王 平，姜軼瑤，楊超群，高梓峰，任雅萍，樸世領(lǐng)

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 13302 )

煙草作為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，不僅能夠解決邊遠(yuǎn)地區(qū)農(nóng)民脫貧問題，同時(shí)也大大提高了我國(guó)的財(cái)政稅收[1-2]。但煙草容易發(fā)生病蟲害，嚴(yán)重影響產(chǎn)量。當(dāng)煙草感染馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)后，會(huì)造成煙株花葉，脈帶壞死，植株畸形矮化，嚴(yán)重影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育，這對(duì)煙草的產(chǎn)量造成了不可逆的傷害[3-4]。

PVY是一種系統(tǒng)性侵染病害，主要發(fā)生在煙株的成長(zhǎng)期，在高溫條件下也能夠保持活性[5]。PVY傳播范圍廣，途徑多，但主要通過蚜蟲和汁液摩擦進(jìn)行傳播[6]。當(dāng)正常葉片與病葉產(chǎn)生摩擦，葉片茸毛受到損傷，正常的葉片就容易感染病毒[7]。目前，對(duì)煙草PVY的防治非常困難，藥劑防治的效果不理想，培育抗病品種是防治病毒最有效的手段。王靜靜等[8]研究發(fā)現(xiàn)，TCTP基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要作用，它對(duì)細(xì)胞增殖、分化和再生起著促進(jìn)作用，能夠?qū)股锩{迫或非生物脅迫。相關(guān)研究表明[9]，在煙草中TCTP能夠促進(jìn)PVY的侵染，蔡健宇等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在健康的煙草中TCTP定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，但在感病的植株中TCTP僅定位在細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)病毒侵染煙株時(shí)，TCTP定位發(fā)生改變，可能更利于病毒的侵染。雖然前期研究已經(jīng)證實(shí)TCTP基因在感PVY起重要作用，但尚未在不同抗性材料之間進(jìn)行該基因的克隆及生物信息學(xué)分析。該試驗(yàn)以PVY高抗品種“SY04-3”和高感品種“NC95”為材料，分別克隆出“SY04-3”和“NC95”的TCTP基因，并通過生物信息學(xué)手段比較分析兩者之間差異，為進(jìn)一步深入研究煙草TCTP基因?qū)VY的作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以PVY高感品種“NC95”與高抗品種“SY04-3”為試材，在延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院溫室進(jìn)行育苗，待煙苗長(zhǎng)至3葉期移栽至營(yíng)養(yǎng)缽中，煙株長(zhǎng)至5～6片葉時(shí)進(jìn)行人工接種PVY病毒。病毒葉由延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供，將病葉放入干凈的研缽中，加入磷酸緩沖液進(jìn)行研磨，汁液全部磨出后過濾掉殘?jiān)?，最后用磷酸緩沖液定容至300 mL，制成PVY病毒液，放在4 ℃冰箱備用。接種時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的煙株，用石英砂在葉片劃出傷口，用棉簽蘸取病毒液涂抹在傷口，在溫室中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

接種后48 h從下至上第2片葉進(jìn)行取樣，取樣后，加入液氮充分研磨，按照天根生化科技(北京)有限公司的RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行RNA提取。采用天根生化科技(北京)有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒并按照說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，獲得cDNA。將獲得的cDNA放在-20 ℃保存。

1.2.2 煙草TCTP基因克隆

采用Primer 5軟件設(shè)計(jì)煙草TCTP特異上游引物為：5′-ATGTTGGTTTATCAGGATCTTCT-3′，下游引物為：5′-TTAACACTTGACCTCCTTGAGT-3′。分別以“SY04-3”和“NC95”的 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR程序?yàn)?4 ℃變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s， 進(jìn)行30個(gè)循環(huán)、之后72 ℃延伸10 min。將PCR 結(jié)果凝膠電泳檢測(cè)，回收后連接pMD19-T，再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，后稀釋劃線。酶切驗(yàn)證正確后送到生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

