于嘯洋，相思宇，金 鑫,2，李海峰，李文學(xué)，薛書江,2*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院；2.東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心:吉林 延吉 133002)

附紅細(xì)胞體病是由附紅細(xì)胞體引起的人和動(dòng)物的一種以貧血、黃疸、發(fā)熱等為主要特征的人畜共患病。附紅細(xì)胞體主要寄生于豬的紅細(xì)胞表面，其分泌的蛋白酶導(dǎo)致被寄生的紅細(xì)胞畸形、損傷[1-4]。豬附紅細(xì)胞體寄生改變了紅細(xì)胞膜的通透性，使紅細(xì)胞數(shù)目減少、攜氧能力降低，血紅蛋白濃度降低，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)貧血、黃疸、呼吸困難等癥狀。豬附紅細(xì)胞體病多呈隱性感染，當(dāng)豬因應(yīng)激因素導(dǎo)致抵抗力下降時(shí)則呈現(xiàn)急性經(jīng)過，繼發(fā)或并發(fā)其他傳染病時(shí)，可使病情加重，甚至在短期內(nèi)死亡[5-7]。由于缺乏成熟的豬附紅細(xì)胞體體外培養(yǎng)技術(shù)，建立成熟的豬附紅細(xì)胞體動(dòng)物模型用于該病的深入研究顯得尤為重要[8]。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者相繼成功建立了一些豬附紅細(xì)胞體感染動(dòng)物模型。Baljer等[9]利用切除脾臟的豬進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。Bugnowski等[10]利用SPF初生小豬成功復(fù)制了豬附紅細(xì)胞體動(dòng)物模型。尤麗娜等[11]建立豬附紅細(xì)胞體感染小鼠模型，利用常規(guī)病理學(xué)方法，進(jìn)行病理解剖學(xué)和病理組織學(xué)研究，以觀察感染后器官形態(tài)學(xué)變化。劉冰等[12]利用摘除脾臟或注射地塞米松的昆明小鼠，以腹腔注射的方式，成功構(gòu)建豬附紅細(xì)胞體感染模型。倪婷婷等[13]優(yōu)化了豬附紅細(xì)胞體小鼠感染模型建立的條件，通過對比，發(fā)現(xiàn)以豬陽性血液感染切除脾臟的昆明小鼠建立小鼠感染模型效果最優(yōu)。然而，上述研究對豬附紅細(xì)胞體感染模型的臨床癥狀和病理組織學(xué)變化缺少描述。該試驗(yàn)通過測定各實(shí)驗(yàn)組小鼠的體重、體溫、血常規(guī)、血液生化指標(biāo)、臟器指數(shù)以及病理組織學(xué)觀察，探討豬附紅細(xì)胞體對模型小鼠機(jī)體的影響，為后續(xù)相關(guān)發(fā)病機(jī)制的探索奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與病原

4周齡昆明小鼠45只，雌雄各半，購自延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；挑選臨床表現(xiàn)消瘦、貧血、黃疸，PCR檢測為豬附紅細(xì)胞體陽性的仔豬，仔豬由吉林省延邊朝鮮族自治州某豬場提供；無菌采集豬附紅細(xì)胞體陽性仔豬抗凝血，血漿4 ℃短期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要材料與試劑

血液基因組DNA提取試劑盒，購自O(shè)MEGA生物技術(shù)公司；豬外周血淋巴細(xì)胞分離試劑盒、紅細(xì)胞裂解液，購自索萊寶科技有限公司；DL2000 DNA Marker、pfu DNA聚合酶、枸櫞酸鈉、檸檬酸、葡萄糖等，均購自寶生物工程(大連)有限公司。其他常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)。

1.3 豬附紅細(xì)胞體PCR擴(kuò)增

按吳金桐[14]建立的豬附紅細(xì)胞體PCR診斷方法對豬血液樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。特異性引物P5：5′—AGGTAACCCAACCGTAGCAT—3′；P6：5′—TCTTAACTCCTTTTCCTCCAA—3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 豬附紅細(xì)胞體的純化

將經(jīng)PCR檢測豬附紅細(xì)胞體陽性和陰性抗凝血分別與等量淋巴細(xì)胞分離液混合；離心，棄上清和中間白細(xì)胞層，反復(fù)2次；收集紅細(xì)胞泥，洗滌3次；加入PBS，56 ℃水浴，取上清；1.2 μm濾膜過濾，將濾液12 000 r/min離心30 min，沉淀即為豬附紅細(xì)胞體，陰性血液分離物為對照；將分離的豬附紅細(xì)胞體進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，4 ℃短期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 豬附紅細(xì)胞體小鼠感染模型的建立

1.5.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

將45只昆明小鼠隨機(jī)平均分為3組，每組15只，A組為空白對照組，注射100 μL PBS；B組注射100 μL豬附紅細(xì)胞體陰性血液分離物為對照；C組注射100 μL濃度為1×107個(gè)/μL豬附紅細(xì)胞體；注射方式均采用腹腔注射。

