(shù)發(fā)展?jié)摿Γ坏孱愲m然吸附容量大，卻也存在吸附后的處理問題，而且藻類的過渡繁殖也會給水體帶來消極影響。因此，藻類吸附重金屬技術(shù)發(fā)展至今難于規(guī)?；瘧?yīng)用。相比之下，真菌和細(xì)菌可以實現(xiàn)包括胞內(nèi)、外，以及細(xì)胞膜上等的一系列轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生二次污染的風(fēng)險小，若能解決對多因子復(fù)雜污染環(huán)境的適應(yīng)性問題，將展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

表1 用于Cr（Ⅵ）吸附的生物吸附劑Table 1 Biological absorbent for Cr（Ⅵ）adsorption

1.1.2 細(xì)胞膜Cr（Ⅵ）轉(zhuǎn)化機制 細(xì)胞表面Cr(Ⅵ)轉(zhuǎn)化存在于部分微生物中，如圖1所示，前述微生物在吸附Cr(Ⅵ)的同時可能還伴隨著生物轉(zhuǎn)化作用發(fā)生，吸附Cr(Ⅵ)的同時直接起到解毒作用。Banerjee等[16]細(xì)化研究了Bacillussp.TCL 的不同部位還原Cr(Ⅵ)的情況，發(fā)現(xiàn)其最大還原活性來源于膜結(jié)合蛋白的介導(dǎo)和胞外多糖的絡(luò)合作用。這一研究結(jié)果并不多見，一般細(xì)胞轉(zhuǎn)化Cr(Ⅵ)的活動主要發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)，而本研究則發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化作用較微弱。當(dāng)前，對于結(jié)合蛋白的深入研究罕見報道，普遍的處理方式是將這種蛋白統(tǒng)稱為膜結(jié)合還原酶，具體的酶系及轉(zhuǎn)化機制尚有待研究。鉻的細(xì)胞表面吸附-還原作用還可以在官能團的介導(dǎo)下完成。最近，在Tan 等[17]對另一株Bacillussp.CRB-B1 的研究中證實，Cr(Ⅵ)的膜轉(zhuǎn)化行為既有膜結(jié)合還原酶介導(dǎo)的作用，也有—NH2、—COO、—OH 等膜表面官能團的參與，不過具體的還原機制未做報道。這是迄今為止發(fā)現(xiàn)的兩種膜轉(zhuǎn)化Cr(Ⅵ)機制，鑒于這些官能團均存在于基礎(chǔ)的膜結(jié)構(gòu)中，由此推斷，細(xì)胞膜的吸附與轉(zhuǎn)化作用很可能并行存在，只是礙于認(rèn)知水平的限制尚未達(dá)成普遍共識。不過，對于細(xì)胞膜吸附、轉(zhuǎn)化重金屬作用普遍推測存在著絡(luò)合、靜電吸附、電子轉(zhuǎn)移等作用。

此外，Cr(Ⅵ)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物及去向問題因?qū)ι锶コ鼵r(Ⅵ)技術(shù)的可行性和安全性至關(guān)重要，因而成為近期的研究重點。Zeng等[18]利用掃描電鏡(SEM)、透射電鏡(TEM) 和能譜儀(EDS) 等證實了O.oncorhynchiW4 轉(zhuǎn)化Cr(Ⅵ)的主要部位也在細(xì)胞膜上，占到了總?cè)コ实?2.9%，而這部分Cr(Ⅵ)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物則以Cr(OH)3和Cr(Ⅲ)-有機物復(fù)合物的形式黏附于細(xì)胞表面和釋放到環(huán)境中?？梢?，生物轉(zhuǎn)化Cr(Ⅵ)可以有效削弱鉻酸鹽污染物的環(huán)境毒性，有力支撐了生物法去除Cr(Ⅵ)的可行性。

