陳雪貞， 李兆雯， 吳 新， 蘆春斌*

（1.暨南大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州510632；2.珠海天禾食品有限公司，廣東 珠海519090）

芥辣類調(diào)味品是日式飲食常見的調(diào)味品，在食品領(lǐng)域有重要的市場地位。十字花科的一些植物含豐富的異硫氰酸酯，使其有特殊的辛辣刺鼻的風(fēng)味。常見的植物原料有山葵、辣根和芥末。山葵屬于十字花科山萮菜屬，與同屬十字花科的馬蘿卜屬的辣根和蕓苔屬的芥末，在味道和口感上非常相似，但由于山葵種植的環(huán)境和條件苛刻，使其價格也非常昂貴。而辣根味道與山葵非常相近，市面上多通過添加綠色色素到辣根中來代替山葵。芥菜的籽研磨成粉狀后（俗稱“芥末”），加入水后能散發(fā)出更重的刺激味道，也常用于替代山葵。但是山葵與辣根和芥末還是有一定的區(qū)別的，山葵中的5-甲硫基戊基異硫氰酸脂、6-甲硫基己基異硫氰酸脂、7-甲硫基庚基異硫氰酸脂使其具有獨特的香氣，而這3種成分在辣根和芥末中是沒有的。而且，芥末含有一種由二硫鍵連接的重鏈和輕鏈組成的蛋白質(zhì)，可引起過敏性皮膚病、呼吸道疾病哮喘等[1]，是一種常見的過敏原，芥末與花生及其制品、大豆及其制品等食品出現(xiàn)在歐盟14種食品過敏源名單中。所以，快速、準(zhǔn)確地鑒定出加工產(chǎn)品中的山葵、辣根、芥末成分對食品生產(chǎn)、質(zhì)控和食品安全有重要的意義。國內(nèi)外已有許多研究通過篩選特異引物檢測食品中的芥末過敏原。Palle-reisch等利用逆轉(zhuǎn)錄元件13G42-26引物檢測釀造香腸中的黑芥末和棕芥末，并通過雙重實時PCR技術(shù)進(jìn)行定量檢測[2-3]。在國內(nèi)，邵娟等利用芥末Sin A1管家基因設(shè)計特異性引物靈敏地檢測食品中芥末成分[4]。

由于食品在加熱、高壓、研磨等加工過程中，食品的成分會變得復(fù)雜且多變，傳統(tǒng)的檢測方法對食品進(jìn)行精確檢測的難度大大增加。谷秀蘭[5]證明用傳統(tǒng)的異硫氰酸烯丙酯檢測方法檢測芥末成分，其工序復(fù)雜，檢測數(shù)據(jù)重復(fù)性不好、不穩(wěn)定，并且該方法也不能將山葵、芥末、辣根這3種品種區(qū)分開來，也不能滿足市場上對其原材料溯源的要求。

植物中不同品種的分子標(biāo)記，無論在新鮮食品還是加工食品中，都能較為穩(wěn)定、精確、高效地追溯食品原料來源和驗證食品的真實性。在已有的報道中，許多研究利用黑芥子酶基因作為十字花科的特征基因來設(shè)計特異引物，從而檢測出芥辣類產(chǎn)品的成分。黃科等[6]用黑芥子酶基因證實了十字花科各屬之間的進(jìn)化關(guān)系，為往后研究提供參考。Hara等[7-8]設(shè)計了辣根的特異引物，擴(kuò)增出辣根中黑芥子酶基因ArMY1（登錄號AY822710），并且利用山葵的特異性引物通過巢式PCR擴(kuò)增山葵黑芥子酶基因WjMY1（登錄號AB194903）。然而，黑芥子酶基因同源性很高，設(shè)計特異引物難度大，難以設(shè)計黑芥子酶基因的種屬特異性引物對其進(jìn)行鑒定，且特異基因表達(dá)量低、檢測靈敏度不夠高、PCR檢測中可能存在交叉反應(yīng)等問題使檢測難度加大。而本研究中利用一段標(biāo)準(zhǔn)的、相對更短的DNA序列通用基因核糖體DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)Ⅱ（ITS2）作為標(biāo)記，對樣品中該標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，從而將山葵與其近緣物種辣根、芥末等成分快速、準(zhǔn)確、自動化地鑒定出來，這已是食品與藥物檢測和鑒定常用的方法。內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）序列是核糖體RNA基因中存在于結(jié)構(gòu)RNA的非功能性RNA序列，位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的5.8S rRNA基因的兩側(cè)，分別稱為ITS1和ITS2。被子植物的ITS長度比較穩(wěn)定，在600～700 bp，其中ITS1的長度為187～298 bp，ITS2的長度為187～252 bp[9]，ITS1和ITS2是中度保守區(qū)域。由于核糖體rDNA是高度重復(fù)的串聯(lián)序列，這些高度重復(fù)單位受到的選擇壓力非常小，同步進(jìn)化作用下，ITS在大部分真核生物中表現(xiàn)出較廣泛的序列多態(tài)性，種間差異比較明顯，所以可以利用ITS表現(xiàn)出的差異性對近親物種進(jìn)行鑒定[10-11]。Chen等[12]提出ITS2序列可以作為標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼鑒別藥用植物及其近緣物種。內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列的鑒定系統(tǒng)已在一些植物及中藥藥材的鑒定中廣泛應(yīng)用，但在食品檢測應(yīng)用中尤其是芥辣類調(diào)味品中ITS檢測尚無應(yīng)用。