采用DNAMAN將測(cè)序后得到的cDNA序列進(jìn)行同源性分析，并對(duì)目標(biāo)序列編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析。利用Expasy(https://web.expasy.org/protparam/)在線軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位采用在線軟件PSORT(https://www.genscript.com/psort.html)。使用TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)在線軟件對(duì)蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。利用SignalP-3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)在線軟件蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。使用Protscale(https://web.expasy.org/protscale/)在線軟件對(duì)蛋白進(jìn)行疏水性/親水性預(yù)測(cè)。使用在線軟件NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)進(jìn)行蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。利用YinOYang 1.2(http://www.cbs.dtu.dk/services//)在線軟件對(duì)蛋白進(jìn)行O-β-葡萄糖糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。利用在線軟件SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用在線軟件SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/) 進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析。通過 NCBI網(wǎng)站中CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd) 對(duì)蛋白功能域進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.4TCTP基因相對(duì)表達(dá)量

選取長(zhǎng)勢(shì)一致的煙株，在接種后的12、24、72 h進(jìn)行取樣，將取下的葉片迅速包好放入液氮，保存在-70 ℃，送入公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)。以測(cè)序結(jié)果中的Actin為內(nèi)參基因，最后采用2-ΔΔCT[11]法計(jì)算基因表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草TCTP擴(kuò)增

將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，在500 bp左右看到明顯的條帶(圖1)。

將獲得的目的基因克隆到大腸桿菌中并進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，“NC95”與已公布的TCTP基因序列(登錄號(hào)為KM507327.1)一致性為100%，證實(shí)所得到的序列為煙草TCTP基因?！癗C95”與“SY04-3”的TCTP片段長(zhǎng)度都為507 bp，二者均有完整的開放閱讀框，編碼168個(gè)氨基酸。通過DNAMAN 7.0 對(duì)“SY04-3”和“NC95”基因序列與蛋白質(zhì)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)二者基因序列存在第206位，227位，260位，313位，317位，485位，500位存在7處堿基突變(圖2)，蛋白質(zhì)序列在第97位存在一個(gè)區(qū)別，即絲氨基酸(S)變?yōu)樘於０?N)(圖3)。

2.2 煙草TCTP蛋白理化性質(zhì)分析

通過Expasy在線軟件對(duì)煙草蛋白進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明：抗病材料“SY04-3”蛋白由168個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子質(zhì)量為18 782.16 kD,等電點(diǎn)(PI)值為4.33；帶負(fù)電荷殘基總數(shù)為29，帶正電荷殘基總數(shù)為15，分子式為C848H1299N205O266S5；不穩(wěn)定指數(shù)為23.97，推測(cè)這類蛋白為穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)為85.83，親水性總平均值為-0.27。感病材料“NC95”蛋白由168個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子質(zhì)量為18 773.06 kD,等電點(diǎn)(PI)值為4.25；帶負(fù)電荷殘基總數(shù)為30，帶正電荷殘基總數(shù)為14，分子式為C845H1292N204O269S5；不穩(wěn)定指數(shù)為24.37，推測(cè)這類蛋白為穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)為85.83，親水性總平均值為-0.263。

通過PSORT在線軟件對(duì)“SY04-3”和“NC95” TCTP蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果表明：2個(gè)蛋白可能定位在細(xì)胞質(zhì)(圖4)。使用TMHMM-2.0在線軟件發(fā)現(xiàn)2個(gè)蛋白均無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)(圖5)。利用SignalP-3.0在線軟件對(duì)2個(gè)蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示C、Y、S值均小于0.2，不存在信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)該蛋白為非分泌蛋白(圖6)，在細(xì)胞質(zhì)合成后無(wú)法進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.3 煙草TCTP蛋白疏水性/親水性

使用Protscale在線軟件對(duì)TCTP蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明(圖 7)，“SY04-3” 和“NC95”的TCTP蛋白在67位和68位氨基酸達(dá)到最大疏水性位置，為1.389；在81位和82位氨基酸達(dá)到最大親水性位置，為-2.378，預(yù)測(cè)該蛋白為親水性蛋白。