1.2 細(xì)胞吸收、轉(zhuǎn)化及抗性機制

1.2.1 細(xì)胞吸收機制 Cr(Ⅵ)不僅可以被吸附于細(xì)胞表面，也可以通過特有機制穿過細(xì)胞膜，進(jìn)一步被細(xì)胞內(nèi)的還原物質(zhì)轉(zhuǎn)化為Cr(Ⅲ)，從而降低毒性。這種特有機制的產(chǎn)生主要是因為Cr(Ⅵ)多以形態(tài)存在，空間構(gòu)象近似于的正四面體結(jié)構(gòu)，可通過的跨膜轉(zhuǎn)運途徑進(jìn)入胞內(nèi)[19]。當(dāng)前的研究認(rèn)為，硫酸鹽轉(zhuǎn)運機制可能與編碼硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白和參與硫代謝的相關(guān)酶基因有關(guān)，Cr(Ⅵ)的脅迫下強烈誘導(dǎo)了相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白的顯著表達(dá)。其中，報道較多的鉻酸鹽轉(zhuǎn)運機制是通過硫酸ABC 轉(zhuǎn)運體進(jìn)入胞內(nèi)，該轉(zhuǎn)運體的蛋白組成包括Sbp(周質(zhì)硫酸鹽結(jié)合蛋白)和CysP(硫代硫酸鹽結(jié)合蛋白)、CysT 和CysW(兩種膜內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白)、CysA(膜相關(guān)ATP 結(jié)合蛋白)[5,20-21]。此外，硫酸鹽轉(zhuǎn)運體的表達(dá)通常受到相關(guān)硫代謝基因的調(diào)控，這種基因調(diào)控手段往往存在著雙向作用。在Pseudomonas putidaF1、Cupriavidus metalliduransCH34 和Arthrobactersp.FB24 等細(xì)菌中就發(fā)現(xiàn)了在Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)下相關(guān)硫代謝基因的顯著上調(diào)，使鉻酸鹽通過硫酸ABC 轉(zhuǎn)運體進(jìn)入胞內(nèi)[22-24]。然而，由于Cr(Ⅵ)的轉(zhuǎn)運占用了硫酸鹽通道，會影響硫酸鹽的吸收，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)硫元素降低，造成硫酸鹽和鉻酸鹽之間形成的底物競爭關(guān)系強烈而復(fù)雜，使得硫酸鹽轉(zhuǎn)運機制在運行時也會給細(xì)胞代謝帶來問題。近期發(fā)現(xiàn)，在Shewanella oneidensis的細(xì)胞中與硫酸同化和硫代謝過程相關(guān)的下調(diào)蛋白在長期的鉻脅迫下顯著富集，這種應(yīng)激機制被視作為保護細(xì)胞免受鉻酸鹽損傷的抵制策略[25]。因此，細(xì)胞吸收Cr(Ⅵ)可以減小環(huán)境毒害，但這種作用是一種主動規(guī)避行為還是被動誘導(dǎo)行為難以評估。由此可見，微生物不僅可以通過細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運體吸收鉻酸鹽，還可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)運基因的表達(dá)來減少對Cr(Ⅵ)的吸收。這一雙向機制指出利用生物技術(shù)消除Cr(Ⅵ)環(huán)境污染的關(guān)鍵控制在于使細(xì)胞具備持續(xù)而穩(wěn)定的吸附和吸收等固定作用，或是胞內(nèi)、胞外等轉(zhuǎn)化作用，這將賦予該技術(shù)實際應(yīng)用潛質(zhì)。對此，生物技術(shù)的優(yōu)勢顯現(xiàn)出來，功能型菌種在特定環(huán)境中可以實現(xiàn)穩(wěn)定代謝，持續(xù)地保障其種群的數(shù)量和功能優(yōu)勢。

