任 娟，方振宇，金花子

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

越來越多的證據(jù)顯示[1]，大腦中雌激素水平不僅與生殖相關(guān)的神經(jīng)內(nèi)分泌活動有關(guān)，而且可以調(diào)節(jié)大腦的功能，如記憶，認(rèn)知等。雌激素(主要 E2 )是一種甾體激素，主要在卵巢和胎盤中分泌[2]。它可以促進(jìn)卵泡發(fā)育，同時對下丘腦—垂體也有負(fù)反饋作用[3]。卵巢切除后雌激素的下降，導(dǎo)致FSH及LH因失去E2負(fù)反饋影響而逐漸升高。大量文獻(xiàn)表明，雌激素可影響腦內(nèi)神經(jīng)元的發(fā)育和存活[4]。國內(nèi)外研究[5-6]已證實，雌激素分泌下降是導(dǎo)致認(rèn)知功能下降以及癡呆的重要危險因素。大腦是體內(nèi)雌激素作用的重要的靶器官之一[7]，該試驗主要探究切除卵巢和子宮對小鼠記憶認(rèn)知能力以及體內(nèi)相關(guān)激素水平的影響，通過小鼠模型來探究去卵巢和子宮卵巢對女性記憶力的影響。眾所周知，絕經(jīng)給中老年女性的生活質(zhì)量和健康帶來嚴(yán)重影響，如記憶力減退[8]等。近些年來，國內(nèi)外學(xué)者專家研究發(fā)現(xiàn)，用激素治療(HRT)[9]來緩解更年期癥狀的人群癡呆的發(fā)病率在逐漸降低，這也引發(fā)了對雌激素的廣泛研究[10-12]，流行病學(xué)研究表明，絕經(jīng)后雌性雌激素的缺失會增加以認(rèn)知功能下降為主要表現(xiàn)的疾病發(fā)生，如AD[13]。Gibbs等[14]通過雌激素剝奪來模擬雌性個體絕經(jīng)狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)去卵巢(OVX)大鼠給予雌激素替代治療后其空間工作記憶錯誤次數(shù)及參考記憶錯誤次數(shù)均改善，結(jié)果顯著。Wilson等[15]研究認(rèn)為，短期的雌激素剝奪對雌性個體空間學(xué)習(xí)記憶能力沒有影響，而超過4～5 w的雌激素剝奪可使大鼠認(rèn)知功能顯著減弱[16]，故接下來將對卵巢切除和子宮卵巢切除42 d(6 w)后的小鼠空間記憶力功能進(jìn)行Morris水迷宮試驗并對結(jié)果進(jìn)行分析探討[17-19]，觀察此時小鼠體內(nèi)激素變化及空間記憶能力是否受到顯著影響。

1 材料與方法

1.1 時間和地點

試驗于2019年2—4月于天津市南開醫(yī)院動物中心進(jìn)行。

1.2 試驗小鼠及飼養(yǎng)管理

8周齡雌性SPF級昆明鼠18只，體重22～25 g,均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK(京)2016-0002，于南開醫(yī)院動物中心飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類飼料飼籠飼，每籠3只，均自由攝食，飲水，室溫22～24 ℃，濕度45%～65%，光暗周期為(光照8：00～20：00;黑暗20：00～8：00)，將18只小鼠隨機分為3組，每組6只：試驗1組不做任何處理，試驗2組進(jìn)行卵巢切除，試驗3組進(jìn)行子宮和卵巢切除，正常飼養(yǎng)觀察42 d后進(jìn)行為期6 d的Morris水迷宮試驗。每日定時觀察小鼠的健康狀況，減少疾病、營養(yǎng)不良等對試驗帶來的不良影響。該研究符合南開醫(yī)院動物中心實驗動物倫理委員會所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1 分組與模型的制備

1.3.1.1 分組

選取體況相近的18只8周齡昆明鼠，其中，6只為正常組,作為對照組，只切開皮膚及肌肉,實施入路手術(shù),然后依次縫合肌肉,皮膚,不做進(jìn)一步處理(試驗1組)；6只切除卵巢(試驗2組)，6只同時切除子宮與卵巢(試驗3組)。在小鼠模型制備完成后在正常飼養(yǎng)42 d后進(jìn)行Morris水迷宮測試[20]。

1.3.1.2 小鼠模型的制備

1) 術(shù)前準(zhǔn)備：75%酒精，棉球，手術(shù)刀片，無齒鑷，眼科剪，持針器，縫合線4#，圓針，固定手術(shù)臺。

2) 0.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠(0.1 mL/10 g)并于之后進(jìn)行固定，面罩給氣麻藥。

