范明智，安曉麗，李學(xué)峰，吳曉晗，樸炫春

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

東革阿里(EurycomalongifoliaJack)，為苦木科東革阿里屬灌木植物，又名馬來西亞人參，生長于東南亞的熱帶雨林中，成熟期一般為5年以上。東革阿里全株均可入藥，具有壯陽、利尿等功效，還具有抗菌、抗癌等生物活性，在醫(yī)藥行業(yè)有廣泛的開發(fā)前景[1]。但隨著對野生東革阿里的無節(jié)制采挖，其野生資源已受到嚴(yán)重破壞。另外, 由于其對生長環(huán)境要求較為嚴(yán)苛，人工栽培和引種較為困難，且人工栽培的東革阿里質(zhì)量參差不齊，無法滿足市場的需求，使得東革阿里的深入研究受到了限制[2]。目前，有少數(shù)研究報(bào)道成功培育出東革阿里不定根，優(yōu)化其培養(yǎng)條件，并對其生物活性成分與市面銷售的東革阿里材料在生物活性成分等方面進(jìn)行了比較，證明了東革阿里不定根可以作為野生東革阿里的替代材料[3-5]。目前，東革阿里不定根培養(yǎng)雖已獲得成功，但是關(guān)于其生物活性的報(bào)道極少，為進(jìn)一步證明東革阿里不定根可替代野生東革阿里應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域，該試驗(yàn)對東革阿里不定根提取物的抑菌活性及機(jī)制進(jìn)行了研究。

病原菌的感染是引起機(jī)體疾病的重要因素之一，并且細(xì)菌繁殖快速，可在人和動(dòng)物間交叉?zhèn)鞑ィ瑖?yán)重威脅人類的健康[6]。由于抗生素類藥品的過度使用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性問題日益嚴(yán)重，成為全世界的醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)的共同難題[7-8]。因此，尋找具有抗菌活性的植物來源天然化合物對于新藥的研發(fā)有重要意義。細(xì)胞壁和細(xì)胞膜是細(xì)菌的關(guān)鍵組成部分，具有調(diào)節(jié)物質(zhì)進(jìn)出和信息傳遞的功能，當(dāng)細(xì)胞膜受到損傷時(shí)，胞內(nèi)的小分子物質(zhì)會(huì)首先泄露出來；當(dāng)細(xì)胞膜受到嚴(yán)重破壞時(shí)，胞內(nèi)的大分子物質(zhì)如DNA、RNA和蛋白質(zhì)等就會(huì)釋放到胞外，因此可以通過檢測胞外的電解質(zhì)含量、核酸水平、蛋白質(zhì)濃度來判斷細(xì)胞膜的通透性變化[9]。近年來有大量關(guān)于天然抑菌物質(zhì)通過改變細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性來發(fā)揮抑菌作用的報(bào)道，如銀杏種仁中的多糖、酚酸[10]、黃岑中的黃岑苷[11]等等。但目前，尚無關(guān)于東革阿里不定根抑菌的報(bào)道，因此，該研究對東革阿里不定根提取物抑菌活性與機(jī)理進(jìn)行了探究，為東革阿里不定根的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

參照Fan等[5]的方法培養(yǎng)東革阿里不定根。培養(yǎng)40 d后收獲不定根，將不定根清洗干凈后在45 ℃恒溫干燥箱中烘干48 h，獲得的不定根干品作為試驗(yàn)材料。

1.2 提取物制備

參考Fan等[5]的方法制備東革阿里不定根提取物，稱取5 g東革阿里不定根干品，加入70%的乙醇100 mL，60 ℃下超聲提取，并減壓濃縮，于45 ℃恒溫干燥箱中烘干至恒重，得東革阿里不定根提取物。

1.3 試驗(yàn)菌種

大腸桿菌(Escherichiacoli,CGMCC 1.3379)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,CGMCC 1.008 9)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,CGMCC 1.262 0)以及枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,CGMCC 1.335 8)4種菌種購自中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。在無菌的條件下，用接種環(huán)刮取4種菌種分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(牛肉膏3 g/L+蛋白胨10 g/L+氯化鈉5 g/L，pH值7.0)中，在37 ℃的菌培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)(100 r/min)。培養(yǎng)12 h后的菌懸液(107CFU/mL)用于抑菌試驗(yàn)。