當(dāng)前，硫酸鹽通道跨膜轉(zhuǎn)運Cr(Ⅵ)的吸收機制已得到廣泛認(rèn)可。不過，在Escherichia coli細(xì)胞內(nèi)也曾發(fā)現(xiàn)了鉬酸鹽結(jié)合蛋白ModA，可作為遺傳編碼的工具緊密結(jié)合鉻酸鹽去除Cr(Ⅵ)[26]。此外，一種發(fā)生在酵母細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運機制也值得關(guān)注。Saccharomyces cerevisiae細(xì)胞在肌動蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用下吸收Cr(Ⅵ)，但該過程可能伴隨著質(zhì)膜鉻轉(zhuǎn)運體的泛素依賴性內(nèi)吞失活，從而限制Cr的積累和毒性[27]。這同樣也是一種雙向機制，與常見的硫酸鹽轉(zhuǎn)運體的鉻酸鹽轉(zhuǎn)運途徑不同，只是這種吸收與抗性機制在后續(xù)研究中鮮有報道。

1.2.2 細(xì)胞內(nèi)Cr（Ⅵ）轉(zhuǎn)化及抗性機制 將Cr(Ⅵ)轉(zhuǎn)化為Cr(Ⅲ)是微生物修復(fù)鉻污染環(huán)境最為重要的去除機制。Cr(Ⅵ)經(jīng)還原后通常形成Cr(Ⅲ)析出物，如Cr2O3、Cr(OH)3等，但也有形成可溶性終產(chǎn)物的報道，包括Cr(Ⅲ)-EPS、Cr(III)-NAD+、Cr(Ⅲ)-有機物等復(fù)合物[28-29]。表2 總結(jié)了具有Cr(Ⅵ)還原能力的菌株，其中，芽孢桿菌等細(xì)菌因形成芽孢，抵抗外界不良環(huán)境的能力強，在轉(zhuǎn)化機制研究中被較多發(fā)現(xiàn)。當(dāng)前，六價鉻的轉(zhuǎn)化研究多以中溫好氧微生物為主，且在近中性環(huán)境中菌株生長代謝及對Cr(Ⅵ)的轉(zhuǎn)化作用較為適宜，但菌株耐受及還原六價鉻濃度的能力范圍差異較大，多集中在200 mg/L范圍內(nèi)。當(dāng)然，個別研究成果有利用嗜熱菌成功實現(xiàn)了對Cr(Ⅵ)的轉(zhuǎn)化。此外，無論細(xì)菌還是真菌普遍具有較高的Cr(Ⅵ)轉(zhuǎn)化能力，并且轉(zhuǎn)化作用可以發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)外，但生物轉(zhuǎn)化Cr(Ⅵ)最主要的途徑還是在細(xì)胞內(nèi)。