3) 用碘伏棉球擦拭小鼠背下部兩側(cè)皮膚以消毒。

4) 用手術(shù)刀在肋脊角處切開皮膚及肌肉,暴露卵巢。自輸卵管處結(jié)扎卵巢動靜脈,用眼科剪完整地切除小鼠自身的雙側(cè)卵巢，如圖1所示。子宮卵巢切除組至此將卵巢與子宮一同切除，對照組只切開皮膚及肌肉,實施入路手術(shù),然后依次縫合肌肉,皮膚,不做進(jìn)一步處理。

5) 依次逐層縫合組織后進(jìn)行酒精擦拭消毒以及青霉素感染預(yù)防。

6) 解開面罩，將小鼠置于28 ℃溫箱中待其蘇醒。

7) 術(shù)后一周內(nèi)密切觀察小鼠的狀態(tài)并于術(shù)后一周逐只進(jìn)行陰道涂片檢查，以確定卵巢切除完全，確保造模成功。

1.3.2 Morris水迷宮行為測試

Morris水迷宮是英國心理學(xué)家Morris于1981年設(shè)計并應(yīng)用于腦學(xué)習(xí)記憶機制研究的一種試驗手段。水迷宮為高0.5 m，直徑1.2 m，深0.3 m的圓形不銹鋼水池，水池內(nèi)第一象限放入直徑9 cm的圓臺，置于水面下1 cm，池水中加入可食用性黑色素，與池內(nèi)顏色均為黑色，使動物無法用視覺辨認(rèn)池內(nèi)站臺的位置，池內(nèi)水溫為21～25 ℃，采用遮光簾有效掩蓋進(jìn)入試驗區(qū)域的雜散光。采用間接光源避免對圖像采集時的干擾。計算機攝像系統(tǒng)自動監(jiān)測小鼠在水池中的游泳情況，并通過軟件分析獲取試驗數(shù)據(jù)(圖2)。整個水迷宮測試連續(xù)6 d，主要的試驗內(nèi)容包括階段1：定位航行試驗(Hidden Platform Text)5 d，階段2：空間探索試驗(Probe Trains)1 d。

1.3.2.1 定位航行試驗

歷時5 d，每天定于固定時間段練習(xí)4次，順序為象限1，3，2，4。練習(xí)開始時，將平臺置于第一象限，從池壁4個起始點的任一點將小鼠面向池壁放入水池，4個象限按規(guī)定順序依次進(jìn)行練習(xí)。自由錄像記錄系統(tǒng)記錄小鼠找到平臺的時間和游泳路徑，小鼠找到平臺后或者60 s內(nèi)找不到平臺(潛伏期記為60 s)，則由試驗者將其引導(dǎo)到平臺，在平臺上休息10 s，再進(jìn)行下只小鼠的試驗，每日以小鼠4次練習(xí)潛伏期的平均值作為小鼠當(dāng)日的成績。

1.3.2.2 空間探索試驗

定位航行試驗結(jié)束24 h后，撤除圓臺，然后任選一相同入水點將鼠放入水中，記錄鼠在60 s內(nèi)的游泳路徑，同時也記錄鼠在目標(biāo)象限的停留時間和穿越目標(biāo)象限的次數(shù)，觀察受試鼠的空間定位能力及在空間探索過程中的變化規(guī)律。在電腦屏幕上用圓形環(huán)標(biāo)記出圓臺原所在位置，這樣可以記錄穿越原站臺所在位置的次數(shù)。

1.4 雌激素檢測

小鼠眼球取血進(jìn)行血清性激素測定，使用離心管收集并密封1 mL以上血液，離心機3 000 r/min離心10 min后，使用移液槍移取上層清液即為血清，密封后放入-80 ℃冰箱凍存待用。采用雙抗體夾心ELISA試劑盒檢測法檢測不同組別小鼠的血清FSH、LH、E2水平，并按劑盒說明書進(jìn)行具體操作步驟[22]。酶標(biāo)儀雙波長(主波450 nm，輔助波長630 nm)對不同組別的標(biāo)本OD值進(jìn)行測量，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后計算不同組別血清中FSH、LH、E2 3種激素含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組樣本間差異的比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組間的均數(shù)比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 定位航行試驗