1.4 方法

1.4.1 提取物抑菌活性的研究

參照王興娜等[12]應(yīng)用濾紙片擴(kuò)散法測定提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌以及枯草芽孢桿菌抑菌圈的大小，用菌培養(yǎng)液將提取物濃度調(diào)至128 mg/mL。取6 mm濾紙片，在提取物溶液浸泡2 h，菌培養(yǎng)液作為對照。培養(yǎng)皿中加入菌培養(yǎng)基，其上用0.3 mL 的菌懸浮液均勻涂布，之后放入浸泡提取物和菌培養(yǎng)液的濾紙片。培養(yǎng)皿在37 ℃下培養(yǎng)12 h后，測量濾紙片周圍無細(xì)菌生長的圓形圈的平均直徑，作為抑菌圈大小。每個(gè)處理進(jìn)行3次獨(dú)立試驗(yàn)作為重復(fù)。

1.4.2 最低抑菌濃度(MIC)的確定

利用2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定提取物的MIC。將100 μL枯草芽孢桿菌菌液加入96孔板中，再加入100 μL不同濃度(0.25、0.50、1、2、4、8、16、32、64 mg/mL)的提取物，以培養(yǎng)液作為對照，37 ℃培養(yǎng)24 h后加入20 μL 0.2% TTC溶液，避光反應(yīng)4 h后，根據(jù)反應(yīng)液顏色確定MIC，每個(gè)處理均設(shè)置3次重復(fù)。

1.4.3 提取物對菌生長變化的影響

參考朱紅霞等[13]的方法繪制菌生長曲線。在枯草芽孢桿菌菌液中加入提取物，使菌液中提取物濃度達(dá)到1 mg/mL。在37 ℃下振蕩培養(yǎng)，每隔30 min取1次菌懸液樣品，直至培養(yǎng)4 h。樣品在600 nm波長處測定其吸光度。

1.4.4 細(xì)菌形態(tài)觀察

參考李云祥等[14]的方法，應(yīng)用掃描電鏡對細(xì)菌形態(tài)進(jìn)行觀察。將提取物加入枯草芽孢桿菌菌液中，使菌液中提取物濃度達(dá)到1 mg/mL，同等體積的菌培養(yǎng)液作為對照組。于37 ℃下振蕩培養(yǎng)，4 h后于8 000 r/min下離心，去除上清，底部沉淀用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值5.8)沖洗2～3次，加入2.5%戊二醛溶液固定1 min，12 h后繼續(xù)離心得到沉淀，再次用PBS沖洗2～3次，依次加入50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液脫水后離心，留下沉淀于-80 ℃冷凍12 h后凍干。凍干粉噴金后在掃描電子顯微鏡(日立SU8010掃描電子顯微鏡，日本)下觀察。

1.4.5 提取物對菌細(xì)胞通透性的影響

1) 堿性磷酸酶(AKP)活性測定 使用AKP酶試劑盒(南京建成科技有限公司，中國)對AKP酶活性進(jìn)行測定，取枯草芽孢桿菌菌懸液于離心管中，加入提取物調(diào)節(jié)濃度至1 mg/mL，加等量的菌培養(yǎng)液作為對照。37 ℃下溫育4 h，5 000 r/min離心8 min后，吸取上清液按照AKP試劑盒說明操作，反應(yīng)10 min后，測定520 nm處的吸光度，并計(jì)算AKP酶活性。

2) 電導(dǎo)率(EC)測定 參照羅雯月[15]的方法測定EC。在離心管中加入枯草芽孢桿菌菌液，離心5 min后，去上清，加入的PBS沖洗后重懸于培養(yǎng)液中，加入提取物使離心管中的提取物濃度達(dá)到1 mg/mL，同等體積的菌培養(yǎng)液作為對照。裝有菌懸液的離心管在37 ℃下溫育，菌液中的EC值用電導(dǎo)率儀(DDSJ-308A，上海精密儀器有限公司，中國)每隔0.5 h測定1次。

3) 核酸水平測定 利用分光光度法對菌懸液中的核酸水平進(jìn)行測定。取枯草芽孢桿菌菌液5 mL，在5 000 r/min條件下離心5 min后去上清，加入的PBS沖洗后重懸于培養(yǎng)液中，再加入提取物調(diào)節(jié)濃度至1 mg/mL，同體積的培養(yǎng)液作為對照，在37 ℃溫育4 h，每0.5 h取樣，離心后，于260 nm處測定上清液的吸光度，確定核酸泄漏水平。