表2 具有Cr（Ⅵ）轉(zhuǎn)化能力的微生物Table 2 Microorganisms with Cr（Ⅵ）transformation ability

細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)豐富，依靠細(xì)胞質(zhì)中的YieF、NemA、依賴NAD(P)H 酶等可溶性還原酶，以及抗壞血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽等鉻酸還原劑將Cr(Ⅵ)轉(zhuǎn)化為Cr(Ⅲ)(圖2)[36]。Cr(Ⅵ)在胞內(nèi)依靠這些復(fù)雜的途徑轉(zhuǎn)化過程中，通常會伴隨著活性氧(ROS)的生成，而ROS 會對細(xì)胞DNA 造成堿基修飾、單/雙鏈斷裂等一系列損傷[21]。例如，E.coli胞內(nèi)的ChrR、NemA、YieF 等蛋白在還原Cr(Ⅵ)時，會產(chǎn)生一種壽命短、反應(yīng)性高，具有毒性的中間體Cr(Ⅴ)，雖然胞內(nèi)鉻酸鹽還原酶可將其進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為Cr(Ⅲ)，但Cr(Ⅴ)有時仍會短暫積累，導(dǎo)致重新氧化為Cr(Ⅵ)[38-40]。這一過程不是單純地影響Cr(Ⅵ)轉(zhuǎn)化效率的問題，重要的在于它可以通過類似于Fenton 反應(yīng)的形式產(chǎn)生ROS 而損傷細(xì)胞。當(dāng)然，并非所有胞內(nèi)還原酶的作用都會產(chǎn)生Cr(Ⅴ)的中間體，E.coli胞內(nèi)的NfsA蛋白和Bacillus subtilis胞內(nèi)的ChfN蛋白則是利用連續(xù)兩次電子還原過程直接形成Cr(Ⅲ)，避免了Cr(Ⅴ)的反應(yīng)歷程，極大減小了ROS 的產(chǎn)生[41]。無論怎樣，不必過度擔(dān)憂ROS 對生物去除Cr(Ⅵ)技術(shù)的開發(fā)。這是因為部分微生物可利用特殊的DNA 修復(fù)機制如SOS 修復(fù)酶(RecA、RecG、RuvB)對這種損傷進(jìn)行即時修復(fù)，從而保證細(xì)胞維持其生理生化特性；此外，谷胱甘肽酶(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)等誘導(dǎo)性酶促抗氧化劑也會在減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)而抵抗鉻鹽毒性方面發(fā)揮積極作用[42-43]。這些作用協(xié)同高毒性鉻鹽的轉(zhuǎn)化作用形成了微生物在鉻鹽脅迫環(huán)境下的胞內(nèi)抗性機制，生物轉(zhuǎn)化與抗性機制密不可分，成為生物去除Cr(Ⅵ)作用的根本保障。

圖2 Cr(Ⅵ)轉(zhuǎn)化協(xié)同抗性機制[36]Fig.2 Cr(Ⅵ)transformation synergistic resistance mechanism[36]

細(xì)胞吸收Cr(Ⅵ)的同時，也存在著未經(jīng)轉(zhuǎn)化的直接外排機制，成為細(xì)胞自身調(diào)節(jié)和平衡鉻酸鹽毒性的最直接的抗性機制。細(xì)胞內(nèi)累積的Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)Chr 操縱子并激活由ChrA 編碼的鉻酸鹽外排泵，利用質(zhì)子動力將鉻酸鹽從細(xì)胞質(zhì)中排出，從而削弱Cr(Ⅵ)毒性的積累[5,19]。這種ChrA 蛋白的外排抗性系統(tǒng)在Arthrobactersp.、Bacillussp.、Lysinibacillus sphaericus等細(xì)胞中均有發(fā)現(xiàn)[31,44-45]，并 且，ChrB、ChrC、ChrF 等同源物也被發(fā)現(xiàn)具有外排Cr(Ⅵ)的能力[46-48]。不過，也存在特殊情況，在絲狀真菌Neurospora crassa中，CHR-1蛋白起到了鉻酸鹽轉(zhuǎn)運體的作用，使細(xì)胞更傾向于積累Cr(Ⅵ)[49]。至于這種作用究竟是真菌細(xì)胞所特有還是CHR-1 蛋白的特性，亦或只是一個特例，尚有待研究。此外，胞內(nèi)形成的Cr(Ⅲ)產(chǎn)物很可能也存在外排作用，但相關(guān)研究極少。Onta?on 等[31]發(fā)現(xiàn)經(jīng)鉻酸鹽還原酶作用形成的Cr(Ⅲ)產(chǎn)物有32%存在于細(xì)胞外環(huán)境中，證實了Bacillussp.SFC 500-1E 的細(xì)胞內(nèi)存在Cr(Ⅲ)的外排通道，但這部分Cr(Ⅲ)是否也存在著部分細(xì)胞裂解釋放的可能性也值得思考。

1.3 細(xì)胞分泌酶及產(chǎn)物對Cr（Ⅵ）的轉(zhuǎn)化效應(yīng)