1.5.2 一般指標(biāo)檢測

建模第1天開始，稱量整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)小鼠體重，并觀察整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)小鼠的精神狀態(tài)以及體溫變化情況。整個(gè)試驗(yàn)周期設(shè)為30 d。

1.5.3 豬附紅細(xì)胞體PCR檢測

按1.3所述檢測方法，感染后第1、3、5、7、14、21、28、30天尾尖采血，使用血液基因組DNA提取試劑盒提取血液基因組DNA,分別對每只小鼠進(jìn)行PCR檢測，確定豬附紅細(xì)胞體的首次感染時(shí)間以及帶菌時(shí)間。

1.5.4 血液學(xué)檢測

感染豬附紅細(xì)胞體后的第7天，每組隨機(jī)挑選3只小鼠，進(jìn)行眼球采血，使用普朗醫(yī)療的XFA6100A型血液細(xì)胞分析儀和斯馬特全自動(dòng)生化分析儀分別進(jìn)行血常規(guī)以及血液生化指標(biāo)檢測。

1.6 病理學(xué)與病理組織學(xué)觀察

在第30天試驗(yàn)周期結(jié)束時(shí)每組隨機(jī)選取3只進(jìn)行剖檢，觀察眼結(jié)膜和皮下是否有貧血、黃染現(xiàn)象，并測定臟器指數(shù)(包括心、肝、肺、腎、脾以及胸腺)。

將摘取的臟器置于福爾馬林溶液中備用，制作病理切片。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用SPSS statistics 17.0 和GraphPad Prism軟件進(jìn)行，P<0.05,表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般指標(biāo)檢測

以5 d為1個(gè)階段測定各組小鼠的平均日增重，結(jié)果顯示，在豬附紅細(xì)胞體感染后的5～10 d的平均日增重顯著低于其他組(表1)。每隔2 d測量各組小鼠體溫，結(jié)果顯示，在豬附紅細(xì)胞體感染后的第4天C組小鼠與空白對照組A組以及與陰性對照組B組相比，體溫較顯著降低(P<0.05)；與空白對照組A組相比,C組小鼠體溫在第7～19天整體上顯著升高；與陰性對照組B組相比,C組小鼠在第7～10天體溫較顯著升高(P<0.05)，在第16～19天，體溫顯著升高(P<0.01)(表2)。

表1 小鼠平均日增重測定結(jié)果

表2 小鼠體溫測定結(jié)果

2.2 豬附紅細(xì)胞體的PCR檢測

各組小鼠分別接種100 μL PBS、100 μL豬附紅細(xì)胞體陰性血液分離物、100 μL 1×107個(gè)/μL豬附紅細(xì)胞體后，以小鼠血液DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)置陽性對照。結(jié)果顯示，A組和B組小鼠并未檢測到特異性條帶，C組和陽性對照出現(xiàn)特異性條帶。結(jié)果顯示在170 bp左右存在目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。

各組小鼠接種24 h后，每隔48 h尾尖采血，進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果顯示,A組和B組小鼠始終未檢測到特異性條帶，C組小鼠接種后首次PCR檢測到豬附紅細(xì)胞體時(shí)間為24 h，感染后第7天條帶最亮，持續(xù)帶菌時(shí)間為28 d(圖1)，根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，檢測到第30天[13]。

2.3 血液學(xué)檢測

各組小鼠接種后第7天，每組選取3只眼球采血，進(jìn)行血液常規(guī)檢測。結(jié)果顯示，C組小鼠白細(xì)胞總數(shù)、粒細(xì)胞總數(shù)、血小板總數(shù)均減少，與A組和B組差異極顯著(P<0.01)；淋巴細(xì)胞總數(shù)減少、血紅蛋白濃度降低，與A組差異極顯著(P<0.01)，與B組差異顯著(P<0.05)；淋巴細(xì)胞百分比，粒細(xì)胞百分比，平均血紅蛋白含量，平均血紅蛋白濃度，紅細(xì)胞總數(shù)，平均紅細(xì)胞壓積，紅細(xì)胞壓積和紅細(xì)胞分布寬度變化不明顯(表3)。

表3 小鼠血常規(guī)檢測結(jié)果

各組小鼠接種后第7天眼球采血，進(jìn)行血液生化指標(biāo)檢測。結(jié)果顯示，C組小鼠白蛋白總數(shù)、總蛋白總數(shù)、球蛋白總數(shù)均增加，球蛋白總數(shù)與B組小鼠相比，差異顯著(P<0.05)；白球比降低，與B組差異極顯著(P<0.01)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶增加、堿性磷酸酶增加，與A、B組差異顯著(P<0.05)；血糖濃度下降；尿素指標(biāo)變化不明顯(表4)。

