李春亭，趙 欣，閆可心，李海丹，張雪梅*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.延邊海嬌生物科技有限公司 吉林 龍井 133400)

豆王酵素是由延邊海嬌生物科技有限公司生產(chǎn)，具有美容護(hù)膚、營(yíng)養(yǎng)毛發(fā)、增強(qiáng)免疫力、修復(fù)胃粘膜、調(diào)理腸胃等功能。該產(chǎn)品主要成分為大豆、膠原低聚肽和酵素。大豆別稱黃豆、菽，隸屬種子植物門，豆目，豆科，大豆屬，原產(chǎn)地為中國(guó)，廣泛種植于世界各地。大豆中碳水化合物含量約為25%～30%，其中一半為膳食纖維，可加快食物通過腸道的時(shí)間，從而促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)，達(dá)到輕身的目的。另外，大豆的次級(jí)產(chǎn)物大豆異黃酮及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫力[1]。低聚肽一般以小分子肽為主[2]，豆王酵素中的膠原低聚肽是將干鱈魚魚皮中難吸收的膠原蛋白剪切成穩(wěn)定、生物活性高、吸收率高的低聚肽，平均分子量在1 000 Da以下，干鱈魚皮低聚肽具有改善面部膚質(zhì)[3]、促進(jìn)細(xì)胞因子和免疫蛋白的表達(dá)，有效抑制炎癥小體，從而增強(qiáng)免疫力[4-5]、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[6-7]等效果。酵素為一種發(fā)酵產(chǎn)物，其內(nèi)含有多種微生物，大量實(shí)驗(yàn)表明，酵素具有明顯的減肥作用[8]，酵素中的其他功效酶在潤(rùn)腸通便、提高免疫力等方面有顯著作用[9-11]。但將酵素與大豆、低聚肽經(jīng)先進(jìn)生物技術(shù)制備成豆王酵素產(chǎn)品，對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)功能和免疫功能的影響未見研究報(bào)道，所以該試驗(yàn)旨在探究豆王酵素對(duì)小鼠胃腸運(yùn)動(dòng)功能和機(jī)體免疫功能的影響，為豆王酵素產(chǎn)品的廣泛應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

昆明種小鼠，體重(22±3) g，雌性，均由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，足量基礎(chǔ)日糧(玉米、麩皮、大米為主，添加適量鈣粉、骨粉、酵母粉、食鹽、復(fù)合微生物和微量元素等)，自由飲水，隨機(jī)分組，苦味酸溶液標(biāo)記，飼養(yǎng)于恒溫(20～25 ℃)、恒濕(45%～55%)獨(dú)立通風(fēng)籠盒中，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 試劑

豆王酵素(延邊海嬌生物科技有限公司，批號(hào)：20200402)；阿托品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：201613)；多潘立酮片(黑龍江諾捷制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：2009014)；酚酞指示劑(貨號(hào)：G2860)；小鼠IgG ELISA試劑盒，上海朗頓生物科技有限公司；印度墨汁；0.01 mol/L的NaOH溶液；0.1% Na2CO3溶液；自制營(yíng)養(yǎng)糊(將5 g羧甲基纖維素鈉溶入125 mL水中攪拌至混懸液，加入5 mL印度墨汁，將鼠糧粉碎研磨加入混懸液中)；羧甲基纖維素鈉。

1.3 方法

1.3.1 小鼠腸推進(jìn)率測(cè)定

小鼠20只，隨機(jī)分為4組：空白組，豆王酵素低(150 mg/kg)、中(300 mg/kg)、高(600 mg/kg)劑量組。試驗(yàn)前禁食12 h，不禁水。小鼠灌胃給藥，連續(xù)灌胃30 d，空白組給予生理鹽水。末次給藥2 h后，各組小鼠灌胃墨汁(0.3 mL/只)，20 min后取自胃幽門至小腸末端腸段，測(cè)定幽門至墨水行跡最遠(yuǎn)處及腸段的總長(zhǎng)度，計(jì)算腸推進(jìn)率。腸推進(jìn)率 = 墨汁運(yùn)行最遠(yuǎn)長(zhǎng)度/腸段總長(zhǎng)度×100%。