2.4 煙草TCTP蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)分析

2.4.1 煙草TCTP蛋白磷酸化位點(diǎn)分析

蛋白質(zhì)磷酸化是一種普通的調(diào)節(jié)方式，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中起著十分重要的作用。使用在線軟件NetPhos進(jìn)行蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)(圖8)，結(jié)果顯示“SY04-3”的磷酸化位點(diǎn)有13個(gè)，其中，Ser磷酸化位點(diǎn)為Ser9、Ser15、Ser50、Ser81、Ser123、Ser135，共6個(gè)；Thr磷酸化位點(diǎn)為Thr21、Thr73、Thr99、Thr140，共4個(gè)；Tyr磷酸化位點(diǎn)為Tyr4、Tyr20、Tyr94，共3個(gè)?！癗C95”的磷酸化位點(diǎn)有14個(gè)，較“SY04-3”的磷酸化位點(diǎn)多1個(gè)Ser97。磷酸化位點(diǎn)可能對(duì)修飾該蛋白的結(jié)構(gòu)或功能起著重要作用，同時(shí)也能參與該蛋白的活性調(diào)控。

2.4.2 煙草TCTP蛋白糖基化位點(diǎn)分析

利用YinOYang 1.2在線軟件對(duì)TCTP蛋白進(jìn)行O-β-葡萄糖糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)(圖9)，“SY04-3”和“NC95”的糖基化位點(diǎn)只有1個(gè)，且位置相同，均為Ser81。

2.5 煙草TCTP蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析與保守結(jié)構(gòu)域分析

2.5.1 煙草TCTP蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)

利用在線軟件SOPMA對(duì)TCTP蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[12]，結(jié)果顯示，“SY04-3” 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)α螺旋有86個(gè)，占51.19%；無(wú)規(guī)則卷曲有39個(gè)，占23.21%；β轉(zhuǎn)角有9個(gè)，占6.55%，延伸鏈有30個(gè)，占19.05%；“NC95”蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)α螺旋有80個(gè)，占47.62%；無(wú)規(guī)則卷曲有42個(gè)，占25.00%；β轉(zhuǎn)角有14個(gè)，占8.33%，延伸鏈有34個(gè)，占19.05%(圖10)。

通過在線軟件SWISS-MODEL對(duì)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)[13]，預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)結(jié)果如圖11?！癝Y04-3”與“NC95”的堿基不同，存在7出突變，蛋白質(zhì)序列在第97位由S絲氨基酸變?yōu)镹天冬酰胺，它們的三級(jí)結(jié)構(gòu)有差異。

2.5.2 煙草TCTP蛋白保守結(jié)構(gòu)域

通過 NCBI網(wǎng)站中CDD對(duì)TCTP蛋白功能域進(jìn)行預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，“SY04-3”和“NC95”蛋白都具有明顯的TCTP結(jié)構(gòu)域，該功能域位于1～163位氨基酸之間，是典型的TCTP家族蛋白(圖 12)。

2.6 煙草TCTP蛋白進(jìn)化分析

通過NCBI網(wǎng)站BLAST氨基酸序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，煙草“SY04-3”蛋白質(zhì)序列與“NC95”蛋白質(zhì)序列相似性達(dá)到99.40%。在NCBI上選取與TCTP蛋白質(zhì)序列相似度高的序列，并運(yùn)用MEGA 7.0軟件對(duì)煙草(“SY04-3”和“NC95”)、小粒咖啡(XP_027116009.1)、石榴(XP_031381536.1)、睡蓮(XP_031499048.1)、丹參(XP_042066744.1)、花生(XP_016174808.1)、茄子(XP_004230244.1)、芝麻(XP_011092087.1)、山茶(XP_028119307.1)、萵苣(XP_023747448.1)、苦瓜(XP_022135588.1)、柑橘(XP_006419560.1)、棗(XP_015875041.1)、辣椒(KAF3643198.1)、二穗短柄草(XP_003577266.1)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建(圖13)，結(jié)果表明，煙草與其他植物進(jìn)化樹分為4支，其中，煙草、辣椒、茄子、芝麻為一支；二穗短柄草、丹參為一支；小?？Х?、萵苣、石榴、山茶為一支；睡蓮、花生、苦瓜、柑橘、棗為一支。煙草與茄子和辣椒的親緣關(guān)系最近。