細(xì)胞外Cr(Ⅵ)的轉(zhuǎn)化明顯不同于前述的兩大類轉(zhuǎn)化機制，主要依靠在特定培養(yǎng)條件下細(xì)胞分泌并外排的還原酶和代謝產(chǎn)物進(jìn)行還原(圖3)?，F(xiàn)有報道中，細(xì)胞外還原酶包括黃素還原酶、硝酸還原酶、黃素蛋白和鐵蛋白還原酶，但對具體還原機制的認(rèn)知明顯不足。當(dāng)前，主要是通過檢測酶活力和Cr(Ⅵ)的濃度來評價胞外酶的轉(zhuǎn)化作用[33]。此外，胞外代謝產(chǎn)物的還原作用也是一種重要的Cr(Ⅵ)轉(zhuǎn)化途徑。這種轉(zhuǎn)化作用一般發(fā)生于存在鐵還原菌和硫酸鹽還原菌的環(huán)境中，它們通過厭氧代謝形成的Fe(Ⅱ)和H2S 等產(chǎn)物間接還原Cr(Ⅵ)[50]。不過，最近Long等[51]也發(fā)現(xiàn)，P.oxalicumSL2可利用其產(chǎn)生的草酸作為還原劑還原Cr(Ⅵ)并最終形成草酸鉻的配合物。酸性代謝產(chǎn)物的作用不僅體現(xiàn)在間接還原機制上，由于Cr(Ⅵ)的還原是環(huán)境pH 升高的質(zhì)子消耗過程，酸性產(chǎn)物的產(chǎn)生則會提供更多的質(zhì)子與細(xì)胞表面官能團發(fā)生配位作用，使其帶上較強的正電荷，從而加強對Cr(Ⅵ)的吸附作用。因此，酸性代謝產(chǎn)物可能伴隨著還原和吸附兩個作用的交織，以此去除Cr(Ⅵ)[52]。胞外Cr(Ⅵ)的轉(zhuǎn)化還具備一個特點，即不需要消耗能量，因而有利于反應(yīng)進(jìn)行。

圖3 細(xì)胞外Cr(Ⅵ)轉(zhuǎn)化Fig.3 Extracellular Cr(Ⅵ)transformation

2 共存離子脅迫對Cr（Ⅵ）去除的影響

鉻污染環(huán)境中往往存在其他金屬、無機鹽、石油類等污染物共存現(xiàn)象，對脅迫因子的研究存在明顯不足，主要的研究集中在金屬離子和氧陰離子脅迫兩個方面。表3 總結(jié)了當(dāng)前對離子脅迫下去除Cr(Ⅵ)的研究成果，可以看出離子脅迫作用很復(fù)雜，存在抑制和促進(jìn)等截然相反的影響。