表4 小鼠血液生化指標(biāo)檢測結(jié)果

2.4 病理學(xué)與病理組織學(xué)觀察

試驗(yàn)周期結(jié)束后，每組隨機(jī)選取3只小鼠進(jìn)行剖檢，并制作病理切片進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。剖檢結(jié)果顯示，C組小鼠與對照組相比，皮下組織有輕微黃染現(xiàn)象。病理切片結(jié)果顯示，C組小鼠與對照組相比，心肌充血、局部有紅細(xì)胞；肝臟細(xì)胞腫脹、顆粒變性，肝竇變窄；腎臟充血，腎小球內(nèi)有紅細(xì)胞；脾臟內(nèi)見含鐵血黃素；肺臟出血、充血，肺泡腔內(nèi)有少量紅細(xì)胞(圖2)。

2.5 小鼠臟器指數(shù)

試驗(yàn)周期結(jié)束后，每組隨機(jī)選取3只小鼠進(jìn)行剖檢，摘取臟器，稱重并計(jì)算臟器指數(shù)。結(jié)果顯示，C組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與A、B組比較，差異顯著(P<0.05)。各組小鼠的心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、肺指數(shù)和腎臟指數(shù)差異不顯著(表5)。

表5 小鼠臟器指數(shù)

3 討論與結(jié)論

豬附紅細(xì)胞體病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，感染率較高，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的危害及安全隱患[15-16]。目前，采用鮮血壓片或瑞氏-姬姆薩染色的光鏡檢查是目前最簡便、最基本的方法。但是，此方法經(jīng)常出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。許多學(xué)者因其靈敏度、特異性較差對結(jié)果提出了質(zhì)疑。這種方法檢測出來的只能作為疑似病例，并不能確診[15-18]。因此，該試驗(yàn)采用臨床診斷結(jié)合PCR檢測來綜合判定豬附紅細(xì)胞體陽性血液作為試驗(yàn)材料，確保了進(jìn)一步試驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)可靠。

小白鼠是實(shí)驗(yàn)室中最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，飼養(yǎng)管理方便，易于控制。所以，該試驗(yàn)利用昆明小鼠，建立動(dòng)物感染模型。目前，大多數(shù)學(xué)者所建立的小鼠感染模型采用了摘除脾臟或者注射地塞米松破壞其免疫系統(tǒng)的方式。而該試驗(yàn)并沒有破壞小鼠的免疫系統(tǒng)，在自然狀態(tài)下觀察其的感染狀態(tài)和病理組織學(xué)變化，可以為不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡难芯刻峁└嗟哪Ｐ瓦x擇。

目前，附紅細(xì)胞體病的動(dòng)物模型構(gòu)建多采用全血作為感染源。如，劉冰等[12]、馮會(huì)權(quán)等[19]采用全血感染小鼠。該試驗(yàn)采用了分離純化后的附紅細(xì)胞體為感染源，可以保證其感染源的單一性，試驗(yàn)過程中全程無菌采血、提取附紅細(xì)胞體。飼養(yǎng)籠經(jīng)嚴(yán)格消毒處理，墊料、飲用水和顆粒飼料均用λ射線照射。同時(shí)，試驗(yàn)前對小鼠進(jìn)行附紅細(xì)胞體檢測，確保無附紅細(xì)胞體感染情況下進(jìn)行試驗(yàn)。從而控制試驗(yàn)過程中小鼠只感染了豬附紅細(xì)胞體，避免被其他病原體感染，使小鼠出現(xiàn)的臨床癥狀均由豬附紅細(xì)胞體引起。另外，可以使模型構(gòu)建更加標(biāo)準(zhǔn)，可重復(fù)性更好。

該試驗(yàn)中，模型組小鼠血紅蛋白濃度降低。分析原因，主要由于豬附紅細(xì)胞體感染機(jī)體后，與紅細(xì)胞相互作用，使紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞。血紅蛋白是紅細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸氧的特殊蛋白質(zhì)，當(dāng)紅細(xì)胞被破壞時(shí)，血紅蛋白濃度降低。從而導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)貧血、溶血癥狀[20]。血小板是血液中的重要組成成分之一，具有凝血功能，其數(shù)量減少，說明豬附紅細(xì)胞體導(dǎo)致機(jī)體凝血功能被破壞。模型組小鼠白球比降低，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶增加，堿性磷酸酶增加，以上變化說明豬附紅細(xì)胞體的侵入除引起機(jī)體貧血、皮下黃染外，還造成機(jī)體一定程度的肝功能損傷。模型小鼠組織表現(xiàn)變化如下：心肌充血，肝臟細(xì)胞腫脹、顆粒變性，肝竇變窄，這些變化與血液生化指標(biāo)變化相符合；腎臟充血，腎小球內(nèi)有紅細(xì)胞。脾臟內(nèi)見含鐵血黃素。脾臟內(nèi)出現(xiàn)含鐵血黃素進(jìn)一步說明小鼠紅細(xì)胞被破壞[21-24]，與尤立娜等[11]試驗(yàn)結(jié)果相符。各個(gè)器官充血、出血，表明豬附紅細(xì)胞體除使紅細(xì)胞損傷外，其代謝產(chǎn)物可能可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，使紅細(xì)胞外滲。上述諸多病理變化進(jìn)一步驗(yàn)證了該研究中小鼠模型的成功建立。