2.7 “NC95”與“SY04-3”不同時(shí)期未接種與接種TCTP基因的表達(dá)分析

“NC95”和“SY04-3”在不同時(shí)期未接種與接種TCTP的表達(dá)結(jié)果如圖 14。在12和72 h時(shí)，2個(gè)抗感病對(duì)照品種的相對(duì)表達(dá)量之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，而在24 h取樣時(shí)兩者之間有顯著差異(P<0.05)。在3個(gè)時(shí)期，接種處理的感病品種(“NC95”)相對(duì)表達(dá)量均高于抗病品種(“SY04-3”)，且2個(gè)處理之間均有顯著差異(P<0.05)。在12、24和72 h感病品種(“NC95”)接種的表達(dá)量比未接種分別提高了39.61%、47.69%和38.87%，而抗病品種(“SY04-3”)接種的表達(dá)量比未接種分別提高了11.87%、13.61%和7.48%，故感病品種(“NC95”)基因上調(diào)幅度大，抗病品種(“SY04-3”)基因上調(diào)幅度較小。

3 討論與結(jié)論

TCTP是一種高度保守的蛋白，廣泛存在于真核生物中，在哺乳動(dòng)物中TCTP與許多癌癥的發(fā)生相關(guān)，在植物中最初在紫花苜蓿中克隆出TCTP基因，研究發(fā)現(xiàn)TCTP在植物中具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)生殖，抗細(xì)胞凋亡，保護(hù)細(xì)胞抵抗各種逆境脅迫等作用[14-18]。在PVY生物脅迫下，TCTP作為一種抗凋亡蛋白參與超敏反應(yīng)(HR)，在煙草中TCTP基因的下調(diào)促進(jìn)HR，但TCTP的組成型表達(dá)卻降低HR，推測(cè)在植物的防御過程中TCTP通過調(diào)控HR進(jìn)行參與[19]。

該試驗(yàn)選用PVY高感品種“NC95”和高抗品種“SY04-3”為材料，克隆出的煙草TCTP基因片段為507 bp，在ORF內(nèi)存在7處堿基替換突變，蛋白質(zhì)序列存在1處突變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象產(chǎn)生改變。“SY04-3”與“NC95”的TCTP所編碼的蛋白質(zhì)分別含有13個(gè)磷酸化位點(diǎn)和14個(gè)磷酸化位點(diǎn)，都只有1個(gè)糖基化位點(diǎn)。煙草TCTP蛋白具有明顯的TCTP結(jié)構(gòu)域，屬于TCTP家族蛋白，與其他植物同源序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，氨基酸的相似性較高，可看出TCTP蛋白在植物中功能比較保守。TCTP基因是一種易使煙草感病基因[20]，通過觀察接種后不同時(shí)期TCTP表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，“SY04-3”與“NC95”在接種后體內(nèi)TCTP表達(dá)量上升，相對(duì)表達(dá)量都高于對(duì)照，但高抗品種“SY04-3”接種前后變化較小，高感品種“NC95”變化較大，這與Bruckner等[21]研究一致。相對(duì)表達(dá)量的變化表明了TCTP對(duì)PVY侵染植株起著一定的作用，但ORF內(nèi)的7處堿基突變?cè)斐傻鞍踪|(zhì)的三椎構(gòu)象發(fā)生改變是否會(huì)影響煙草對(duì)PVY的抗性還需要進(jìn)一步研究。