作者利用ITS2標(biāo)記DNA技術(shù)對山葵及辣根、芥末進(jìn)行種屬特異性鑒定，為食品生產(chǎn)和產(chǎn)品質(zhì)量控制中特異性檢測山葵、辣根、芥末提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗樣品山葵 （Eutrema wasabi）、辣根（Armoracia rusticana）、白芥末（Sinapis alba）：珠海天禾食品有限公司提供（均是凍干研磨而成的干粉）。實驗樣品信息見表1。

表1 實驗樣品信息Table 1 Sample information

1.1.2 試劑PCR擴(kuò)增引物由生工生物工程有限公 司 合 成；ITS2引 物 序 列（ITS2_S2F：ATGCGATA CTTGGTGTGAAT；ITS2_S3R：GACGCTTCTCCAGACTACAAT）、2×Taq PCR MasterMix：生工生物工程有限公司產(chǎn)品；DNA提取試劑、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、乙二胺四乙酸（EDTA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、氯仿、乙醇、異丙醇、β-巰基乙醇：北京鼎國生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與檢測稱取樣品干粉100 mg，根據(jù)CTAB法中提取植物DNA方法提取基因組DNA，DNA用TE緩沖液溶解。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測序反應(yīng)體積10μL：2×Taq PCRMasterMix 5μL，上下游引物各1μL（10μmol/L），總DNA 1μL（100 ng/μL），ddH2O 2μL。引物ITS2擴(kuò)增程序：94℃變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，40個循環(huán)；72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程有限公司測序。

1.2.3 GenBank中獲取山葵、辣根和芥末序列信息從數(shù)據(jù)庫中搜索山葵、辣根和芥末3種植物ITS2序列的信息（見表2）。用MEGA7.0進(jìn)行序列對比，計算遺傳距離，構(gòu)建鄰接樹（Neighbor-joining tree，NJ tree），設(shè)置Bootstrap（1 000次重復(fù)）檢驗各分支支持率。

表2 數(shù)據(jù)庫中獲取的山葵、辣根和芥末3種植物ITS2序列信息Table 2 Information of ITS2 sequence of three plants of Eutrema wasabi， Armoracia rusticana and mustard in the database

1.3 數(shù)據(jù)分析

3種樣品的PCR產(chǎn)物測序后獲得測序峰圖文件，使用MEGA7.0計算種間遺傳距離，用最大似然法（Maxinmum likelihood，ML）構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取與PCR擴(kuò)增檢測

用CTAB法提取山葵、辣根、白芥末3種樣品的基因組DNA，經(jīng)Nanodrop紫外分光光度計檢測其濃度和純度。用通用引物ITS2_S2分別對3種樣品提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測，3種DNA樣品均擴(kuò)增出198 bp特異性DNA條帶。PCR產(chǎn)物在廣州生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