通過定位試驗的結(jié)果(表1)可以得出，在試驗的第2天，初始象限為第2，第4象限時，1組的逃避潛伏期低于2組和3組，在初始象限為第1，第3象限時，1組的逃避潛伏期要高于2組和3組；同時可以看出，通過3 d的訓(xùn)練后，1組，2組和3組的小鼠空間記憶能力發(fā)生了一些改變，在定位航行的第5天，1組在初始象限為第1，第2，第4象限時的逃避潛伏期小于3組。經(jīng)SPSS分析得出，不同組別間逃避潛伏期有顯著性差異(P<0.05)。

表1 3組小鼠定位航行試驗中的逃避潛伏期

2.2 空間探索試驗

不同組別目標(biāo)象限游泳時間占總時間百分比，初始角度和穿越圓臺次數(shù)比較見表2。由表可知，1組小鼠目標(biāo)象限所占總時間的百分比高于2組，2組的目標(biāo)象限所占總時間的百分比高于3組(P>0.05)，差異不顯著；1組的初始角度和穿越圓臺次數(shù)都高于2組，2組的初始角度和穿越圓臺次數(shù)都高于3組(P>0.05)，差異不顯著。

表2 空間探索試驗結(jié)果

經(jīng)過4 d的定位航行試驗之后，小鼠對水迷宮圓臺的空間位置產(chǎn)生不同程度的記憶，撤除圓臺后，系統(tǒng)記錄游泳軌跡以反映小鼠對尋找圓臺的不同搜尋策略。由圖3，4及表2可知，正常組小鼠在目標(biāo)象限內(nèi)的尋找路程和時間較其他象限均長，卵巢切除組和子宮卵巢切除組在目標(biāo)象限游泳路程及時間較正常組短，其對圓臺記憶能力與正常組比較有一定差距，相比較而言，子宮卵巢切除組較卵巢切除組在目標(biāo)象限的時間短，其對圓臺記憶能力與卵巢切除組有一定程度的差異。從穿越圓臺次數(shù)看，正常組在一定程度上高于其他2個手術(shù)組，但無顯著性差異。

2.3 血清性激素水平檢測

與正常組相比，切除卵巢子宮組和切除卵巢組的FSH、LH水平均顯著升高，兩組小鼠血清E2水平均顯著下降，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);而與卵巢去勢組相比，切除卵巢子宮組FSH、LH水平均略升高，E2水平也稍降低，但兩組之間均不顯著，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

表3 不同組別小鼠血清性激素水平比較

3 討論

將試驗的第2天作為定位航行試驗的開始，定位航行試驗中的小鼠開始時表現(xiàn)為正常組能更快更準(zhǔn)確地找到平臺，也可以驗證諸多試驗中子宮卵巢切除和卵巢切除導(dǎo)致小鼠雌激素水平下降，從而導(dǎo)致小鼠空間記憶力差，但經(jīng)過幾天的練習(xí)后，試驗組小鼠均能更快更準(zhǔn)確地找到平臺，甚至有幾只試驗組小鼠的學(xué)習(xí)能力強過正常組小鼠，說明切除卵巢和切除子宮卵巢的小鼠也具備很強的學(xué)習(xí)能力。在空間探索試驗中，正常組小鼠表現(xiàn)為能更長時間在目標(biāo)象限進(jìn)行平臺探索，說明了正常組小鼠的記憶能力稍強，切除卵巢組小鼠次之，切除子宮卵巢組小鼠空間記憶力最差，但均具有很強的學(xué)習(xí)能力，也說明短時間內(nèi)激素水平的變化不足以顯著性降低小鼠的空間記憶能力。

3.1 卵巢與卵巢子宮同時切除對成年雌鼠空間激素水平的影響

體內(nèi)雌激素主要由卵巢、腎上腺皮質(zhì)分泌，雌激素可促進(jìn)卵泡發(fā)育使成熟的卵子順利排出，同時對下丘腦—垂體調(diào)節(jié)機制有負(fù)反饋作用[24-25]。卵巢切除后雌激素下降，導(dǎo)致FSH及LH因失去E2的負(fù)反饋效應(yīng)而逐漸升高。人類絕經(jīng)前5～10年，卵巢濾泡功能逐漸衰退，從而FSH和LH水平開始逐漸升高，并伴有E2水平的降低[26]。在35～50歲的正常生殖健康婦女的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)[27-28]，隨增齡變化卵巢體積縮小，卵巢的功能降低，發(fā)育成熟的卵泡逐漸減少，內(nèi)分泌紊亂癥狀開始出現(xiàn)，血中雌激素水平下降，伴隨而來的下丘腦促性腺激素釋放激素GnRH水平、FSH和LH明顯上升。該試驗使用子宮卵巢切除與卵巢切除造模小鼠進(jìn)行模擬試驗，選取E2、LH、FSH這3個與生殖內(nèi)分泌關(guān)系最密切的激素作為研究指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)切除卵巢與同時切除子宮和卵巢均能使小鼠血清內(nèi)激素水平發(fā)生上述改變，影響顯著。比較而言，這種改變在同時切除卵巢和子宮組中表現(xiàn)更為突出。