1.3.2 小鼠腸胃調(diào)節(jié)作用

小鼠45只，隨機(jī)分為9組：空白組、模型組(阿托品組，多潘立酮組)和藥物組(阿托品+藥物高、中、低劑量組，多潘立酮+藥物高、中、低劑量組)。試驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，連續(xù)灌胃給藥5 d，空白組和模型組給予生理鹽水。末次給藥1 h后，除空白組外，模型組和給藥組分別皮下注射阿托品(1.5 mg/kg)和灌胃多潘立酮混懸液(13 mg/kg)，建立小鼠腸抑制和亢進(jìn)模型，15 min后各組小鼠灌胃給予半固體黑色糊狀物(0.3 mL/只)，20 min后同1.3.1方法取腸段，計(jì)算小鼠腸推進(jìn)率。

1.3.3 胃殘留率測(cè)定

小鼠分組和給藥同1.3.1，連續(xù)灌胃14 d。末次給藥2 h后，每只小鼠灌胃0.3 mL(約為0.46 g)半固體糊狀糧，20 min后取胃，稱胃全重。將胃沿胃大彎剪開，洗凈內(nèi)容物，稱胃凈重，計(jì)算胃殘留率。胃殘留率=(胃全重-胃凈重)/半固體糊灌胃量×100%。

1.3.4 胃酸分泌測(cè)定

小鼠分組和給藥同1.3.1，連續(xù)灌胃給藥14 d。末次給藥2 h后，取胃，剪開，加入蒸餾水混勻震蕩，加入酚酞試劑顯色，0.01 mol/L NaOH溶液滴定，當(dāng)酚酞顯色時(shí)記錄NaOH溶液的體積，計(jì)算胃液總酸度?？偹岫?mmol·L-1= 所用NaOH毫升數(shù)×20/0.6。

1.3.5 小鼠臟器指數(shù)測(cè)定

小鼠20只，隨機(jī)分為空白組、豆王酵素低(150 mg/kg)、中(300 mg/kg)、高(600 mg/kg)劑量組，連續(xù)灌胃給藥15 d，末次給藥后稱量小鼠體質(zhì)量，取胸腺、脾臟，稱胸腺、脾臟質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)(mg/g)= 臟器質(zhì)量(mg)/ 體質(zhì)量(g)。

1.3.6 小鼠體液免疫指標(biāo)測(cè)定

小鼠分組和給藥同1.3.5，取血，低速離心，得血清，用ELISA試劑盒進(jìn)行測(cè)定，顯色后在波長(zhǎng)450 nm處讀取OD值，計(jì)算IgG含量。

1.3.7 碳粒廓清功能測(cè)定

小鼠分組和給藥同1.3.5，連續(xù)灌胃給藥15 d后，小鼠尾靜脈注射5倍稀釋的印度墨汁10 mL/kg，分別于5 min(t1)、20 min(t2)時(shí)眼眶靜脈叢取血溶于0.1% Na2CO3溶液，于600 nm處測(cè)OD值D1、D2。稱胸腺、肝臟質(zhì)量，計(jì)算碳粒廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α。碳粒廓清指數(shù)K = ( lgD1-lgD2) /( t2-t1)；吞噬指數(shù)α = K1/3×體重 /( 肝重+脾重)。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 豆王酵素對(duì)小鼠胃腸功能的影響

2.1.1 豆王酵素對(duì)小鼠腸推進(jìn)的影響

由表1可見，連續(xù)灌胃30 d后，豆王酵素低、中、高劑量組的腸推進(jìn)率與空白對(duì)照組相比，均明顯增加(P<0.05)，并隨著藥物劑量的增大，小鼠腸推進(jìn)率也隨之增高。數(shù)據(jù)表明，豆王酵素明顯促進(jìn)了小鼠的小腸運(yùn)動(dòng)。