2.2 山葵與辣根、白芥末種間序列信息及變異位點分析

經(jīng)MEGA7.0分析比對后，山葵、辣根及白芥末的ITS2序列比對后種間序列長度、變異位點和遺傳距離等信息統(tǒng)計結(jié)果見表3。其中，白芥末與辣根之間的K2P遺傳距離最大，為0.171；山葵與白芥末之間的K2P遺傳距離最小，為0.088；辣根與山葵的K2P遺傳距離為0.150。所有樣品比對后K2P遺傳距離都較遠(yuǎn)，且大于0.01，初步推斷利用ITS2序列能將山葵、辣根和白芥末區(qū)分開來。山葵與辣根、白芥末ITS2序列比對后序列長度有198 bp，平均GC堿基的含量有6.99%。3種樣品ITS2序列比對后變異位點有36個，其中山葵與白芥末比對后變異位點有18個，山葵與辣根之間變異位點有26個，白芥末與辣根比對后變異位點有29個，具體變異位點見表4。

表3 山葵、辣根及白芥末ITS2序列比對信息Table 3 ITS2 sequence information of Eutrema wasabi，Armoracia rusticana and white mustard

表4 山葵、辣根及白芥末比對后變異位點Table 4 Variation sites of Eutrema wasabi、Armoracia rusticana and white mustard

2.3 最大似然法（ML）構(gòu)建進(jìn)化樹鑒別山葵、辣根及白芥末

通過MEGA7.0利用最大似然法（ML）分析山葵、辣根、白芥末3種樣品，分析得山葵與白芥末和辣根之間K2P遺傳距離分別為0.090和0.160，白芥末與辣根之間的K2P遺傳距離為0.170。利用最大似然法（ML）構(gòu)建的進(jìn)化樹（見圖1），辣根與白芥末之間的遺傳距離最遠(yuǎn)，而白芥末與山葵之間的遺傳距離最近。

2.4 用ITS2序列構(gòu)建山葵及其近緣物種的鄰接樹（NJ tree）

從數(shù)據(jù)庫GenBank中獲取山葵、西北山崳菜、白芥末、棕芥末、黑芥末、辣根的ITS2序列。利用MEGA7.0構(gòu)建鄰接樹（NJtree）（見圖2），山葵、西北山崳菜以99%的支持率聚為一大支，所以，山葵與其他物種用ITS2序列可明顯區(qū)別開。而棕芥末與白芥末、黑芥末以72%的支持率聚為一大支，白芥末和棕芥末以75%的支持率聚為一支，支持率均大于70%。因此用ITS2序列可以將3種芥末與其他物種區(qū)分，且可以將黑芥末與白芥末、棕芥末區(qū)分開。分析6條ITS2序列的K2P遺傳距離（見表5），6條序列之間K2P遺傳距離在0.030～0.105，均大于0.01。其中山葵與西北山崳菜之間的遺傳距離最近，為0.030；棕芥末與辣根之間的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.105；3種芥末之間的K2P遺傳距離相近，在0.045～0.049；而山崳菜屬的山葵和西北山崳菜與蕓苔屬的3種芥末相比，K2P遺傳距離在0.064～0.077；山崳菜屬的山葵和西北山崳菜與辣根相比，K2P遺傳距離在0.093～0.097；蕓苔屬的3種芥末與辣根相比，K2P遺傳距離在0.080～0.105。所以山崳菜屬與蕓苔屬K2P遺傳距離最近，蕓苔屬與辣根之間K2P遺傳距離最遠(yuǎn)。

表5 山葵及其近緣物種ITS2序列K2P遺傳距離分析Table 5 Genetic distance analysis of ITS2 sequence of Eutrema wasabi and its related species

2.5 討論

食品成分檢測因食品基質(zhì)的極其復(fù)雜及不同程度的加工處理會使檢測難度增加。利用動植物特定成分的基因特異性進(jìn)行分子檢測，尤其是進(jìn)行有效成分和過敏源基因檢測，在食品安全評估和測試中的應(yīng)用尤為廣泛。DNA標(biāo)記識別基因組核苷酸序列的變異，可以突出物種間和物種內(nèi)部的多樣性。例如，線粒體DNA標(biāo)記CO1被證明對食品中動物物種的鑒定是有效的，該標(biāo)記基因可用于鑒別牛品種和市面上標(biāo)記錯誤的漁業(yè)產(chǎn)品[13-14]。內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）是相近的種群中有著高度可變性的非功能片段，在區(qū)別或鑒定同屬物種關(guān)系中具有重要作用，這種技術(shù)不僅對真菌的鑒別成功率很高，還能通過分析ITS區(qū)域DNA序列鑒別引起食物中毒的蘑菇和鑒定不同產(chǎn)地的海藻干燥產(chǎn)品等植物材料[15-16]。而Amaia等還基于ITS擴(kuò)增利用SYBR Green I和TaqMan兩種實時定量PCR檢測方法檢測炭疽曲霉的含量[17]。