2.1 金屬離子脅迫對Cr（Ⅵ）去除的影響

鉻污染水體和土壤中經(jīng)常存在Ni(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)等金屬離子，對于細(xì)胞代謝和Cr(Ⅵ)去除產(chǎn)生三種不同的影響(表3)。①抑制作用。P.brenneri在Fe(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)和Mg(Ⅱ)分別與Cr(Ⅵ)形成雙金屬脅迫下，細(xì)胞生長情況和Cr(Ⅵ)轉(zhuǎn)化效率都明顯受到抑制[34]；同樣，在Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)的存在下，C.daeguensis對Cr(Ⅵ)的去除率分別下降了3.57%、16.36%、31.48%[53]?？梢?，在不同金屬離子脅迫下，Cr(Ⅵ)的轉(zhuǎn)化特性將受到不同的抑制，而這種差別是由微生物對于特定金屬離子的耐受性和應(yīng)激性不同而導(dǎo)致的。②無明顯影響。在Banerjee 等[16]的研究中則發(fā)現(xiàn)，Cd(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)和Pb(Ⅱ)等分別與Cr(Ⅵ)共脅迫Bacillussp.TCL 時，細(xì)胞代謝未受到明顯影響，仍能在24 h 內(nèi)有效去除200 mg/L 的Cr(Ⅵ)。③促進(jìn)作用。當(dāng)前，對于生物吸附和轉(zhuǎn)化Cr(Ⅵ)的促進(jìn)作用已獲得一定的規(guī)律性認(rèn)知，即Cu(Ⅱ)存在時往往可以產(chǎn)生促進(jìn)作用。這方面的研究已經(jīng)得到多方的研究證實。Sarangi等[54]從污染土壤中分離出Bacillussp.、Leucobactersp.和Exiguobac terium三株菌，它們的鉻酸鹽還原酶活性均受到Hg(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)的抑制，但Cu(Ⅱ)卻可以提高酶活力，特別是對Leucobacter轉(zhuǎn)化Cr(Ⅵ)產(chǎn)生了顯著的促進(jìn)作用；在對Enterococcus gallinarum和Enterobactersp.兩株菌的研究中，也證實了Cu(Ⅱ)的這種促進(jìn)作用[55]。此外，Ca(Ⅱ)也被發(fā)現(xiàn)了一定的正面效應(yīng)。在Volland 等[56]的研究中發(fā)現(xiàn)，外源性Ca(Ⅱ)可以抑制Cd、Cr、Pb 等重金屬對細(xì)胞的毒性，繼而提高了細(xì)胞的耐受性。共存金屬離子對生物去除Cr(Ⅵ)的影響非常復(fù)雜，存在抑制與促進(jìn)等多方面作用。這種差異取決于金屬離子和菌株的類型，不同的金屬離子或者同一金屬對于不同菌株轉(zhuǎn)化Cr(Ⅵ)的影響不同。在多數(shù)情況下，金屬離子對鉻還原菌產(chǎn)生抑制作用；而促進(jìn)作用就當(dāng)前的研究現(xiàn)狀來看，主要體現(xiàn)在Cu(Ⅱ)上，這是因為Cu(Ⅱ)是過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等抗氧化酶的重要組成部分，也是細(xì)胞氧化呼吸系統(tǒng)中電子傳輸過程不可或缺的一部分，因此Cu(Ⅱ)的存在加強了細(xì)胞對Cr(Ⅵ)的耐受性和電子傳遞效率，從而提高了Cr(Ⅵ)的還原能力[57]。Cu(Ⅱ)乃至Ca(Ⅱ)的促進(jìn)作用對于生物修復(fù)Cr(Ⅵ)污染場地具有實際意義，有機會與營養(yǎng)助劑等工藝的實施統(tǒng)籌考慮，處理得體將不會產(chǎn)生額外的成本投入。

表3 其他污染因子的脅迫對細(xì)胞去除Cr（Ⅵ）的影響Table 3 Effects of removal of Cr（Ⅵ）by cells under other pollution factors stress