表1 豆王酵素對(duì)小鼠腸推進(jìn)功能的影響

2.1.2 豆王酵素對(duì)小鼠腸胃紊亂的調(diào)節(jié)

由表2可見， 與空白對(duì)照組相比，阿托品組的腸推進(jìn)率明顯降低(P<0.05)，多潘立酮組腸推進(jìn)率顯著升高(P<0.01)。中、高藥物劑量組與阿托品組腸推進(jìn)率比較有顯著增強(qiáng)趨勢(shì)(P<0.05，P<0.01)。藥物中劑量組與多潘立酮組相比，小腸推進(jìn)有顯著減弱趨勢(shì)(P<0.01)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，豆王酵素尤其是中劑量組對(duì)阿托品所致小腸抑制和多潘立酮所致小腸亢進(jìn)產(chǎn)生雙向調(diào)節(jié)作用。

表2 豆王酵素對(duì)小鼠腸胃紊亂的調(diào)節(jié)作用

2.1.3 豆王酵素對(duì)小鼠胃殘留率的影響

由表3可知，與空白對(duì)照組相比，低、中、高劑量組豆王酵素對(duì)小鼠胃殘留率均無(wú)明顯差異(P>0.05)。說明豆王酵素不作用于小鼠胃部，對(duì)小鼠胃運(yùn)動(dòng)無(wú)明顯促進(jìn)或抑制作用。

表3 豆王酵素對(duì)小鼠胃殘留率的影響

2.1.4 豆王酵素對(duì)小鼠胃酸分泌的影響

由表4可知，與空白組相比，豆王酵素低劑量組的小鼠胃液酸度減弱(P<0.05)，中、高劑量組的小鼠胃液酸度顯著增強(qiáng)(P<0.01)。胃酸分泌增多，可充分水解胃內(nèi)食物。

表4 豆王酵素對(duì)小鼠胃酸分泌的影響

2.2 豆王酵素對(duì)小鼠免疫功能的影響

2.2.1 豆王酵素對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

由表5可知，與空白組相比，豆王酵素中、高劑量組小鼠脾臟指數(shù)明顯提高(P<0.05)；而與空白組相比，豆王酵素各劑量組胸腺指數(shù)無(wú)顯著性提高(P>0.05)。

表5 豆王酵素對(duì)小鼠小鼠臟器指數(shù)的影響

2.2.2 豆王酵素對(duì)小鼠體液免疫指標(biāo)的影響

由表6可知，與空白組相比，豆王酵素中劑量組IgG含量顯著提高(P<0.05)，但豆王酵素低、高劑量組的IgG含量雖有升高，但與空白組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表6 豆王酵素對(duì)小鼠IgG含量的影響

2.2.3 豆王酵素對(duì)小鼠碳粒廓清功能的影響

由表7可知，與空白組相比，豆王酵素中劑量組的吞噬指數(shù)α和廓清指數(shù)K明顯增高(P<0.05)，豆王酵素低、高劑量組的吞噬指數(shù)α和廓清指數(shù)K無(wú)顯著性增高(P>0.05)。

表7 豆王酵素對(duì)小鼠碳粒廓清功能的影響

3 討論與結(jié)論

胃腸運(yùn)動(dòng)功能是反應(yīng)健康的重要指標(biāo)之一，腸道紊亂是許多疾病發(fā)生發(fā)展的根本誘因[12]，易誘發(fā)功能性胃腸疾病，包括腸易激綜合征、功能性消化不良或功能性便秘等[13]。而功能性消化不良的主要原因之一就是胃腸動(dòng)力障礙[14]，通過測(cè)定腸推進(jìn)率可檢測(cè)藥物能否改善胃腸運(yùn)動(dòng)障礙和促進(jìn)小腸蠕動(dòng)。該研究結(jié)果顯示，豆王酵素提高了小鼠的腸推進(jìn)率，且隨著劑量的增加小腸推進(jìn)速度隨之提高，說明豆王酵素能有效促進(jìn)腸道運(yùn)動(dòng)，從而治療腸動(dòng)力障礙。