4) 蛋白質(zhì)含量測定 ①胞外蛋白：利用蛋白定量試劑盒(南京建成科技有限公司，中國)進(jìn)行測定，取107CFU/mL的枯草芽孢桿菌菌液5 mL離心去上清，加入PBS沖洗后重懸于培養(yǎng)液中，再加入提取物調(diào)節(jié)濃度至1 mg/mL，對照組加同等體積的菌培養(yǎng)液，37 ℃下溫育4 h，取樣離心，取上清并按照試劑盒說明操作。反應(yīng)10 min后于595 nm下測定吸光度，并參照試劑盒說明計(jì)算并分析蛋白質(zhì)泄露情況。②胞內(nèi)蛋白：參考Cui等[16]方法對菌胞內(nèi)蛋白進(jìn)行定性分析。將提取物加入到枯草芽孢桿菌懸液中，使提取物終濃度達(dá)到1 mg/mL，對照加入等體積的菌培養(yǎng)液。在37 ℃下溫育4 h，取20 mL樣品離心棄上清。沉淀用PBS(10 mM，pH值7.4)沖洗2～3次后，加入無菌水打散，加入到200 μL的無菌水中。冰浴下超聲8 min，離心取100 μL上清液與25 μL PBS充分混勻，沸水浴5 min，冷卻后上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳結(jié)束后取出凝膠用考馬斯亮藍(lán)(R250，南京建成生物工程研究所，中國)染色，脫色劑脫色后再用去離子水清洗。

胞內(nèi)蛋白濃度參照二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(北京賽默飛世爾科技有限公司，中國)說明書操作，在550 nm下測定OD值。

1.4.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.3.0(GraphPad Software,Inc.,SanDiego,CA)進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)，顯著性為P<0.05，所有試驗(yàn)均采用3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物的抑菌活性

由圖1和表1可知，提取物未對大腸桿菌生長增殖起到抑制作用，對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌抑菌圈直徑均為9.79 mm，其中對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為17.80 mm。表明提取物對枯草芽孢桿菌的抑制效果最強(qiáng)。因此，以枯草芽孢桿菌作為試驗(yàn)菌種用于后續(xù)抑菌機(jī)制研究。

表1 不定根提取物抑菌圈直徑 Table 1 Inhibition ring diameter of extract from adventitious roots

為確定提取物的最低抑菌濃度(MIC)，該試驗(yàn)利用TTC法對枯草芽孢桿菌的MIC進(jìn)行測定。TTC可與活菌反應(yīng)產(chǎn)生紅色沉淀，因此，可通過觀察菌液顏色變化判斷抑菌效果。由圖2可知，提取物為2 mg/mL及以上時(shí)，液體呈現(xiàn)澄清透明色，而低于此濃度，液體中出現(xiàn)紅色沉淀，且紅色隨濃度的降低逐漸加深，因此提取物對枯草芽孢桿菌的MIC為2 mg/mL。

2.2 提取物對菌生長變化的影響

可以通過細(xì)菌生長曲線來確定提取物對細(xì)菌生長的抑制作用隨時(shí)間變化的規(guī)律[17-18]。東革阿里不定根粗提物對枯草芽孢桿菌生長的影響見圖3。

由圖3可知，對照組的枯草芽孢桿菌在4 h培養(yǎng)期間，細(xì)菌的數(shù)量快速增長。與對照組相比，提取物組細(xì)菌在4 h的培養(yǎng)期間內(nèi)沒有明顯增長，其4 h后的OD600值明顯低于對照組。結(jié)果表明，提取物能有效地抑制枯草芽孢桿菌的增殖，延緩枯草芽孢桿菌進(jìn)入對數(shù)生長期。

2.3 菌形態(tài)觀察

為更直觀地了解提取物對枯草芽孢桿菌的抑制情況，利用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察了提取物處理枯草芽孢桿菌前后的形態(tài)變化。由圖4A可知，對照組中枯草芽孢桿菌細(xì)胞飽滿、表面光滑且形態(tài)規(guī)則；而圖4B中經(jīng)提取物處理后的菌細(xì)胞呈現(xiàn)拉長以及明顯的皺縮斷裂現(xiàn)象，細(xì)胞粘連且出現(xiàn)嚴(yán)重結(jié)構(gòu)破壞，大量細(xì)胞內(nèi)容物外泄。以上現(xiàn)象表明，提取物可通過破壞枯草芽孢桿菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)來抑制細(xì)菌生長，進(jìn)而達(dá)到較強(qiáng)的抑菌效果。