2.2 氧陰離子脅迫對Cr（Ⅵ）去除的影響

2.3 Cr（Ⅵ）與脅迫因子共去除研究現(xiàn)狀

共存離子脅迫研究尚處于探索階段，將Cr(Ⅵ)及其他共存污染因子一并作為目標(biāo)污染物進(jìn)行共去除是生物修復(fù)技術(shù)追求的最佳策略。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)能夠與Cr(Ⅵ)實現(xiàn)共去除的離子包括其他重金屬和硝酸根兩類。①與其他重金屬離子共去除。目前已發(fā)現(xiàn)部分菌株具有同時去除Cr(Ⅵ)及其他重金屬的能力。Wang 等[60]發(fā)現(xiàn)以檸檬酸鹽為助劑時，Shewanella loihicaPV-4 可在27 d 內(nèi)同時去除71.3%的V(Ⅴ)和91.2%的Cr(Ⅵ)(初始濃度分別為50.6 和52.2 mg/L)；在二者的競爭性抑制中，V(Ⅴ)的還原作用逐漸受到抑制，而Cr(Ⅵ)的底物競爭優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)，增強了生物轉(zhuǎn)化作用。更為直接的研究結(jié)果還在Stenotrophomonassp.、Achromobactersp.、Bacillus firmus以及Aspergillus lentulus等菌株中得以證實，這些菌株均可在去除Cr(Ⅵ)的同時分別吸附Zn(Ⅱ)[61]、還 原Mn(Ⅱ)[62]、氧 化As(Ⅲ)[63]，以及吸附Cu(Ⅱ)和Pb(Ⅱ)[64]。在這些重金屬與Cr(Ⅵ)形成的復(fù)合污染體系中，普遍由還原作用主導(dǎo)了Cr(Ⅵ)的去除。②與硝酸根離子共去除。發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象的幾個研究均集中在近幾年[58-59,65]。除上述在氧陰離子中的論述以外，An 等[66]的研究也頗具代表性，在Pseudomonas aeruginosa的細(xì)胞膜表面，氨基、酰胺、羥基和羧基等在還原10 mg/L 的Cr(Ⅵ)中起到重要作用，并且還伴隨著98% 的-N(初始濃度500 mg/L)的去除。無論如何，Cr(Ⅵ)與共存因子的共去除具有可行性，這對于生物修復(fù)污染場地技術(shù)的理論研究與應(yīng)用發(fā)展具有重要意義。

除了離子與Cr(Ⅵ)的共去除以外，有機物與Cr(Ⅵ)的共去除得到了更廣泛的關(guān)注。表4 中概況了部分代表性研究成果?？梢钥闯?，即便是難降解氯苯和氯酚類污染物的存在，依然可與Cr(Ⅵ)一起實現(xiàn)有效的共去除[68]。有機物與Cr(Ⅵ)的共去除機制在Huang 等[69]的研究中得到一定闡釋，是由萘降解形成的中間產(chǎn)物鄰苯二酚和鄰苯二甲酸促進(jìn)了Cr(Ⅵ)向Cr(Ⅲ)的還原。當(dāng)然，有機毒性對細(xì)胞的脅迫作用很可能抑制Cr(Ⅵ)的轉(zhuǎn)化，即便如此，只要細(xì)胞能夠利用有機物作為碳源實現(xiàn)自身代謝，同時又伴隨著Cr(Ⅵ)的生物吸附、吸收、轉(zhuǎn)化，將對生物修復(fù)污染場地技術(shù)的開發(fā)產(chǎn)生重要影響，因這種機制的存在適合于多種類型的實際污染場地情況。

表4 典型共去除含Cr（Ⅵ）復(fù)合有機污染物的微生物Table 4 Typical microorganisms of co-removal of Cr（Ⅵ）combined organic pollutants

在現(xiàn)階段，隨著我國整體工業(yè)布局的推進(jìn)，遺留的企業(yè)舊址中經(jīng)常伴隨著石油類污染物與Cr(Ⅵ)等重金屬的復(fù)合污染問題[72-73]。以往在面對油料等有機污染問題時，重金屬的影響很少受到關(guān)注。課題組就曾發(fā)現(xiàn)在某Cr(Ⅵ)污染土壤中含有數(shù)千mg/L的石油類污染物，并從中分離出一株Lysinibacillus fusiformis，初步研究發(fā)現(xiàn)，該菌株具備二者的共去除能力，尤其是在有機助劑促進(jìn)下，二者的去除效果顯著提升(圖4)。當(dāng)然，當(dāng)前所用助劑成本高，亟待探索高效、低成本助劑。

圖4 不同培養(yǎng)條件對Lysinibacillus fusiformis共去除的影響(MM無機鹽培養(yǎng)基、Cr(Ⅵ)50 mg/L、潤滑油500 mg/L、酵母浸粉0.5%、胰蛋白胨1%)Fig.4 Effects of different culture conditions on the co-removal of Lysinibacillus fusiformis