3.2 卵巢切除對成年雌鼠空間記憶能力的影響

Morris水迷宮是20世紀(jì)80年代由英國生理學(xué)家Morris[29]設(shè)計并應(yīng)用于評估嚙齒類動物學(xué)習(xí)記憶功能的重要工具,涉及的被試動物主要是鼠，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于認(rèn)知功能方面的研究。田方澤等[30]通過運用Morris水迷宮試驗對去卵巢小鼠所致老年癡呆模型探討研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢小鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力下降，很好的模擬了阿爾茨海默癥(Alzheimer disease，AD)外在行為學(xué)的表現(xiàn)。賈曉靜等[31]在研究OVX模型的Morris水迷宮檢測中發(fā)現(xiàn)，其造模6周后去卵巢所致AD小鼠尋找平臺的潛伏期明顯增長，在目標(biāo)象限的時間變長，與對照組以及ERT代替組相比較有明顯的顯著性差異(P<0.01)，這就說明了造模后的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，同時也很好地模擬了AD外在行為學(xué)表現(xiàn)，趙珩[32]對去勢12周后的Wistar大鼠通過Morris水迷宮檢測得出，和倍美力組比較來說，模型組大鼠的潛伏期顯著增長(P<0.01)，跨越平臺次數(shù)顯著減少(P<0.01)。對該試驗而言，通過對卵巢切除組小鼠和正常組小鼠的Morris水迷宮觀察可以得到初步結(jié)論，卵巢切除會對昆明小鼠的空間記憶功能有一定程度的損壞，但手術(shù)組小鼠仍有較強的學(xué)習(xí)記憶能力，所以就該試驗來說，結(jié)果分析并未發(fā)現(xiàn)有顯著性差異，對于卵巢切除對小鼠空間記憶能力的影響仍需進(jìn)一步研究。

3.3 子宮卵巢切除對小鼠空間記憶能力的影響

小鼠的空間記憶能力受到許多方面的影響，其中子宮卵巢切除也是影響小鼠空間記憶能力的一個可能性的因素，子宮不分泌雌激素，它只是雌激素作用的靶器官[33]，雌激素對子宮內(nèi)膜和平滑肌的增殖和代謝有明顯促進(jìn)作用[34]，雌激素水平下降會導(dǎo)致早老性癡呆癥，明浩[35]等研究認(rèn)為，對于雌性小鼠的研究表明卵巢激素確實可以調(diào)節(jié)睡眠，剝奪對內(nèi)側(cè)顳葉依賴性認(rèn)知的影響，卵巢切除會使雌激素水平降低，而子宮卵巢同時切除則會使降低水平之后的雌激素更無子宮這一靶器官去作用，從而更加加重影響睡眠，而大腦受到睡眠障礙會對認(rèn)知功能有一定的不良影響，確實有研究已經(jīng)表明，睡眠功能障礙可能會加速年齡相關(guān)的認(rèn)知能力下降，并轉(zhuǎn)化為AD[36-37]，但并沒有其他研究可以解釋卵巢激素的丟失對動物睡眠和記憶之間的影響，仍需進(jìn)一步試驗研究驗證此結(jié)論。

4 結(jié)論

通過該試驗，切除卵巢和切除子宮卵巢對小鼠體內(nèi)激素雌激素水平影響顯著，卵巢切除后會影響雌激素水平導(dǎo)致體內(nèi)其他相關(guān)激素水平的變化，從而造成內(nèi)分泌紊亂；2個試驗組雌激素變化對小鼠空間記憶能力均有一定的影響，數(shù)據(jù)顯示影響不顯著。分析可知：1) 試驗小鼠樣本數(shù)過少，需在此基礎(chǔ)上加大試驗基數(shù)，增大試驗樣本數(shù)，以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性和說服力;2) 卵巢切除后雌激素水平發(fā)生變化時間較短，對小鼠空間記憶能力沒有造成顯著影響。該試驗為雌激素降低影響空間記憶相關(guān)的時間周期與激素影響小鼠空間記憶能力路徑的研究提供了研究基礎(chǔ)。