胃腸蠕動(dòng)抑制可導(dǎo)致功能性消化不良，而胃腸蠕動(dòng)亢進(jìn)可導(dǎo)致腹痛腹瀉[15]。在一般臨床治療中，腸紊亂的治療主要以通泄為主[16]，但只能緩解一時(shí)且對(duì)腸蠕動(dòng)亢進(jìn)情況的治療作用極其有限。阿托品為M受體阻斷劑，可抑制小鼠胃腸的正常運(yùn)動(dòng)[17]，而多潘立酮為外周多巴胺受體拮抗劑，可阻斷胃腸的多巴胺受體從而促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)作用。該研究結(jié)果顯示，豆王酵素能顯著拮抗阿托品所致小腸推進(jìn)抑制和多潘立酮所致小腸推進(jìn)亢進(jìn)作用，說明豆王酵素在一定劑量下可治療腸運(yùn)動(dòng)紊亂疾病。另外，胃液在調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)中也發(fā)揮著重要作用[18]，胃酸不足時(shí)，可引起腹瀉消化不良等反應(yīng)[19]。該研究結(jié)果顯示，豆王酵素中、高劑量組可增強(qiáng)胃內(nèi)胃酸分泌，使胃內(nèi)食物被充分水解，從而促進(jìn)小鼠胃內(nèi)消化。

臟器指數(shù)是指機(jī)體內(nèi)臟器官的相對(duì)重量，一定程度上可反應(yīng)臟器功能的強(qiáng)弱[20]。脾臟和胸腺是動(dòng)物機(jī)體的重要免疫器官，在體液免疫和細(xì)胞免疫中起重要作用[21]。臟器指數(shù)的變化可以間接證明藥物對(duì)免疫系統(tǒng)的影響程度[22]。該研究結(jié)果顯示，豆王酵素中、高劑量組可明顯提高小鼠的脾臟指數(shù)，但對(duì)小鼠胸腺指數(shù)無(wú)明顯影響，可能與小鼠成長(zhǎng)過程中胸腺退化有關(guān)。

免疫球蛋白IgG是反映機(jī)體體液免疫的主要指標(biāo)。成熟B細(xì)胞分化的漿細(xì)胞可分泌IgG，為血液中含量最多的免疫蛋白，IgG含量的增加表示機(jī)體有良好的免疫活性反應(yīng)[23]。該研究結(jié)果顯示，豆王酵素一定程度提高了小鼠機(jī)體內(nèi)IgG的分泌水平。另外，碳粒廓清指數(shù)可以反映肝臟、脾臟和巨噬細(xì)胞的免疫功能[24]。巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，能夠消除體內(nèi)外來異物、寄生病原體和腫瘤細(xì)胞等[25]，從而反映出機(jī)體非特異性免疫水平。碳廓指數(shù)K和吞噬指數(shù)α的高低可顯示出吞噬細(xì)胞吞噬異物能力的強(qiáng)弱。該研究顯示，豆王酵素提高了碳廓指數(shù)K和吞噬指數(shù)α，表明豆王酵素可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬機(jī)體內(nèi)異物的能力。

綜上所述，豆王酵素能增強(qiáng)小鼠小腸推進(jìn)率但對(duì)胃排空無(wú)明顯影響，表明豆王酵素可以作用于小腸，促進(jìn)小腸蠕動(dòng)，增強(qiáng)小腸內(nèi)食物的消化，對(duì)腸運(yùn)動(dòng)紊亂具有雙向調(diào)節(jié)作用，同時(shí)豆王酵素能提高機(jī)體體液免疫和非特異性免疫，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，這些數(shù)據(jù)為豆王酵素的應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。