當(dāng)前的研究證實了共去除Cr(Ⅵ)與石油烴菌種的存在，且其消除Cr(Ⅵ)的特性與環(huán)境中可利用的底物密切相關(guān)。在實際Cr(Ⅵ)污染場地中，不僅存在著Cr(Ⅵ)與石油烴等的復(fù)合污染，也存在著有機質(zhì)含量少相對簡單的污染場地，因此，生物修復(fù)Cr(Ⅵ)污染場地技術(shù)的開發(fā)可能更加受到下游端的影響，即環(huán)境中必須含有足夠的滿足微生物代謝同時又能產(chǎn)生各種消除機制的底物。當(dāng)然，生物除油轉(zhuǎn)化Cr(Ⅵ)技術(shù)尚有很長的路要走，在承載該技術(shù)的手段、技術(shù)穩(wěn)定性、修復(fù)成本的控制等方面都成為關(guān)鍵問題。

3 結(jié)語

微生物解毒Cr(Ⅵ)的作用機制可以分為去除機制和抗性機制兩大類。去除機制主要基于轉(zhuǎn)化和吸附兩大理論體系，這兩種機制經(jīng)常交織在一起，存在于細(xì)胞內(nèi)、外，及細(xì)胞膜上，會因微生物不同而有差異，主要的轉(zhuǎn)化作用多發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)，是微生物最主要的Cr(Ⅵ)解毒機制，吸附作用則將環(huán)境中的Cr(Ⅵ)固定于細(xì)胞表面，部分Cr(Ⅵ)被官能團等作用轉(zhuǎn)化，從而降低其生物毒性；抗性機制主要體現(xiàn)在外排和抗氧化應(yīng)激反應(yīng)上，一般從酶學(xué)和基因表達(dá)等層面得以體現(xiàn)；細(xì)胞吸收作用既與生物去除Cr(Ⅵ)有關(guān)，也是一種生物抗性機制，主要起到胞內(nèi)轉(zhuǎn)化Cr(Ⅵ)的承接作用，從而直接降低鉻毒性，減小對人體和動、植物的危害。重金屬、有機污染物、石油類污染物等多因子脅迫下的Cr(Ⅵ)修復(fù)研究更貼近污染場地實際情況。當(dāng)前的研究主要聚焦在金屬離子和氧陰離子方面，金屬離子的脅迫作用更多地體現(xiàn)在有毒抑制上，但也存在Cu(Ⅱ)的促進(jìn)作用；而氧陰離子的脅迫作用則更為復(fù)雜，現(xiàn)有認(rèn)知不多，是否成為規(guī)律性的影響有待更多的探索?？傊?，復(fù)合污染生物修復(fù)研究尚處于起步階段，生物作用于Cr(Ⅵ)的解毒機制，以及調(diào)控石油烴代謝協(xié)同轉(zhuǎn)化Cr(Ⅵ)的細(xì)胞應(yīng)激機制等諸多問題尚有待揭示。未來研究重點一方面要堅持代謝調(diào)控等理論研究；另一方面應(yīng)落腳到與工程實踐相結(jié)合的工藝優(yōu)化與升級，解決環(huán)境因素等的技術(shù)瓶頸問題?，F(xiàn)有理論認(rèn)知可以證實生物法去除Cr(Ⅵ)的可行性，該技術(shù)應(yīng)用和推廣的難點不在于生物解毒的核心問題，而是在于生物修復(fù)污染場地技術(shù)本身的發(fā)展。多年來，生物修復(fù)技術(shù)始終處于研究眾多，但鮮有應(yīng)用的現(xiàn)狀。只有解決以成本控制為前提的承載核心技術(shù)的工藝問題，才能推動Cr(Ⅵ)污染修復(fù)乃至整個生物修復(fù)技術(shù)向工程應(yīng)用化的發(fā)展。因此，生物解毒機制等核心技術(shù)與修復(fù)工藝的并行發(fā)展才是生物修復(fù)污染場地技術(shù)的突破口。