2.4 提取物對菌細(xì)胞滲透性的影響

AKP酶位于細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，是參與能量代謝的一種關(guān)鍵酶，只有當(dāng)菌細(xì)胞壁遭到破壞時(shí)，將泄露至菌液中，因此可通過檢測菌液中AKP酶活性判斷菌細(xì)胞壁的完整性[19]。AKP酶試劑盒測定的結(jié)果表明，在經(jīng)提取物處理前，只檢測到菌液中很低的AKP酶活性，而經(jīng)提取物處理4 h之后，菌液中的AKP酶活性顯著提高，對照組基本保持恒定(圖5A)。表明提取物對枯草芽孢桿菌的細(xì)胞壁造成了破壞。

細(xì)胞膜是細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要組成部分。如果細(xì)胞膜受損，細(xì)胞中的小分子就會(huì)率先被釋放到菌懸浮液中，從而增加懸浮液的EC值[20]。由圖5B可知，用提取物處理枯草芽孢桿菌4 h后，菌液中的EC值顯著高于對照組。核苷酸的泄漏量可作為評價(jià)細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)，260 nm的波長是DNA吸收的最佳波長，可用于確定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性。如圖5C所示，與對照組相比，當(dāng)提取物剛剛被加入到菌液中時(shí)，菌細(xì)胞內(nèi)的核苷酸就已泄漏。處理4 h后，懸浮液中的核苷酸含量顯著增加，表明提取物造成了枯草芽孢桿菌細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)核苷酸的泄漏。

蛋白質(zhì)是活細(xì)胞的主要組成部分，在細(xì)胞的生命周期中起著重要的作用?？捡R斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，會(huì)發(fā)生顯色反應(yīng)，因此可用此方法測定蛋白質(zhì)濃度[21]。如圖5D所示，提取物處理枯草芽孢桿菌4 h后，顯著提高了枯草芽孢桿菌懸浮液中蛋白質(zhì)的濃度。用SDS-PAGE和BCA蛋白試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組分的變化，以確定經(jīng)提取物處理后，枯草芽孢桿菌細(xì)胞膜的完整性。SDS-PAGE結(jié)果顯示，提取物組的蛋白質(zhì)條帶明顯少于對照組(圖6A)，這些結(jié)果與蛋白定量測定的趨勢一致(圖5D)，表明提取物破壞了細(xì)菌的細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)大量泄漏。

3 討論與結(jié)論

東革阿里的藥理活性已被人們所熟知，市場上東革阿里產(chǎn)品供不應(yīng)求。隨著東革阿里的過度開發(fā)，導(dǎo)致其野生資源極度匱乏。而利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，可有效地保證東革阿里的市場供應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，利用生物反應(yīng)器能快速高效生產(chǎn)東革阿里不定根，并通過優(yōu)化培養(yǎng)條件可提高生物量以及次生代謝產(chǎn)物含量[3-5]，但是關(guān)于東革阿里不定根的活性研究極少，關(guān)于東革阿里不定根提取物的抑菌活性研究未見報(bào)道。

該研究發(fā)現(xiàn)東革阿里不定根對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和條件致病性枯草芽孢桿菌均具有抑菌活性，其中對枯草芽孢桿菌的抑制效果最佳?？莶菅挎邨U菌是一種條件致病菌，當(dāng)機(jī)體抵抗力低下時(shí)致病，可引起內(nèi)源性眼炎[22]、敗血癥[23]等疾病以及食物中毒。該研究發(fā)現(xiàn)東革阿里不定根提取物對枯草芽孢桿菌的MIC為2 mg/mL，經(jīng)提取物處理后的枯草芽孢桿菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，菌細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)、核酸以及蛋白發(fā)生泄露，胞外AKP酶活性升高，表明細(xì)菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁通透性受到破壞。目前，已有研究表明東革阿里不定根中含有豐富的活性成分，如寬纓酮、酚類、多糖等[5]，但具體哪種活性成分發(fā)揮抑菌作用還有待于進(jìn)一步深入研究。