如今市面上許多芥辣類調(diào)味品用山葵為原材料，同時也有用近親物種辣根和芥末摻入或代替，雖然辣根和芥末的風(fēng)味與山葵相似，但山葵的價格與辣根、芥末相比還是不同的，而且芥末的鑒別對芥末過敏的人群來說也是非常重要的。已有許多研究利用特異引物檢測食品中山葵和辣根、芥末成分，但因引物設(shè)計難度高和靈敏度低等原因使檢測難度加大。DNA條形碼是一種利用基因組中標(biāo)準(zhǔn)和特定位置的短DNA序列來表征生物物種的技術(shù)手段。有研究人員就提出了兩個葉綠體DNA（cpDNA），分別是rbcl和matk，作為植物DNA條形碼[18]。Alaklabi等利用葉綠體基因matk和質(zhì)體基因rbcl對瀕危的植物蘆薈特有假單胞菌進(jìn)行分子鑒定[19]。Fang等通過對溺水動物的肺部浮游生物菌落的rbcl基因進(jìn)行焦磷酸測序來輔助法醫(yī)對溺水現(xiàn)場進(jìn)行推斷[20]。但是，由于cpDNA在密切相關(guān)的分類群之間存在基因流動以及不能對系統(tǒng)發(fā)育精準(zhǔn)分辨等潛在的問題，使這些序列進(jìn)化速率低，限制了cpDNA在屬或物種水平的分配能力，而18S～25S核糖體DNA（ITS）作為新的替代方法發(fā)展起來。Hao等[21]同時利用核ITS和cpDNA數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，證明中國四川省橫斷山脈的一種新種——大葉菊與云南屬植物有明顯區(qū)別。另外，目前大多數(shù)研究者認(rèn)為ITS2比ITS1、全長ITS更有利于進(jìn)行植物鑒定[22]。由于ITS1變化較大，無法保證保守的序列。Hoggard等[23]比較利用ITS1、小亞基rRNA 18S（SSU）、大亞基rRNA 26S（LSU）和ITS2鑒定人類菌群，發(fā)現(xiàn)使用ITS1、SSU或LSU標(biāo)記無法識別由ITS2標(biāo)記識別的關(guān)鍵分類單元。而全長ITS序列比ITS2長很多，比ITS2測序所需要的成本高，且樣品DNA降解也會影響全長ITS測序的精確性。另外ITS2有二級結(jié)構(gòu)，比ITS序列保守性更高。因此，本研究中基于ITS2序列對芥辣類調(diào)味品中的山葵及辣根、芥末進(jìn)行種屬鑒定。

3 結(jié) 語

基于ITS2序列的物種鑒定和聚類分析結(jié)果可知，山葵與白芥末之間的K2P遺傳距離最小，為0.088；白芥末與辣根之間的K2P遺傳距離最大，為0.171。山葵與白芥末、辣根對比后變異位點有36個。K2P遺傳距離分析可以看出山葵、辣根和白芥末的彼此遺傳距離較遠(yuǎn)，推測3種植物各歸為一支，能用ITS2序列區(qū)分開來。從數(shù)據(jù)庫獲得山葵及其近緣物種ITS2序列，用NJ法進(jìn)行系統(tǒng)分析表明，山葵和西北山崳菜以99%的支持率聚為一大支，白芥末、黑芥末和棕芥末聚為一大支。山崳菜屬的山葵和西北山崳菜與蕓苔屬的3種芥末K2P遺傳距離在0.064～0.077，而蕓苔屬的3種芥末與辣根K2P遺傳距離在0.080～0.105，K2P遺傳距離都較遠(yuǎn)，且大于0.01。這些結(jié)果表明，通過利用ITS2序列進(jìn)行DNA擴(kuò)增和測序分析能明顯將山葵及其近緣物種鑒定出來。利用該方法可以鑒別芥辣類調(diào)味品中復(fù)雜成分，鑒定芥辣類產(chǎn)品中是否含有山葵、辣根或芥末。另外，還可以將該方法應(yīng)用于實時定量PCR，從而同時檢測出含有山葵、辣根、芥末等成分的樣品中各成分的含量，為芥辣類相關(guān)食品檢測提供一種更高效、靈敏的檢測方法。